CN107529337A - 二去水卫矛醇中杂质的hplc分析 - Google Patents

二去水卫矛醇中杂质的hplc分析 Download PDF

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Abstract

一种用于分析二去水卫矛醇制剂的改善的分析方法，提供一种测定二去水卫矛醇制剂中二去水卫矛醇纯度、检测该制剂中杂质、并鉴别任何此类杂质的方法。该方法采用高效液相色谱(HPLC)，特别是具备蒸发光散射检测(ELSD)的HPLC；该HPLC后可串联质谱。该方法可进一步包含对二去水卫矛醇中存在的至少一个具体物质峰进行制备HPLC收集的步骤。

Description

二去水卫矛醇中杂质的HPLC分析
交叉引用
本申请主张Xiaoyun Lu和Mike Li在2013年11月18日提交的以“ImprovedAnalytical Methods for Analyzing and Determining Impurities inDianhydrogalactitol”为题且序号为US 14/083,135的美国专利申请的权益；US 14/083,135主张Xiaoyun Lu在2013年7月2日提交的以“Improved Analytical Methods forAnalyzing and Determining Impurities in Dianhydrogalactitol”为题且序号为US13/933,844的美国专利申请的权益，并且是后者的部分连续案；US13/933,844依序主张Xiaoyun Lu在2013年2月26日提交的以“Improved Analytical Methods for Analyzingand Determining Impurities in Dianhydrogalactitol”为题且序号为PCT/IB2013/000793的PCT申请的权益，并且是后者的指定美国的部分连续案；PCT/IB2013/000793依序主张Xiaoyun Lu在2012年2月27日递交的以“Improved Analytical Methods forAnalyzing and Determining Impurities in Dianhydrogalactitol”为题且序号为US61/603,464的美国临时专利申请的权益。这些申请的全部内容经由引用而以其整体并入本文。
技术领域
本发明指向二去水卫矛醇的改善分析方法，尤其是包括高效液相色谱(HPLC)的分析方法。
背景技术
二去水卫矛醇(1,2:5,6二去水卫矛醇或DAG)是许多具有显着药理活性包括化疗活性的己糖醇或己糖醇衍生物中的一种。特别地，例如在Nielsen等人的US 7,157,059中，建议将二去水卫矛醇用于化疗，该专利以引用形式并入本文。
二去水卫矛醇具有对抗许多赘生物的活性。但是，若想将二去水卫矛醇成功用作治疗剂，则必需极高程度的纯度及移除杂质。杂质的存在可导致不希望的副作用。多年前出现一个实例，当一批氨基酸中存在杂质时，色氨酸，一种蛋白质的正常组成部分，是嗜酸性粒细胞增多性肌痛综合征显着暴发的罪魁祸首，造成大量永久性残疾的例子，并造成至少37例死亡。当对免疫系统受损或肝或肾功能损害的患者或老龄患者使用治疗剂如二去水卫矛醇时，这尤其重要。由于这些患者对于污染物的敏感性，他们可能经受的不希望的副作用的发生率更高。
在二去水卫矛醇制剂中发现的杂质之一是卫矛醇。依据二去水卫矛醇制剂的制备方法，该制剂中还存在其它杂质。
因此，需要改善的用于检测二去水卫矛醇制剂中杂质和降解产物的改善的分析方法，以提供纯度更高且当给药二去水卫矛醇用于治疗性目的时更不易诱发副作用的制剂。
发明内容
本文中揭示符合要求的改善的分析方法，用于测定二去水卫矛醇制剂中二去水卫矛醇的纯度并检测该制剂中的杂质和降解产物。
通常，这一分析方法采用高效液相色谱(HPLC)，特别是具有示差折光(RI)检测器的HPLC。
一种备选中，用于分析二去水卫矛醇制剂中是否存在杂质和所存在杂质数量的分析方法包含下述步骤：
(1)令二去水卫矛醇制剂进行高效液相色谱以分析该制剂，使用具有流动相梯度的洗脱程序将二去水卫矛醇与卫矛醇和该制剂中其它污染物分离；以及
(2)检测通过高效液相色谱分离的一个或多个峰的相对浓度的步骤，各峰代表除二去水卫矛醇本身外的化合物。
除二去水卫矛醇本身外的化合物包括下述的至少一种：(1)卫矛醇；(2)除卫矛醇外的杂质；以及(3)二去水卫矛醇的降解产物。
本方法的一种备选中，洗脱是使用从约2.5mM至约0.1mM的NaOH梯度。较佳地，洗脱是使用从约1.5mM至约0.1mM的NaOH梯度。更佳地，洗脱是使用从约1mM至约0.1mM的NaOH梯度。
本方法的另一备选中，洗脱是使用氢氧化铵与挥发性铵盐组合的梯度，该挥发性铵盐选自甲酸铵和乙酸铵组成的组，且甲酸铵和乙酸铵的总浓度为从约2.5mM至约0.1mM。较佳地，氢氧化铵与选自甲酸铵和乙酸铵组成组的挥发性铵盐的总浓度为从约1.5mM至约0.1mM。更佳地，氢氧化铵与选自甲酸铵和乙酸铵组成组的挥发性铵盐的总浓度为从约1mM至约0.1mM。典型地，氢氧化铵与选自甲酸铵和乙酸铵组成组的挥发性铵盐的比例从洗脱开始时的约100:1变为洗脱结束时的约1:100。
典型地，本方法中，通过蒸发光散射检测来实施对由高效液相色谱分离的代表除二去水卫矛醇本身外化合物的一个或多个峰相对浓度的测定。典型地，该蒸发光散射检测器与电喷射LC/MS相容。典型地，该蒸发光散射检测器包含在柱后加入挥发性溶剂，以增强该100％水性流动相的蒸发。典型地，该挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇及乙腈组成的组。
一种备选中，电喷射串联质谱仪安装并在线连接至该具有ELSD的HPLC系统。典型地，在此备选中，收集提供二去水卫矛醇制剂中可能存在的每一杂质的化学信息的质谱数据。又，典型地，在此备选中，收集提供二去水卫矛醇制剂中可能存在的每一杂质的结构信息的串联质谱数据。
该方法可进一步包含实施制备HPLC收集二去水卫矛醇制剂中存在的至少一种具体物质峰的步骤。二去水卫矛醇制剂中存在的该至少一种具体物质峰可能是杂质。
另一备选中，可使用等度洗脱替代梯度洗脱。当使用等度洗脱时，该方法通常包含下述步骤：
