CN1877322B - 一种益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，该方法采用蒸发光散射检测器，灵敏度高、重现性良好，适用于益母草药材、益母草制剂及含益母草的保健食品的质量控制。

Description

一种益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，更具体是涉及一种用于测定益母草药材、益母草制剂及含益母草的保健食品中水苏碱含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测方法。

背景技术

益母草是著名的妇科中药材，以益母草单方或复方可制备成膏剂、口服液、颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂等剂型的中成药，益母草也是药食两用的中药，可以作为保健食品的原料。对益母草药材、益母草制剂及含益母草的保健食品进行质量控制时，检测其中的指标性成分水苏碱是重要的手段。

水苏碱是中药益母草的主要指标性成分，目前主要采用的测定益母草中水苏碱含量的方法包括比色法，薄层扫描法、柱前衍生化法等，但这些方法操作复杂，结果重现性差。近年来文献相继报道了用高效液相色谱法分析益母草药材或药品中水苏碱的含量(宋晶萍等，广西药学，2002，24(8)：1289-1290；姜舜尧，药物分析杂志，2001，21(4)：243-247；秦永平，华西药学杂志，2003，18(4)：288～290)。现有的液相色谱分析方法均为高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)，选择215nm为检测波长，响应值低，灵敏度差。另外由于水苏碱的紫外吸收光谱上，只有末端吸收，而靠近紫外末端吸收，流动相及杂质干扰较大，因此定量困难。同时由于水苏碱属于强极性的酸碱两性小分子化合物，一般的反相色谱柱上分离效果不佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中操作复杂，重现性差，灵敏度低等缺陷，提供一种方便、快捷、准确的高效液相色谱-蒸发光散射检测方法来测定益母草中水苏碱的含量，该方法适用于益母草药材、益母草制剂及含益母草的保健食品的质量控制。

本发明方法的特点在于采用蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器是一种质量型检测器，适合非挥发性成分的检测，不受紫外吸收光谱性质的影响，本发明方法以外标法定量，采用氰基柱为固定相，以甲醇或乙腈与水的混合液或甲醇、乙腈与水的混合液作为流动相进行等度分离，根据样品的实际情况，可选用硅藻土拌样甲醇回流提取法、离子交换纯化法或乙醇回流提取法对样品进行处理。对于含有较多电解质、氨基酸、糖等辅剂成分的样品(如含有较多泡腾剂(碳酸氢钠和枸橼酸)的益母草泡腾片)可采用硅藻土拌样甲醇回流提取法或离子交换纯化法进行处理分析，其中优选离子交换纯化法；其它样品(如益母草药材(饮片))则可以直接用乙醇回流提取法制备供试样品用于进样分析。

本发明方法包括以下步骤：

一、样品处理：

1、硅藻土拌样甲醇回流提取法：

将1.5克样品溶于3-4倍量的水中，加入3-4倍量的硅藻土(化学纯)混匀，80℃烘干后加入50～100ml甲醇回流提取2小时，过滤，蒸干滤液，残渣用流动相溶解定容至25ml，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样。

2、离子交换纯化法是利用水苏碱的季铵碱性质，用离子交换柱进行吸附，然后洗脱，回收洗脱溶剂，残渣用流动相溶解定容，作为供试溶液。其操作方法为：

采用市售的强酸性阳离子交换树脂(例如可采用001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂)填充于玻璃柱中，成为强酸性阳离子交换树脂柱，其内径为1～2cm，柱高为15～20cm。取供试样品1.5克，用3-4倍量水溶解，溶液用盐酸调节pH值至1～2后过柱，然后以纯水淋洗柱子直至洗脱液呈无色，弃除洗脱液，再以适量2mol/l氨溶液洗脱柱子，收集洗脱液，蒸干，残渣用流动相超声溶解并定容至25ml，用0.45μm滤膜过滤后进样。

