CN108490084A - 一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法 - Google Patents

一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及一种抗病毒颗粒中告依春含量测量方法。本发明在现有质量标准的基础上，通过HPLC法测定抗病毒颗粒中告依春的含量，建立了抗病毒颗粒中R,S)‑告依春的含量测量方法填补了该中药组合物中板蓝根药材测定项的空白，该方法简便可行、准确快捷、稳定性好，可用于抗病毒颗粒的质量控制。

Description

一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种抗病毒颗粒中告依春含量测量方法。
背景技术
抗病毒颗粒为复方制剂，主要由板蓝根、连翘、石膏、知母、芦根、地黄、广藿香、石菖蒲和郁金组成，具有清热祛湿、凉血解毒之功效，用于风热感冒、流感，疗效显著。复方中成药成分复杂，建立较为全面的产品质量评价方法，提高质量标准，是保证产品疗效的主要方法之一。目前中成药含量测定方法主要有：1)化学定量分析，主要有滴定分析法和重量分析法，适用于单味制剂的含量测定或者是处方中的无机成分；2)紫外-可见分光光度法，主要有双波长分光光度法、薄层-分光光度法和柱层析-分光光度法，适用于微量和痕量组分分析；3)气相色谱法，具有高效能、高选择性、高灵敏度和速度快的优势，但由于受样品蒸气压的限制，目前只能测定中成药中含挥发性成分的样品；4)薄层扫描法，该方法系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点或对经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品分析的鉴别，杂质检查和含量测定；5)高效液相色谱法，具有高效、高速、高灵敏度、适用范围广，流动相选择范围宽的优势，对分析氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、留体、类脂等挥发性低，热稳定性差，分子量大的高分子化合物及离子型化合物特别有利。
中国专利CN 105675751 A公开了一种抗病毒口服液的质量检测方法。其通过HPLC方法对所述口服液中(R,S)-告依春、芒果苷、连翘酯苷I、连翘酯苷H、连翘酯苷A、松脂酚-4-O-葡萄糖苷和连翘苷七个活性成分进行含量测定；其中供试品溶液的制备方法为：精密量取本品25ml，用饱和正丁醇萃取4次，每次25ml，合并正丁醇层，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，置10ml量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，即得。周艳萍等(周燕萍,范平,刘瑜,陆瑜.UPLC-MS/MS法同时测定十味板蓝根颗粒中4种成分的含量[J].中医药导报,2016,22(20):40-41+47.)研究了采用超高效液相串联质谱法同时测定十味板蓝根颗粒中尿苷、腺苷、表告依春、靛玉红含量的方法，其中供试品溶液的制备方法为：取十味板蓝根颗粒，研磨均匀，精密称定0.5g，置于50ml容量瓶中，用90％甲醇溶解并定容，超声处理30min(功率：45kHz)，摇匀，滤过。精密吸取滤液1mL，置于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。中国专利CN 101703552 B公开了一种复方板蓝根口服液中表告依春的含量测定方法，采用高效液相色谱法对表告依春的含量进行测定；其中供试品溶液的制备方法为：精密量取本品，加水稀释5-50倍，用0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。
虽然目前对于中成药中告依春的含量的检测有较多的研究，但大多是对于抗病毒口服液中告依春含量的研究，对于抗病毒颗粒中告依春含量的检测研究较少，而且这些研究大都集中在对于检测过程中液相色谱的流动相、柱温、洗脱流速、溶剂的用量和浓度等色谱条件的调整优化，而对于检测的其他步骤研究较少，尤其是样品的制备过程即样品的预处理研究较少，现有技术对于抗病毒颗粒大都采用简单的醇溶超声，对于抗病毒口服液最简单的是加水稀释定容，但是复方中成药成分复杂，通常一个样品中包含了几十甚至几百种组分，而各组分之间的含量差别很大，其他组分可能对目标组分的检测造成极大的干扰；甚至会导致仪器故障、色谱柱损伤，色谱峰变宽、分不开、杂峰多等。因此，中成药有效成分的分离提取繁琐，一直是药品检验的难点。而常规的供试品制备方法得到的粗提液组成复杂，往往目标物质含量低，干扰大，对分析方法的选择有非常高的要求；本申请针对上述问题，提供一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法，该方法中供试品溶液干扰物少，能增加检测器的灵敏度，保护色谱柱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法。该方法供试品溶液干扰物少，能增加检测器的灵敏度，保护色谱柱，简便可行、准确快捷、稳定性好，可用于抗病毒颗粒的质量控制指标。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：选自甲醇-0.015％磷酸、0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：35-40℃；流速：0.5-0.6mL/min；
(2)供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨，置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.1-0.5mL，即为提取液；
④将③中提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过滤，取滤液，即得供试品溶液；
(3)对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3-20μg的溶液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液10-15μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
进一步，所述的抗病毒颗粒，采用板蓝根、连翘、石膏、知母、芦根、地黄、广藿香、石菖蒲和郁金制成。本发明在现有质量标准的基础上，通过HPLC法测定抗病毒颗粒中告依春的含量，建立了抗病毒颗粒中(R,S)-告依春的含量测量方法填补了该中药组合物中板蓝根药材测定项的空白。
色谱条件的理想状态是能在较短的时间内获得较高的分离度，并且具有适当的柱容量。选择色谱柱时要考虑被分析物质的理化性质、将采用的分离模式以及被分离物与固定相表面的相互作用；流动相直接影响组分的分离度，因此选择的溶剂对于待测样品必须具有合适的极性和良好的选择性，要与检测器匹配，并且具有高纯度、化学稳定性好、低粘度的特性；检测波长应当对于主成分有较大的吸收，大于流动相末端吸收20nm以上，能检出尽量多的杂质；选择柱温时要考虑检测器的性质、固定液配比、载气流速和样品的沸点等因素。
进一步，步骤(1)中，所述色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为(8-9):(92-91)的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。
或者，步骤(1)中，所述色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为(75-85):(25-15)的0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：40℃；流速：0.5mL/min。
复方中成药成分复杂，通常一个样品中包含了几十甚至几百种组分，而各组分之间的含量差别很大，其他组分对目标组分的检测造成了极大的干扰。因此，中成药有效成分的分离提取非常重要，关系到测定结果的稳定可靠性和仪器的使用寿命。本发明针对被测量物质的理化性质，长期深入的研究，得到一种针对抗病毒颗粒中告依春含量测量的供试品溶液的制备方法，该方法简单、快速、高效，不采用有毒有机溶剂，集提取、净化、浓缩和预分离为一体。