(1)令二去水卫矛醇制剂进行高效液相色谱以分析该制剂，使用具有等度流动相的洗脱程序将二去水卫矛醇与卫矛醇和该制剂中其它污染物分离；以及
(2)检测通过高效液相色谱分离的一个或多个峰的相对浓度的步骤，各峰代表除二去水卫矛醇本身外的化合物。
一种备选中，当使用等度洗脱时，该等度流动相为NaOH，且该NaOH的浓度为从约5mM至0.1mM。较佳地，该NaOH的浓度为从约2.5mM至约0.1mM。更佳地，该NaOH的浓度为约1mM。
另一备选中，当使用等度洗脱时，该等度流动相是氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的组合，且该氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的总浓度为从约5mM至0.1mM。较佳地，该氢氧化铵与挥发性乙酸铵的总浓度为从约2.5mM至约0.1mM。更佳地，该氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的总浓度为约1mM。典型地，氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的比例为约50:50。
典型地，另一备选中，如上揭者，通过蒸发光散射检测(ELSD)实施测得由高效液相色谱分离的代表除二去水卫矛醇本身外化合物的一个或多个峰相对浓度的步骤。典型地，该蒸发光散射检测器与电喷射LC/MS相容。典型地，该蒸发光散射检测包含在柱后加入挥发性溶剂，以增强该100％水性流动相的蒸发。典型地，该挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、一般能够从及乙腈组成的组。
仍在此备选中，电喷射串联质谱仪安装并在线连接至该具有ELSD的HPLC系统。典型地，在此备选中，收集提供二去水卫矛醇制剂中可能存在的每一杂质的化学信息的质谱数据。又，典型地，在此备选中，收集提供二去水卫矛醇制剂中可能存在的每一杂质的结构信息的串联质谱数据。
根据本发明方法的此备选可进一步包含实施HPLC收集二去水卫矛醇制剂中存在的至少一种具体物质峰的步骤。二去水卫矛醇制剂中存在的该至少一种具体物质峰可能是杂质。
再一备选中，用于分析二去水卫矛醇制剂中是否存在杂质并不对所存在杂质定量的分析方法包含下述步骤：令二去水卫矛醇制剂于高效液相色谱(HPLC)柱上经HPLC而分析该制剂，使用具有流动相梯度的洗脱程序将二去水卫矛醇与卫矛醇及该制剂中的其它污染物分离；其中，该高效液相色谱采用蒸发光散射检测(ELSD)。
典型地，该HPLC柱是结合有C18化合物且以采用路易斯酸-路易斯碱化学的封端过程整理的硅胶柱。
典型地，所实施的洗脱梯度为：95％水/5％乙腈，变为70％水/30％乙腈，再变回95％水/5％乙腈。典型地，改变洗脱剂的时间表如下：0分钟，95％水/5％乙腈；15分钟，95％水/5％乙腈；15.1分钟，70％水/30％乙腈；20分钟，70％水/30％乙腈；20.1至35分钟，95％水/5％乙腈。典型地，该方法检测二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、单环氧化物二聚物、及卫矛醇。较佳地，该方法也检测二去水卫矛醇二聚物和缩聚产物。
典型地，使用LC-MS分析从HPLC所得的峰。
典型地，该方法进一步包含测定由高效液相色谱分离的标示除二去水卫矛醇本身外化合物的一个或多个峰的相对浓度的步骤。
在一种通过ELSD进行检测的备选中，柱温为约30℃。
典型地，流速为约0.5mL/min。典型地，该ELSD检测器以冷却模式操作，漂移管温度为35℃，增益为400，2pps，45PSI。典型地，在此备选中，采用流动相A和流动相B，且流动相A为0.05％甲酸水溶液，流动相B为100％甲醇。典型地，使用这些流动相根据下述方案实施洗脱：0分钟至25分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；25分钟至25.1分钟90％的0.05％甲酸水溶液和10％的100％甲醇；25.1分钟至35分钟，10％的0.05％甲酸水溶液和90％的100％甲醇；以及，35.1分钟至50分钟，100％的0.05％甲酸水溶液。
该方法可进一步包含杂质外标校准曲线的制作。该杂质可选自卫矛醇、二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、及二去水卫矛醇二聚物组成的组。该方法可使用通过二去水卫矛醇标准物质的色谱构建的校准曲线估算未知杂质的含量。
采用HPLC和ELSD的另一备选采用双洗脱序列。该双洗脱序列如下：洗脱序列的第一部分，如下述者实施洗脱：0分钟至25分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；25分钟至25.1分钟，90％的0.05％甲酸水溶液和10％的100％甲醇；25.1分钟至35分钟，10％的0.05％甲酸水溶液和90％of甲醇；以及，35.1分钟至50分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；洗脱序列的第二部分，如下述者实施洗脱：0分钟至7.5分钟，100％的0.05％甲酸；7.5分钟至7.6分钟，97％的0.05％甲酸和3％的甲醇；以及，7.6分钟至20分钟，100％的0.05％甲酸。此备选中，HPLC的柱温典型为约30℃，HPLC的样品温度为约5℃，HPLC的流速为约0.5mL/min，且进样体积为约10至100μL。此备选中，典型地，对于ELSD，增益为约400，漂移管温度为约45℃，气压为约35PSI的氮气，雾化器设定为冷却，数据速率为每秒2点，且瑞利因子(Rayleighfactor)为约6.0。典型地，此备选中，采用浓度为0.1、0.08、0.05、0.03、0.01、0.005mg/mL的卫矛醇标样测定该系统的灵敏度和线性度。典型地，此备选中，卫矛醇的保留时间为约6.4分钟，而二去水卫矛醇的保留时间为约12.1分钟。此备选中，可从HPLC和ELSD的结果测定卫矛醇杂质的量和百分比。又，此备选中，可从HPLC和ELSD的结果测定除卫矛醇的未知杂质的量和百分比。
附图说明
参考下述说明书、权利要求书和附图，将更容易理解本发明的这些和其它特征、方面和优势，其中：