上述方法中，强酸性阳离子交换树脂柱内径优选1.5cm，柱高优选18cm。优选用6mol/L盐酸调节pH，氨溶液的洗脱用量优选200ml。

3、乙醇回流提取法：

粉碎样品，取2克样品，用50ml的95％乙醇回流2h，滤过，滤液蒸干，残渣用流动相溶解并定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后进样。

二、液相色谱分离

色谱条件为：

1、色谱柱：氰基柱(250×4.6mm，5μm等)；

2、流动相：甲醇∶水(v/v)＝98～70％∶2～30％或乙腈∶水(v/v)＝98～70％∶2～30％或甲醇∶乙腈∶水(v/v)＝30～50％∶40～60％∶5～30％，其中优选甲醇∶乙腈∶水(v/v)＝30～50％∶40～60％∶5～30％；采用等度洗脱。

3、流速：0.5～1.5ml/min；

4、柱温：15℃～35℃；

5、蒸发光散射检测器的漂移管温度为80℃，以洁净空气作为雾化气，流速为2.0L/min。

三、浓度计算方法和检测限：

按外标法以峰面积的常用对数值与进样量(μg)的常用对数值作线性回归计算样品中水苏碱的含量。

本发明方法的检测限为12ng(信噪比≥3)；线性范围为1.175～10.575μg，相关系数r达到0.9998以上；批内精密度达到0.61％；加样回收率达到96％以上。

有益效果：

1、本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定益母草中水苏碱的含量，灵敏度高、重现性良好，适用于益母草药材、益母草制剂及含益母草的保健食品的质量控制。

2、本发明方法操作简捷，样品从前处理至色谱分析可在2小时内完成。

附图说明

图1为盐酸水苏碱对照品的液相色谱图。

图2为批号为031208的益母草泡腾片样品中水苏碱含量测定的液相色谱图。

图3为批号为030601益母草饮片样品中水苏碱含量测定的液相色谱图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1益母草泡腾片中水苏碱的含量测定

1材料

1.1仪器和材料

Waters

2690全自动进样高效液相色谱系统；Water

515HPLC泵；AlltechELSD2000蒸发光散射检测器；001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径1.5cm，柱高18cm)。

1.2药品与试剂

乙腈、甲醇为色谱纯(Merck公司)；水为双蒸水。

盐酸水苏碱对照品购自中国药品生物制品检定所，批号110712-200306。

供试样品为山西振东金晶药业有限公司生产的益母草泡腾片(1.3g/片)，实验测定六个批次的样品。

1.3对照品储备液

盐酸水苏碱对照品23.5mg，置于20ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成含量为1.175mg/ml的甲醇溶液，即得对照品储备液，使用时用甲醇稀释成58.75、117.5，235，352.5，528.75μg/ml的工作溶液。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：KromasilKR60-5CN(250×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇∶乙腈∶水(v/v)＝30∶60％∶10％

流速：1ml/min

进样量：20μl

柱温：室温

蒸发光散射检测器的漂移管温度为80℃，雾化气流速为2.0L/min。

2.2样品前处理方法

取益母草泡腾片样品1.5g，加水5ml溶解，搅匀，用6mol/L盐酸调pH 1～2后上强酸性阳离子交换树脂柱，以纯水淋洗柱子直至洗脱液呈无色，弃去水液，再以2mol/l氨溶液200ml洗脱柱子，收集洗脱液，蒸干，残渣用流动相超声溶解并转移至25ml量瓶中，用流动相定容，用0.45μm滤膜过滤，制成供试样品溶液。

2.3空白试验

按制剂工艺法制备无益母草成分的空白制剂。精密称取空白制剂粉末1.0克，按照2.2所述的样品前处理方法得到空白样品溶液，进样在2.1所述的色谱条件下进行测定。

2.4线性范围

用甲醇将对照品贮备液分别稀释成58.75μg/ml、117.5μg/ml、235μg/ml、352.5μg/ml、528.75μg/ml的对照品溶液，各取20μl在测定条件下进样，对照品的绝对进样量分别为1.175μg、2.35μg、4.7μg、7.05μg、10.575μg。在2.1所述的色谱条件下测定。以峰面积的常用对数值为纵坐标(Y)，盐酸水苏碱进样量的常用对数值为横坐标(X)，进行线性回归，得到回归方程：y＝1.358229x-5.52088，r＝0.999809