进一步，步骤(2)中，所述供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80-100目筛，精密称定3-5g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度110-120℃，萃取时间30-40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比1:(15-20)，浸泡时间10-15min，提取时间2-4min，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.1-0.5mL，即为提取液；
④将③中提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液。
更进一步，步骤(2)中，所述供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液。
进一步地，所述②中提取剂为水或乙醇，微波功率为300-500W；所述③中，滤液过柱前采用甲醇溶液活化固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴。
进一步，步骤(3)中，所述对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3-10μg的溶液，即得。
进一步，步骤(4)中，所述测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为9:91的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。
(2)供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
(3)对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
上述检测步骤，色谱参数、试剂种类、试剂用量，尤其是供试品溶液的制备方法，都是申请人经过长期复杂的实验得到的，是上述众多因素的协同作用共同支撑起本发明的有益效果。
本发明提供的一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法。具有简便可行、准确快捷、稳定性好的优势，可用于抗病毒颗粒的质量控制指标。尤其是样品的预处理方法，对有效成分提取完整，不伤柱子。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
主要检验仪器：Agilent1260高效液相色谱仪(含G1311B四元泵、G1329B自动控温自动进样器、G4212BDAD检测器、Chemstation色谱数据处理工作站)、CPA225D电子天平(德国赛多利斯)、ASE200加速溶剂萃取仪(美国戴安公司)、DirectQ3System纯水仪(美国密理博公司)、CEM-Mars5微波萃取仪(美国CEM公司)；
试剂：甲醇、乙酸为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯；
样品：抗病毒颗粒样品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒。
阴性对照样品：不含板蓝根阴性对照样品颗粒由四川光大制药有限公司提供。
色谱柱：Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6mm×250mm)；固相萃取小柱：Poly-SeryMCX混合型强阳离子交换SPE小柱。
实施例1
1.1色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为8:92的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。在此色谱条件下，对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。
1.2供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为水，微波功率400W；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
1.3对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
1.4不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
①取阴性对照样品颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为水，微波功率400W；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
2.1标准曲线的绘制
取(R,S)-告依春对照品适量，精密称定，置于20mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含91.3408μg的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液稀释得到浓度分别为0.1784、0.7136、2.8544、11.4176、45.6704μg/mL系列对照品溶液，分别吸取该系列对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中进行测定，每份连续进样3次，取平均值进行计算，以峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准工作曲线，得到线性方程Y＝6840.5X+209.1，R＝0.9999。表明告依春在0.1784～45.6704μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。
2.2稳定性试验
精密吸取1.2中制备好的供试品溶液10μL，分别于0、2、4、8、16、24h进样，测得告依春峰面积相对标准偏差RSD为0.42％(n＝6)。表明样品溶液在24h内稳定。
2.3精密度试验
精密吸取1.3中制备好的对照品溶液10μL，连续进样6次。测得告依春峰面积相对标准偏差RSD＝0.11％(n＝6)。表明本法精密度良好。
2.4重复性试验
取抗病毒颗粒6份，按照供试品溶液的制备方法制备，精密吸取制备好的供试品溶液各10μL，进样，结果表明，告依春平均含量为0.0253mg/g，相对标准偏差RSD＝0.35％，说明本法重复性良好。
2.5回收率实验
精密称取已知告依春含量的同一批号的样品9份，每份1.5g，精密称定，每三份为一组，三组分别按已知含量的50％、100％和150％加入(R,S)-告依春对照品，按1.2中供试品溶液的制备方法制备，进行加样回收实验，计算回收率。结果表明平均回收率为100.1％，RSD为0.72％，具有良好的回收率。
3.1样品含量测定
测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2216mg/袋。
对比例1
1、色谱条件、对照品溶液的制备参照实施例1中1.1和1.3
2、供试品溶液的制备：
取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
3、不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
4、测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品的色谱峰良好，样品的色谱峰杂峰较多，待测样品提取不完全，很大一部分被过滤除去，测得的样品含量偏低。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.1898mg/袋。
对比例2