图1是二去水卫矛醇制剂的代表性HPLC/RI色谱图，显示原料药和成品药中卫矛醇与RRT～0.6的未知相关物质的分离。
图2显示代表性HPLC色谱图，显示标样中二去水卫矛醇与卫矛醇的分离，以及用于比较的水空白；图2中，二去水卫矛醇-卫矛醇标样显示于上图中，而水空白显示于下图中。
图3是使用蒸发光散射检测器进行检测的二去水卫矛醇临床样品的HPLC色谱图，显示可能的二去水卫矛醇二聚物和可能的缩聚产物的存在，以及作为降解产物的单环氧化物和卫矛醇的存在。
图4是在图3的HPLC色谱图中22.6分钟出现的杂质峰的质谱图。
图5是如实施例3中所述实施的二去水卫矛醇样品的色谱图，采用0.05％甲酸水溶液作为流动相A，100％甲醇作为流动相B。
图6是如实施例4中所述所述实施的空白溶液的实例色谱图。
图7是如实施例4中所述实施的0.10％卫矛醇溶液的实例色谱图。
图8是如实施例4中所述实施的测试溶液的实例色谱图。
具体实施方式
本发明指向改善的分析方法，用于测定二去水卫矛醇的纯度，以及测定二去水卫矛醇制剂中杂质的存在性和浓度。
二去水卫矛醇的结构如下式(I)所示。
二去水卫矛醇制剂中存在的一种显着杂质为卫矛醇。卫矛醇的结构如下式(II)所示。已知有其它杂质存在于二去水卫矛醇制剂中。
改善的分析二去水卫矛醇制剂的方法是基于使用蒸发光散射检测(ELSD)的HPLC(高效液相色谱)。一种备选中，为了检测并鉴别此类二去水卫矛醇制剂中的全部显着成分，将HPLC与质谱(MS)联用。
HPLC的理论和实践揭示于L.R.Snyder等人所著的《Introduction to ModernLiquid Chromatography》(3rd ed.,John Wiley&Sons,New York,2009)中。MS的理论和实践揭示于E.de Hoffmann和V.Stroobant所著的《Mass Spectroscopy:Principles andApplications》(3rd ed.,John Wiley&Sons,New York,2007)中。
HPLC方法除了表明在RRT 0.6观察到的未知相关物质的分离外，也表明了二去水卫矛醇制剂中合成中间体卫矛醇的分离(图1)。图1是二去水卫矛醇制剂的代表性HPLC/RI色谱图，显示原料药和成品药中卫矛醇与RRT～0.6的未知相关物质的分离。显示标样中二去水卫矛醇与卫矛醇的分离、以及用作比较的水空白的代表性HLPC色谱图显示于图2中。图2中，二去水卫矛醇-卫矛醇标样显示在上图中，而水空白显示在下图中。
本申请揭示用于分离潜在的共洗出物质的改善的HPLC色谱条件。评估受热的二去水卫矛醇产品样品，以提供该色谱条件适用于分离卫矛醇与其它相关杂质和降解产物的证据。之后，实施LC/MS和LC/MS/MS来表征RRT～0.6的未知DAG相关物质，以提供这一未鉴别成分的化学结构的质谱学表征和鉴定。
先前采用的HPLC条件包括使用50mM NaOH流动相对二去水卫矛醇及其相关物质进行等度洗脱。在这些条件的改善中，用作本文所揭露方法的一部分，采用梯度流动相。一种备选为以浓度梯度使用NaOH。若以浓度梯度采用NaOH，则洗脱梯度典型为从约2.5mM至约0.1mM的NaOH。较佳地，洗脱梯度为从约1.5mM至约0.1mM的NaOH。更佳地，洗脱梯度为从约1mM至约0.1mM的NaOH。
另一备选中，使用氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的组合作为洗脱剂。此备选中，甲酸铵和乙酸铵的总浓度为从约2.5mM至约0.1mM。较佳地，氢氧化铵和选自甲酸铵及乙酸铵的挥发性铵盐的总浓度为从约1.5mM至约0.1mM。更佳地，氢氧化铵和选自甲酸铵及乙酸铵的挥发性铵盐的总浓度为从约1mM至约0.1mM。典型地，氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵的挥发性铵盐的比例从洗脱开始时的约100:1变为洗脱结束时的约1:100。
其它梯度洗脱方案是该技术中已知的。
典型地，根据本发明的HPLC分析方法中，通过蒸发光散射(ELSD)手段进行检测。蒸发光散射检测器(ELSD)雾化柱洗出液，照射光于所得微粒状成分上，并检测所得散射光。理论上，ELSD可检测任何非挥发性成分。非发色化合物的蒸发光散射检测，是基于HPLC洗出液的雾化和流动相溶剂的蒸发以产生雾化溶质颗粒用于光散射检测。这一产生雾化分析质溶质颗粒的雾化和溶剂蒸发制程与电喷射LC/MS过程相当。典型地，该ELSD检测与电喷射LC/MS相容。
执行与电喷射LC/MS应用相容的具有ELSD检测的HPC方法，包括在柱后添加挥发性溶剂以增强该100％水性流动相的蒸发。该挥发性溶剂典型选自甲醇、乙醇、异丙醇、及乙腈组成的组。
据此，根据本发明的方法中，电喷射串联质谱仪安装并在线连接至具有ELSD的HPLC洗脱。可收集提供分子信息的质谱数据和提供可能存在于二去水卫矛醇制剂中的每一杂质的化学结构信息的质谱数据。对于每一观察到的杂质和降解产物，与HPLC串联的质谱分析将提供其分子离子信息和具有与该分子离子信息一致分子量的可能的化学结构。
另一备选中，可实施制备HPLC收集具体的DAG相关物质峰，包括DAG制剂中存在的杂质。
据此，一种用于分析二去水卫矛醇制剂中是否存在杂质并定量所存在杂质的分析方法包含下述步骤：
(1)令二去水卫矛醇制剂进行高效液相色谱以分析该制剂，使用具有流动相梯度的洗脱程序将二去水卫矛醇与卫矛醇和该制剂中其它污染物分离；以及
(2)检测通过高效液相色谱分离的一个或多个峰的相对浓度的步骤，各峰代表除二去水卫矛醇本身外的化合物。
除了二去水卫矛醇本身之外的化合物可以是下述至少一种：(1)卫矛醇；(2)除卫矛醇外的杂质；以及(3)二去水卫矛醇降解产物。
典型地，一种备选中，本方法中的流动相梯度为氢氧化钠梯度。
另一备选中，本方法中的流动相梯度为氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的组合的梯度。
典型地，本方法中，通过蒸发光散射进行检测。典型地，当采用蒸发光散射时，该方法进一步包含在柱后加入挥发性溶剂以增强流动相成分蒸发的步骤。
典型地，本发明进一步包含通过电喷射串联质谱分析从高效液相色谱洗脱的一个或多个峰的步骤。
一种备选中，本发明进一步包含使用制备HPLC收集至少一个具体DAG-相关物质峰的步骤。