2.5精密度

取浓度为235μg/ml的盐酸水苏碱对照品溶液，每次进样20μl，连续进样5次，记录峰面积，计算精密度。

2.6稳定性

取浓度为235μg/ml的对照品溶液，每次进样20μl，分别在0h、2h、4h、6h、12h进样，比较测定结果的稳定性。

2.7重现性

取批号为031208的泡腾片样品进行5次平行测定(即n＝5)，计算相对标准偏差(RSD％)，比较重现性。

2.8加样回收率

精密称取批号为031208的泡腾片样品各0.8g共5份，每份分别加入盐酸水苏碱对照液(1.2304mg/ml)5ml，按2.2所述方法进行样品前处理，在2.1所述的色谱条件下测定，计算盐酸水苏碱的回收率。

3结果

对照品和供试品中盐酸水苏碱峰均能达基线分离，峰型较好，理论板数达5000以上，六个批次的益母草泡腾片样品含量测定结果分别为(mg/片，以盐酸水苏碱计)：11.14、10.92、10.82、14.16、11.88和11.70。对照品及批号为031208的泡腾片样品的色谱图见图1和图2。

实验结果表明盐酸水苏碱的检测限为12ng，空白制剂对益母草泡腾片中盐酸水苏碱的分析无干扰；盐酸水苏碱的线性范围为1.175～10.575μg；批内精密度为0.61％；水苏碱在12小时内稳定，RSD为1.03％；本测定方法具有良好重现性，RSD为2.80％；盐酸水苏碱的加样回收率为96.66％，RSD＝1.84％。

实施例2益母草饮片中水苏碱含量的测定

供试样品为上海养和堂中药饮片有限公司生产的益母草饮片(产地安徽，1Kg/袋)，实验测定两个批次(030601，040102)的样品。其他药品、试剂和所用的仪器材料同实施例1。

对照品工作溶液：精密称取同实施1方法配制的盐酸水苏碱对照品储备液，用甲醇稀释成125μg/ml和250μg/ml的工作溶液。

样品处理：将益母草饮片粉碎，过三号筛，取2克，精密称定，置于圆底烧瓶中，加95％乙醇50ml回流2h，滤过，滤液蒸干，以流动相溶解并定容至25ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，制成供试样品溶液。

样品测定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，按照实施例1所述的色谱条件进行测定，以对照品进样量(μg)的常用对数值为横坐标，以对照品峰面积常用对数值为纵坐标建立直线方程，将供试品峰面积常用对数值代入方程，计算得到样品中水苏碱的含量。

检测结果：经测定二个批次的益母草饮片中水苏碱含量分别为4.37mg/g和5.00mg/g(以盐酸水苏碱计)。批号为030601饮片样品的色谱图见图3。

Claims (4)

1.一种益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用蒸发光散射检测器，以外标法定量，采用氰基柱为固定相，以甲醇或乙腈与水的混合液或甲醇、乙腈与水的混合液作为流动相进行等度分离，样品预处理采用采用硅藻土拌样甲醇回流提取法或离子交换纯化法或乙醇回流提取法。

2.根据权利要求1所述的益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于流动相为甲醇∶水(v/v)＝98～70％∶2～30％或乙腈∶水(v/v)＝98～70％∶2～30％或甲醇∶乙腈∶水(v/v)＝30～50％∶40～60％∶5～30％。

3.根据权利要求2所述的益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于流动相为甲醇∶乙腈∶水(v/v)＝30～50％∶40～60％∶5～30％。

4.根据权利要求1所述的益母草中水苏碱含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于蒸发光散射检测器的漂移管温度为80℃，以洁净空气作为雾化气，流速为2.0L/min。

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