1、色谱条件、对照品溶液的制备参照实施例1中1.1和1.3
2、供试品溶液的制备：
取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；滤液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
3、不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
4、测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品的色谱峰良，样品色谱峰有些微拖尾现象。待测样品提取不完全，很大一部分被过滤除去，测得的样品含量偏低。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2034mg/袋。
对比例3
1、色谱条件、对照品溶液的制备参照实施例1中1.1和1.3
2、供试品溶液的制备：
取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g加提取剂，料液比(料的单位为g，是精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；其中，提取剂为水，微波功率400W；
3、不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
4、测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品的色谱峰良好，样品色谱峰分离度低，待测样品提取不完全，很大一部分被过滤除去，测得的样品含量偏低。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.1999mg/袋。
对比例4
1、色谱条件、对照品溶液的制备参照实施例1中1.1和1.3
2、供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g加水溶解并定容至50mL；
②采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，滤液过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
③将②中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
3、不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
4、测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰，但是滤液过固相小柱时可能是因为有效成分溶解不完全不能被很好的与其他物质分开，样品含量偏低。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2055mg/袋。
对比例5
取抗病毒颗粒，按照中国专利CN103792301A公开的一种抗病毒颗粒中告依春含量测量方法，即：(1)抗病毒颗粒供试品溶液的制备：取抗病毒颗粒，研细，精密称定4g，置于25mL量瓶中，加水20mL溶解，超声提取，所述超声提取所用的超声清洗器功率为400W，频率为80kH，提取时间为30分钟，加水至刻度，摇匀，离心，取上清液，过微孔滤膜(0.45μm)，取滤液，即得。
(2)对照品溶液的制备：取(R,S)-告依春对照品适量，精密称定，加水制成1ml含4μg的溶液，即得。
(3)色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶柱(250mm×4.6mm，5μm)为填充剂，以245nm作为检测波长，柱温为35℃，流动相流速为1.0mL/分钟，流动相为甲醇-0.02％磷酸，甲醇和0.02％磷酸的混合比例为10:90(v/v)。
抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2001mg/袋。
实施例2
1.1色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：比例为9:91(v/v)的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。在此色谱条件下，对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。
1.2供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过100目筛，精密称定5g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度110℃，萃取时间30min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:15，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为乙醇，微波功率500w；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
1.3对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
1.4不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
1.5测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2200mg/袋。
实施例3
1.1色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：比例为75:25(v/v)的0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：40℃；流速：0.5mL/min。在此色谱条件下，对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。
1.2供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定4g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间35min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为乙醇，微波功率400w；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.1mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
1.3对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
1.4不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
1.5测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2204mg/袋。
实施例4
1.1色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：比例为85:15(v/v)的0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：40℃；流速：0.5mL/min。在此色谱条件下，对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。
1.2供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过100目筛，精密称定5g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:20，浸泡时间10min，提取时间4min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为水，微波功率500w；