若存在杂质或降解产物(除卫矛醇外)，可通过下述鉴别该未知杂质或降解产物：使用柱色谱分离，之后进行至少一个纯化过程以获得固体未知样品，随后，通过选自核磁共振(NMR)、质谱(MS)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、元素分析组成组的至少一种标准分析过程表征进行鉴别，通过HPLC测定纯度，并通过卡尔·费歇尔滴定方法测定水含量。这些方法是该领域已知的方法。
另一备选中，该方法包含：
(1)令二去水卫矛醇制剂进行高效液相色谱以分析该制剂，使用具有等度流动相的洗脱程序将二去水卫矛醇与卫矛醇和该制剂中其它污染物分离；以及
(2)检测通过高效液相色谱分离的一个或多个峰的相对浓度的步骤，各峰代表除二去水卫矛醇本身外的化合物。
采用梯度洗脱的方法中，除了二去水卫矛醇本身外的化合物可以是下述至少一种：(1)卫矛醇；(2)除卫矛醇外的杂质；以及(3)二去水卫矛醇的降解产物。
在此备选中，使用等度流动相的洗脱可以是使用氢氧化钠洗脱，或使用氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组的挥发性铵盐的组合洗脱。若该等度流动相为氢氧化钠，则NaOH的浓度典型为从约5mM至0.1mM。较佳地，NaOH的浓度为从约2.5mM至约0.1mM。更佳地，NaOH的浓度为约1mM。若该等度流动相为氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组飞挥发性铵盐的组合，则氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组飞挥发性铵盐的总浓度为从约5mM至0.1mM。较佳地，氢氧化铵与挥发性乙酸铵的总浓度为从约2.5mM至约0.1mM。更佳地，氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组飞挥发性铵盐的总浓度为约1mM。典型地，氢氧化铵与选自甲酸铵及乙酸铵组成组飞挥发性铵盐的比例为约50:50。
在改善分离的备选方法中，采用蒸发光散射检测器(ELSD)并采用变更的洗脱条件。典型地，此方法中，该HPLC柱是结合有C18化合物且以采用路易斯酸-路易斯碱化学的封端过程进行整理的硅胶柱，如YMC C18柱。典型地，使用下述梯度实施洗脱：95％水/5％乙腈变为70％水/30％乙腈，再变回95％水/5％乙腈。较佳地，变更洗脱剂的时间表如下：0分钟，95％水/5％乙腈；15分钟，95％水/5％乙腈；15.1分钟，70％水/30％乙腈；20分钟，70％水/30％乙腈；20.1至35分钟，95％水/5％乙腈。较佳地，该HPLC检测二去水卫矛醇的单花氧化物降解产物、单环氧化物二聚物、及卫矛醇。更佳地，该HPLC方法也检测二去水卫矛醇二聚物和缩聚产物。
较佳地，在该方法的一种备选中，通过LC-MS分析HPLC所得的峰。
另一备选方法中，如实施例3中所示，采用Atlantis HPLC柱。典型地，此方法中，柱温为约30℃。典型地，此方法中，流速为约0.5mL/min。典型地，此方法中，进样体积为约10μL至约100μL。典型地，此方法中，使用ELSD检测器。典型地，此方法中，该ELSD检测器以冷却模式操作，漂移管温度为35℃，增益为400，2pps，45PSI。典型地，此方法中，采用流动相A和流动相B，流动相A为0.05％甲酸水溶液，而流动相B为100％甲醇。典型地，此方法中，如下述实施洗脱：从0分钟至25分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；从25分钟至25.1分钟，90％的0.05％甲酸水溶液和10％的100％甲醇；从25.1分钟至35分钟，10％的0.05％甲酸水溶液和90％的100％甲醇；以及，从35.1分钟至50分钟，100％的0.05％甲酸水溶液。
典型地，该方法的此备选进一步包含杂质外标校准曲线的制作。该杂质可以是，但不限于，选自卫矛醇、二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、及二去水卫矛醇二聚物组成组的杂质。此方法中，对于未知杂质，可使用通过二去水卫矛醇标准材料色谱构建的校准曲线评估该未知杂质的含量。
另一备选中，如实施例4中所示，在上述洗脱序列之后，即如下述实施洗脱之后：从0分钟至25分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；从25分钟至25.1分钟，90％的0.05％甲酸水溶液和10％的100％甲醇；从25.1分钟至35分钟，10％的0.05％甲酸水溶液和90％的100％甲醇；以及，从35.1分钟至50分钟，100％的0.05％甲酸水溶液，如下述实施另一洗脱序列：从0分钟至7.5分钟，100％的0.05％甲酸；从7.5分钟至7.6分钟，97％的0.05％甲酸和3％的甲醇；以及，从7.6分钟至20分钟，100％的0.05％甲酸。此备选中，HPLC的柱温典型为约30℃，HPLC的样品温度为约5℃，HPLC的流速为约0.5mL/min，且进样体积为约100μL。此备选中，典型地，对于ELSD，增益为约400，漂移管温度为约45℃，气压为约35PSI的氮气，雾化器设定为冷却，数据速率为每秒2点，且瑞利因子为约6.0。典型地，此备选中，采用0.005至0.1mg/mL的卫矛醇标样测定该系统的灵敏度和线性度。典型地，此本想中，卫矛醇的保留时间为约6.4分钟，而二去水卫矛醇的保留时间为约12.1分钟。此备选中，可从HPLC和ELSD的结果测定卫矛醇杂质的量和百分比。又，此备选中，可从HPLC和ELSD的结果测定除卫矛醇外的未知杂质的量和百分比。
通过下述实施例例示性说明本发明。这些实施例仅用于例示性说明的目的，而非限制本发明。
实施例
实施例1.采用等度氢氧化钠洗脱进行二去水卫矛醇制剂的HPLC分析
使用本实施例中揭示的过程通过离子交换高效液相色谱和示差折光检测来测定二去水卫矛醇药物制剂中的卫矛醇和相关杂质。
此过程中，样品制备为二去水卫矛醇目标浓度为5mg/mL。使用阴离子交换柱(Hamilton RCX-10,250*4.1mm,7μm)、50mM NaOH作为等度流动相、及示差折光检测分开卫矛醇、二去水卫矛醇、和相关杂质。使用外标测定卫矛醇浓度，并使用DAG参考标准估算相关物质的含量。
适宜的HPLC系统和数据撷取系统是配备下列的安捷伦1200系列(AgilentTechnologies 1200Series)HPLC系统或等效系统：G131 1A型四元泵或等效；1329A型自动进样器或等效；1362A型RID检测器或等效；能将温度控制为30±3℃的柱温控制器；以及G1322型脱气器或等效。色谱柱为Hamilton RCX阴离子交换柱250*4.1–mm，7μm，P/N 79440，或等效。通过ChemStation和ChemStore Client/Server或等效数据系统实施数据撷取。
使用下述化学品。水为Milli-Q水或去离子水。氢氧化钠为标准纯度。卫矛醇和DAG参考标准的纯度>98.0％。
对于流动相(50mM NaOH)，将2.0g NaOH溶解于1升水中。该溶液通过0.45-μm过滤器过滤。该流动相可在室温储存1个月。对于卫矛醇参考原料溶液(标称500g/mL)，将精确称重的25mg卫矛醇参考标准加入50-mL容量瓶中。以去离子水溶解该卫矛醇至标称体积，并混合均匀。所制备的原料溶液可在2至8℃储存3天。对于DAG参考原料溶液(标称500g/mL)，将精确称重的25mg DAG参考标准加入50-mL容量瓶中。以去离子水溶解该DAG至标称体积，并混合均匀。所制备的原料溶液可在2至8℃储存3天。对于卫矛醇-DAG标准溶液(卫矛醇50Mg/mL+DAG 50Mg/mL；各自为1％的5mg/mL DAG)，将1.0ml的卫矛醇原液和1.0ml的DAG原液各自定量转移至10-mL容量瓶中，以水稀释，并混合。
对于来自API样品(标称1mg/mL)的DAG样品制剂，将精确称重的约25mg API样品的DAG加入干净的25-mL容量瓶中。以大约5mL去离子水溶解该DAG API样品，以去离子水稀释至标称体积，并混合。将测试样品的1至2mL小样转移至HPLC样品管内。所制备的样品可在2至8℃储存2天。
对于API样品的DAG样品制剂(标称5mg/mL)，将精确称重的约50mg API样品加入干净的10-mL容量瓶中。以大约5mL水溶解该DAG API样品，以水稀释至标称体积，并混合。
对于来自冻干(40mg/样品管)样品的DAG样品制剂，将样品从其所储存之冰箱中取出，并移除封盖。将体积为5.0mL的水定量转移，并混合该溶液以溶解DAG，获得8mg/mL溶液。以去离子水将重建溶液的1.0g小样稀释至8.0g，并混合。进一步将测试样本的1至2mL小样转移至HPLC样品管中。所制备的样品可在2至8℃储存2天。
对于使用冻干粉(40mg/样品管)的成品药的DAG样品制剂(标称5mg/mL)，清洁该样品管封盖并移除。以8.0mL水重建该冻干粉以获得5mg/mL溶液。将1至2mL的小样转移至HPLC样品管汇总。制备两个平行小样(使用两个样品管)。所制备的样品在2至8℃最长可储存24小时。
对于HPLC分析，启动HPLC系统，并令检测器预热20分钟。若必要，将如上文所述制备的HPLC流动相置于适当的溶剂入口内。溶剂线以该流动相清理。使用HPLC流动相以流速1.5mL/min平衡该系统及柱至少30分钟。创建样品分析序列。一旦系统适用性被确认，即诸如水空白，之后注入标样，随后是样品。每注入样品10次后，插入一次卫矛醇-DAG标样，并在运行终点注入最后划界标样。适宜的样品分析序列显示于表1中。
表1.样品分析序列
使用RID分析样品。如上所示，适宜的柱为Hamilton RCX离子交换柱(250*4.1mm,7μm)，P/N 79440或等效。流动相为溶解于去离子水的50mM NaOH(等度洗脱)。流速为1.5mL/min。柱温为30℃。进样体积为50μL。使用RID在35℃检测。运行时间为8分钟。
使用HPLC软件进行对色谱图的分析和积分。总合并比较空白、样品和测试标准的色谱图。对某些峰进行手动积分和赋值可能是必要的。调整积分参数如斜率灵敏度、峰宽、用于排除的峰高阈值、肩峰的积分类型、基线、及分峰和其它参数以获得适当的积分，并记录这些参数的值并应用至全部样品和标准。
该系统的适用性评估如下。使用表2的色谱效能需求评价6次重复进样的卫矛醇-DAG标准溶液。
表2.色谱效能需求
卫矛醇保留时间(RT)： ～2min
DAG保留时间(RT)： ～6min
峰响应变化％RSD： ≤10.0％
保留时间变化％RSD： ≤2.0％
划界标准溶液进样中的卫矛醇和DAG峰面积应各自为先前SST进样中平均峰面积的80％至120％。在一个划界标样不符合准则的例子中，应再次分析在最后一次划界标准过柱后进样的样品。
在数据的分析中，相对峰面积＝(峰面积/总峰面积)*100，其中，“峰面积”是单独峰面积，而“总峰面积”为来自全部峰的峰面积之和。
如下式计算卫矛醇浓度：卫矛醇(Cu,μg/mL)＝Cs x样品峰平均面积/Dul-DAG标样进样的卫矛醇峰平均面积，其中，Cs是以μg/mL计的卫矛醇浓度。
如下式计算DAG原料药或成品药中的卫矛醇含量(wt％)：卫矛醇wt％＝Cu(μg/mL)/1000/SC(mg/mL)x 100％，其中，Cu为如上文所述计算的卫矛醇浓度(Mg/mL)，且SC是制备用作原料药或成品药的样品浓度(mg/mL)。若存在卫矛醇且其重量百分比大于或等于0.05％，则记录该重量百分比；记录精确度为0.01％。
若DAG制剂中存在除卫矛醇外的未知或先前未鉴别的杂质，则如下式计算该杂质浓度：未知杂质浓度(μg/mL)＝Cs*样品峰平均面积/Dul-DAG标样进样的DAG峰平均面积。若存在未知杂质，则如下式计算其重量百分比：Cu(μg/mL)/1000/SC(mg/mL)x 100％，其中，Cu为如上文所述计算的未知杂质浓度(μg/mL)，且SC为[0077]中制备的原料药或[0079]制备的成品药中的样品浓度(mg/mL)。若存在未知杂质且其重量百分比大于或等于0.05％，则记录该重量百分比；记录精确度为0.01％。
计算每一样品的重量百分比试验结果，并取两个平行样品的均值。
实施2.采用蒸发光散射检测器且使用水/乙腈梯度的HPLC分析
为了改善杂质的分离，采用另一HPLC分析方法，在该方法中，使用蒸发光散射检测器(ELSD)及下文详述的水/乙腈梯度。
由于示差折光(RI)显示器的限制性，HPLC/RI方法并不具备足以获得可靠杂质概况数据的特异性，可能造成令患者暴露于不可接受的未知或未完全表征的杂质中的风险。为解决这一问题，将灵敏度更高的检测器如安捷伦公司(Agilent)制造的蒸发光散射检测器(ELSD)与HPLC系统联用，用来检测在二去水卫矛醇原料药或成品药中发现的杂质。