③采用20mL甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.5mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
1.3对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
1.4不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
1.5测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2218mg/袋。
实施例5
1.1色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：比例为8:92(v/v)的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。在此色谱条件下，对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。
1.2供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨过100目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度110℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比(料的单位为g，是步骤①中精密称定的研磨后的抗病毒颗粒；液的单位为mL，是提取剂的体积；)1:15，浸泡时间10min，提取时间4min，微波提取两次，过滤得滤液；其中，提取剂为水，微波功率300w；
③采用20mL体积比为4:96的氨水-甲醇溶液活化固相萃取小柱，合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴；用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.4mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液；
1.3对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3μg的溶液，即得；
1.4不含板蓝根阴性对照样品溶液制备
取阴性对照样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。
1.5测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
样品平行测定3次，取平均值。对照品及样品的色谱峰良好，无板蓝根阴性对照对测定无干扰。按外标法以峰面积计算供试品溶液中告依春含量；抗病毒颗粒供试品由四川光大制药有限公司提供的9g/袋含糖型抗病毒颗粒，检测结果为0.2199mg/袋。
本发明的检测方法，明显优于对比例，说明本发明检测方法各个环节衔接紧密，搭配合理，缺一不可，这种特定的组合构成的检测方法，产生了明显的协同增效作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种抗病毒颗粒中告依春的含量测量方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：选自甲醇-0.015％磷酸、0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：35-40℃；流速：0.5-0.6mL/min；
(2)供试品溶液的制备：
①取抗病毒颗粒，研磨，置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.1-0.5mL，即为提取液；
④将③中提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过滤，取滤液，即得供试品溶液；
(3)对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3-20μg的溶液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液10-15μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
2.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的抗病毒颗粒，采用板蓝根、连翘、石膏、知母、芦根、地黄、广藿香、石菖蒲和郁金制成。
3.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，步骤(1)中，所述色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为(8-9):(92-91)的甲醇-0.015％磷酸；检测波长：245nm；柱温：35℃；流速：0.6mL/min。
4.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，步骤(1)中，所述色谱条件：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱，流动相：体积比为(75-85):(25-15)的0.2％乙酸水溶液-甲醇；检测波长：245nm；柱温：40℃；流速：0.5mL/min。
5.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，步骤(2)中，所述供试品溶液的制备：①取抗病毒颗粒，研磨过80-100目筛，精密称定3-5g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度110-120℃，萃取时间30-40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比1:(15-20)，浸泡时间10-15min，提取时间2-4min，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.1-0.5mL，即为提取液；
④将③中提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液。
6.根据权利要求5所述的测量方法，其特征在于，步骤(2)中，所述供试品溶液的制备：①取抗病毒颗粒，研磨过80目筛，精密称定3g置于不锈钢萃取池，以超纯水为萃取溶剂进行萃取，萃取温度120℃，萃取时间40min，萃取1次，冲洗体积100％萃取池体积，吹扫时间60s条件下进行萃取，过滤得滤液和滤渣；
②取①中滤渣加提取剂，料液比1:20，浸泡时间15min，提取时间2min，微波提取两次，过滤得滤液；
③合并①和②中滤液，过固相萃取小柱，用体积比为4:96的氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用N2吹至0.2mL，即为提取液；
④将③中提取液置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，取滤液，即得供试品溶液。
7.根据权利要求5或6所述的测量方法，其特征在于，所述②中提取剂为水或乙醇，微波功率为300-500W；所述③中，滤液过柱前采用甲醇溶液活化固相萃取小柱，过固相萃取小柱的流速控制在1-2s/滴。
8.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，步骤(3)中，所述对照品溶液的制备：取适量(R,S)-告依春，精密称定，加甲醇制成每1mL含(R,S)-告依春3-10μg的溶液，即得。
9.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，步骤(4)中，所述测定法：分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
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