例如，通过HPLC/ELSD方法使用YMC C18柱和表3中所示的梯度分析DAG样品：
表3
如色谱图(图3)中所示，卫矛醇在4.5分钟的保留时间被洗出。在卫矛醇之后洗出的第一个峰，经鉴别为单环氧化物相关化合物，这一结果为表4中总结的LC-MS数据所支持。在11.46分钟观察到的峰可能是DAG二聚物；而在22.6分钟洗出的峰在LC-MS中贡献了m/z为271、357、417、512及其它峰的多个峰，该洗出峰可能是缩聚产物(图4)。这些数据与先前研究预想的杂质概况一致。如预期的，单环氧化物和卫矛醇是通过本方法获得的两个主要降解产物。
表4
实施例3.使用甲酸水溶液/甲醇梯度以改善单环氧化物峰分离情况的HPLC分析
为了改善单环氧化物峰的分离情况，研发一种新方法。这一新方法采用下述参数：柱为Atlantis C18,250x 4.6mm,5μm。柱温为30℃。流速为0.5mL/min。进样体积为100μL。ELSD检测器以冷却模式操作，漂移管温度为35℃，增益为400，2pps，45PSI。流动相A为0.05％甲酸水溶液。流动相B为100％甲醇。梯度显示于表5中：
表5
已经观察到早期洗出杂质的更好分离(指代图5下的DAG样品的色谱图)。标记为卫矛醇的峰2在保留时间6.26分钟或相对保留时间(RRT)0.59被洗出。二去水卫矛醇在10.86分钟洗出。
由于ELSD响应并非线性，需要已知杂质如卫矛醇的外标校准曲线，以测定所测试二去水卫矛醇样品中的杂质含量。对于二去水卫矛醇样品中含有的未知杂质，可使用通过二去水卫矛醇标准材料的色谱构建的校准曲线来估算该未知杂质的含量。
实施例4.采用双梯度HPLC洗脱来检测或测定杂质的进一步改善的方法
用于检测或测定二去水卫矛醇中杂质的进一步改善的方法是在HPLC中采用HPLC和ELSD及双梯度洗脱。该方法如下所述。
此分析方法中，使用下述材料和设备：Atlantis C18,250*4.6-mm,5-μm HPLC柱；四元或二元HPLC泵；蒸发光散射检测器(ELSD)；基于积分器或计算机的分析系统；经校准的分析平衡；A级容量瓶和移液管。使用下述试剂和标样：如上所述的卫矛醇参考标样；HPLC级水；HPLC级或等效的甲酸(FA)；HPLC级或等效的乙腈(ACN)；和HPLC级或等效的甲醇(MeOH)。
对于本方法中采用的溶液，可放大体积以适应分析所需。全部流动相都经过滤是重要的。过滤仪器中的烧结玻璃可以是该ELSD中灵敏度的干扰源。全部过滤仪器应使用Milli-Q级水彻底冲洗。为实施这一动作，通过该过滤仪器过滤大约500mL的Milli-Q级水。丢弃该水，随后过滤该流动相。
使用适当的PPE(手套、实验服、及安全玻璃)在通风橱中作成测试溶液制剂。测试溶液制剂在通风橱中储存以备处理，并贴适当标签。
用移液管将0.5mL的甲酸移入1000mL的水中并混合均匀，制备流动相A。过滤该流动相A并脱气。
流动相B为MeOH。流动相B经过滤并脱气。
稀释剂A为水。通过混合20mL的ACN与180mL的水并混合均匀，制备稀释剂B。
标样和样品溶液制剂揭示如下。空白溶液为水。通过将100mg的卫矛醇参考标样精确转移至20-mL容量瓶中而制备卫矛醇原液。加入约15mL的稀释剂B，超声处理进行溶解。将该溶液冷却至室温，使用稀释剂B稀释至标称体积，混合均匀(5mg/mL)。制备下述标准溶液：0.2、0.1、0.08、0.05、0.03、0.01、及0.005mg/mL(系统灵敏度溶液)。用移液管将2.0mL的卫矛醇原液移入50-mL容量瓶中而制备4.0％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.2mg/mL)。用移液管将5.0mL的4.0％标准溶液移入10-mL容量瓶而制备2.0％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.10mg/mL)。使用移液管将4.0mL的4.0％标准溶液移入10-mL容量瓶而制备1.6％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.08mg/mL)。使用移液管将2.5mL的4.0％标准溶液移入10-mL容量瓶中而制备1.0％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.05mg/mL)。使用移液管将3.0mL的4.0％标准溶液移入20-mL容量瓶而制备0.60％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.30mg/mL)。使用移液管将1.0mL的4.0％标准溶液移入20-mL容量瓶中而制备0.20％标准溶液。以水稀释该溶液至标称体积，混合均匀(0.01mg/mL)。使用移液管将5.0mL的0.20％标准溶液移入10-mL容量瓶中而制备0.10％标准溶液(系统灵敏度溶液)。该溶液用水稀释至标称体积，并混合均匀(0.005mg/mL)。
平行制备测试样品工作溶液(A及B)。样品溶液制备后必须立即分析。进样必须在样品溶液制备后15分钟内完成。某些例子中，可能需要进行样品稀释，以将过载的任意杂质定量。
对于样品制备，将大约50mg测试样品精确转移至10mL容量瓶中。测试样品溶解于水中，稀释至标称体积，并混合均匀(5mg/mL)。
HPLC操作条件如下：柱为Atlantis C18 250*4.6-mm,5-μm HPLC柱。流动相A为0.05％的FA水溶液。流动相B为MeOH。梯度A与梯度B如下表6中所述。柱温为30℃。样品温度为5℃。流速为0.5mL/min。进样体积为100μL。梯度A运行时间为50分钟，梯度B运行时间为20分钟。
表6
ELSD操作条件如下：增益为400。漂移管温度为45℃。气压(氮气)为35PSI。雾化器设定为冷却。数据速率为每秒2点。在检测器中直接设定的瑞利因子为6.0。
进样序列显示于表7中。重复空白进样，直至获得温度且可重现的基线。
表7
可如所需者增加测试样品进样次数。在重复0.20％标准溶液检查进样之前，实施不超过6次测试样品溶液进样。
对于估算，应对所检测到的任何未知杂质对应的全部峰进行积分。若基线噪声成问题，则确保废物从该检测器适当排除。可能必需检查，从ELSD排除废物的管道内无液体蓄积。如需要，应校正该管道位置。如果废物被适当排除且基线噪声仍成问题，则可清洁检测器。若需要，可在分析前使用下述清洁方法。对于清洁，HPLC条件如下：将柱从设备中移除，并使用并联柱。流动相为100％H2O(等度100％)。流速为1.0mL每分钟。柱温为室温。运行时间为60分钟。ELSD操作条件如下：增益为50。漂移管温度为100℃。气压(氮气)为50PSI。雾化器设定为以75％加热。
典型的保留时间显示于表8中。表8中，“DAG”为二去水卫矛醇。本方法中，测试样品中的DAG并未定量。由于所需要的DAG浓度，观察到的DAG为宽峰。样品溶液中DAG的保留时间为大约10至13分钟之间。
表8
成分 RT,min RRT
卫矛醇 6.4 0.53
*DAG 12.1* 1.00
图6是空白溶液的实例色谱图。
图7是0.10％标准溶液(系统灵敏度溶液)的实例色谱图。
图8是测试溶液的实例色谱图。
系统适用性需求如下。对于空白溶液进样，在卫矛醇峰或任何已知杂质的保留时间不应观察到干扰峰。应观察到稳定且可重现的基线；持续进样空白溶液直至符合此条件。对于系统灵敏度，应在进样0.10％标准溶液后观察到卫矛醇峰。应记录卫矛醇峰的信噪比。若流动相被污染(即，基线噪声大于1.0LSU)或未观察到卫矛醇峰，则应重新制备流动相或实施上文所揭示的清洁过程。第一次和最后一次进样0.20％标准溶液时的卫矛醇峰的USP拖尾因子不超过2.0。对于精确度，计算5次进样中log[峰面积]的％RSD。该％RSD必须不超过15％。
对于计算，全部被认为不对应空白溶液的峰都应进行积分。对于0.10％至2.0％标准溶液(包括0.20％标样的5次精确进样)，以该响应的对数对卫矛醇浓度的对数作图。对于线性曲线，相关系数(r)必须不小于0.98。从该曲线测定斜率和截距。使用卫矛醇的线性曲线来测定该样品中未知杂质和卫矛醇的浓度，该浓度以mg/mL计。
对于样品中独立未知杂质的测定，使用上文揭示的来自卫矛醇线性曲线的斜率和截距。使用未知杂质的Log[面积响应]，使用下述等式(1)计算该未知杂质的Log[浓度]：
Log[未知杂质浓度]＝(Log[未知杂质响应]-截距)/斜率(1)
使用下述等式(2)测定未知杂质的量(以mg/mL计)：
未知杂质浓度(mg/mL)＝10Log[未知杂质浓度](2)。
使用下述等式(3)测定每一未知杂质的百分比：
％未知杂质＝未知杂质浓度(mg/mL)*100/Spl.Conc.(mg/mL)(3)。
或者，可使用Empower(Waters Corp.)中的log-log线性方程来完成使用卫矛醇标样的定量分析。
使用类似等式，具体为等式(4)至(6)，测定样品中的卫矛醇杂质。
使用卫矛醇的log[峰响应]，使用等式(4)测定卫矛醇的log[浓度]：
Log[卫矛醇浓度]＝(Log[卫矛醇响应]-截距)/斜率
使用等式(5)测定卫矛醇杂质的浓度(以mg/mL计)：
卫矛醇浓度(mg/mL)＝10Log[卫矛醇浓度]
使用等式(6)测定卫矛醇杂质的百分比：
％卫矛醇＝卫矛醇浓度(mg/mL)*100/Spl.Conc.(mg/mL)
本发明的优势
本发明提供一种改善的分析方法，用于对二去水卫矛醇制剂中存在的杂质，包括卫矛醇和未知杂质，进行测定和定量；以及对二去水卫矛醇制剂中存在的未知杂质进行分离和鉴别的方法。本发明的方法允许大规模制备适用于药学用途的高纯度二去水卫矛醇，并降低由于希望用于药学用途的二去水卫矛醇制剂中存在杂质而造成显着副作用的可能性。
根据本发明的方法具有工业应用性，用于分析二去水卫矛醇制剂，并对二去水卫矛醇制剂中的杂质进行测定和定量。
关于数值的范围，除非语境中明确排除，本发明涵盖介于该范围上限与下限之间的每一中值，直至该下限单位的至少十分之一。而且，除非从所指定范围特定排除，本发明涵盖任何其它所指定的中值和范围，包括该范围上限及下限的一者或两者。
除非定义相反，本文中使用的全部技术术语和科学术语的意义为本发明所属领域技术人员通常所理解的。该领域技术人员也可知悉，与本文中揭示者类似或等效的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明。
本文中讨论的出版物和专利专门提供为它们在本发明提交日期之前的揭露内容。本文内容不可解释为承认，本发明由于先前发明而无权优先于这些出版物。再者，所提供出版物的日期可能不同于实际出版日期，其实际出版日期需要独立证实。
所引用的全部出版物，包括全部已公开的专利、专利申请、文献参考、以及已经并入这些出版文件的那些出版物，通过引用而以其整体并入本文。但是，就任何通过引用而并入本文的出版物皆指代待出版信息这一方面而言，申请人不承认在本申请提交日期后出版的此类信息为先前技术。
除非语境中明确排除，本说明书及权利要求书中使用的单数形式包括复数形式。例如，术语“一”和“该”包括复数名词。此外，在一系列元件之前的术语“至少”应理解为指代该系列的每一元件。本文中例示性揭示的本发明可在缺少本文中未具体揭露的任何一个或多个元件、一个或多个限制下适宜地实践。因此，举例而言，术语“包含”、“包括”、“含有”等应可扩展理解而非限制。此外，本文中采用的术语和表达已经用作说明的术语且无限制，且在使用这些术语和表达时无意排除未来显示和揭示的任何等效物或其任何部分，应意识到，多种修饰可能均处于本发明所主张的范畴内。因此，应理解，尽管本发明已经通过较佳实施形式和任选特征予以具体揭露，该领域技术人员可对本文中揭露的发明诉诸修饰和变更，且这些修饰和变更被认为是处于本文所揭露发明的范畴之内。本文中已经广泛且通用性揭示本发明。落入该通用揭露范畴内的各较窄方面和次通用分组，也形成这些发明的一部分。这包括每一发明的通用性说明，其前提或负面局限为从该类属移除任何标的物，而无论所删除材料特定地从属于该类属与否。此外，若发明的特征或方面以马库什组的术语揭示，则该领域技术人员应意识到，本发明也因此揭示为该马库什组的任何独立成员或成员子组的术语。也应理解，上述说明为例示性说明而非限制性说明。对该领域技术人员来说，在回顾上述说明后，多种实施形式显而易见。因此，本发明的范畴应确定为与上述说明无关，而应确定为与权利要求书相关，权利要求所主张的全范畴等效物亦然。使用不超过常规实验范围的方法，该领域技术人员将意识到或将能就判定多种与本发明揭示的具体实施形式等效者。这些等效物倾向于被权利要求书所涵盖。

Claims (26)

1.一种用于分析二去水卫矛醇制剂中是否存在杂质并对杂质定量的分析方法，包含使用令高效液相色谱(HPLC)分析二去水卫矛醇制剂的步骤，该步骤中，使用具有流动相梯度的洗脱程序洗脱HPLC柱上的该制剂，以将二去水卫矛醇与卫矛醇及该制剂中的其它污染物分离；其特征在于，该高效液相色谱采用蒸发光散射检测(ELSD)。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该HPLC柱是结合有C18化合物并以采用路易斯酸-路易斯碱化学的封端过程整理的硅胶柱。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所实施的洗脱梯度为：95％水/5％乙腈，变为70％水/30％乙腈，再变回95％水/5％乙腈。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征在于，改变洗脱剂的时间表如下：0分钟，95％水/5％乙腈；15分钟，95％水/5％乙腈；15.1分钟，70％水/30％乙腈；20分钟，70％水/30％乙腈；20.1至35分钟，95％水/5％乙腈。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该方法检测二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、单环氧化物二聚物、和卫矛醇。
6.如权利要求5所述的分析方法，其特征在于，该方法也检测二去水卫矛醇的二聚物和缩聚产物。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，通过LC-MS分析从HPLC获得的峰。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该方法进一步包含检测通过高效液相色谱分离的一个或多个峰的相对浓度的步骤，各峰代表除二去水卫矛醇本身外的化合物。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，柱温为约30℃。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，流速为约0.5mL/min。
11.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，ELSD检测器以冷却模式操作，漂移管温度为35℃，增益为400，2pps，45PSI。
12.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，采用流动相A和流动相B，且流动相A为0.05％甲酸水溶液，流动相B为100％甲醇。
13.如权利要求12所述的分析方法，其特征在于，洗脱方案为：从0分钟至25分钟，100％的0.05％甲酸水溶液；从25分钟至25.1分钟，90％的0.05％甲酸水溶液和10％的100％甲醇；从25.1分钟至35分钟，10％的0.05％甲酸水溶液和90％的100％甲醇；以及，从35.1分钟至50分钟，100％的0.05％甲酸水溶液。
14.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该方法进一步包含杂质外标校准曲线的制作。
15.如权利要求12所述的分析方法，其特征在于，该方法进一步包含杂质外标校准曲线的制作。
16.如权利要求14所述的分析方法，其特征在于，该杂质选自卫矛醇、二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、和二去水卫矛醇二聚物所组成的组。
17.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，该杂质选自卫矛醇、二去水卫矛醇的单环氧化物降解产物、和二去水卫矛醇二聚物所组成的组。
18.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，对于未知杂质，使用通过二去水卫矛醇标准材质色谱构建的校准曲线估算该未知杂质的含量。
19.如权利要求12所述的分析方法，其特征在于，对于未知杂质，使用通过二去水卫矛醇标准材质色谱构建的校准曲线估算该未知杂质的含量。
20.如权利要求13所述的分析方法，其特征在于，在该洗脱序列之后，进行如下所述的另一洗脱序列：从0分钟至7.5分钟，100％的0.05％甲酸；从7.5分钟至7.6分钟，97％的0.05％甲酸和3％的甲醇；以及，从7.6分钟至20分钟，100％的0.05％甲酸。
21.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，HPLC柱温为约30℃，HPLC的样品温度为约5℃，HPLC的流速为约0.5mL/min，且进样体积为约10至100μL。
22.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，对于ELSD，增益为约400，漂移管温度为约45℃，气压为约35PSI的氮气，雾化器设定为冷却，数据速率为每秒2点，且瑞利因子为约6.0。
23.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，采用2.0％卫矛醇、1.6％卫矛醇、1.0％卫矛醇、0.60％卫矛醇、0.20％卫矛醇、及0.10％卫矛醇标样来测定该系统的灵敏度和线性度。
24.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，卫矛醇的保留时间为约6.4分钟，且二去水卫矛醇的保留时间为约12.1分钟。
25.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，从HPLC和ELSD的结果测定卫矛醇杂质的量和百分比。
26.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于，从HPLC和ELSD的结果测定除卫矛醇外的未知杂质的量和百分比。
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