KR20160108315A

KR20160108315A - 디안히드로갈락티톨 중의 불순물의 ｈｐｌｃ 분석

Info

Publication number: KR20160108315A
Application number: KR1020167016274A
Authority: KR
Inventors: 샤오윤 루; 마이크 초-핑 리
Original assignee: 델 마 파마슈티컬스 인코포레이티드
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2016-09-19
Also published as: EP3071555A4; IL245713A0; CN107529337B; WO2015074025A1; AU2014348232A1; JP2016538574A; CL2016001197A1; CA2931088A1; MX2016006457A; CN107529337A; EP3071555A1; WO2015074025A9

Abstract

디안히드로갈락티톨 제제의 분석을 위한 개선된 분석 방법은 디안히드로갈락티톨의 순도를 구하고 디안히드로갈락티톨 제제의 불순물을 검출할 뿐 아니라, 이러한 여하한 불순물을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 특히, 증발 광산란 검출기 (ELSD)와 함께 HPLC를 이용하며; HPLC에 이어 직렬식 질량 분광법이 실시될 수 있다. 이 방법은 또한 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 적어도 한 가지 특이적인 물질 피크의 예비적 HPLC 수집을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

Description

디안히드로갈락티톨 중의 불순물의 ＨＰＬＣ 분석{HPLC ANALYSIS OF IMPURITIES IN DIANHYDROGALACTITOL}

상호 참조

[0001] 이 출원은 2012년 2월 27일자 미국 가특허출원 No. 61/603,464 (샤오윤 루, 발명의 명칭: "디안히드로갈락티톨 중의 불순물을 분석 및 결정하기 위한 개선된 분석 방법")에 기초한 우선권 주장 출원이자 미국을 지정하여 출원된 2013년 2월 26일자 PCT 출원 No. PCT/IB2013/000793 (샤오윤 루, 발명의 명칭: "디안히드로갈락티톨 중의 불순물을 분석 및 결정하기 위한 개선된 분석 방법")에 기초한 우선권 주장 출원이자 일부계속출원인 2013년 7월 2일자 미국 특허출원 No. 13/933,844 (샤오윤 루, 발명의 명칭: "디안히드로갈락티톨 중의 불순물을 분석 및 결정하기 위한 개선된 분석 방법")에 기초한 우선권 주장 출원이자 일부계속출원인 2013년 11월 18일자 미국 특허출원 No. 14/083,135 (샤오윤 루 및 마이크 리, 발명의 명칭: "디안히드로갈락티톨 중의 불순물을 분석 및 결정하기 위한 개선된 분석 방법")에 기초한 우선권 주장 출원이다. 상기 모든 출원들의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 통합된다.

발명의 분야

[0002] 본 발명은 디안히드로갈락티톨의 개선된 분석 방법, 특히 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 관련된 개선된 분석 방법에 관한 것이다.

[0003] 디안히드로갈락티톨 (1,2:5,6 디안히드로갈락티톨 또는 DAG)은 화학치료 활성을 비롯하여, 유의적인 약리 활성을 갖는 몇몇 헥시톨 또는 헥시톨 유도체의 하나이다. 특히, 디안히드로갈락티톨은 예컨대 본 발명에 참조 병합된 닐센 등의 미국특허 No. 7,157,059에 기재된 바와 같이 화학요법에 사용될 것이 제안된 바 있다.

[0004] 디안히드로갈락티톨은 몇몇 신생물(neoplasms)에 대해 활성이 있다. 그러나, 디안히드로갈락티톨이 치료제로서 성공적으로 사용되기 위해서는, 그 순도가 지극히 높아야하고 불순물의 제거가 필수적이다. 불순물의 존재는 바람직하지 못한 부작용으르 유발할 수 있다. 일례로, 수년 전에, 일반적인 단백질 성분인 아미노산 트립토판 뱃치 중에 불순물이 존재함으로 해서, 심각한 호산구증가 근육통 증후군이 발생하였는데, 이로 인해 다수의 환자가 영구적인 장애를 겪게 되었고 37명 이상이 사망하였다. 이것은 디안히드로갈락티톨과 같은 치료제가 면역계가 약화되거나 간 또는 신장 부전이 있거나 또는 나이 어린 환자들에 사용될 경우 특히 중요한 사항이다. 이러한 환자들은 오염물에 대한 이들의 민감성으로 인해 바람직하지 못한 부작용을 겪을 위험이 훨씬 클 수 있다.

[0005] 디안히드로갈락티톨 제제에서 발견되는 불순물들 중 한 가지는 둘시톨이다. 제조 방법에 따라서는, 디안히드로갈락티톨 제제 중에 다른 불순물도 존재한다.

[0006] 따라서, 디안히드로갈락티톨이 치료 목적으로 투여될 경우 부작용을 유발할 가능성이 낮은, 순도가 더 높은 제제를 제공하기 위해, 디안히드로갈락티톨 제제에 있어서 불순물과 분해 산물을 검출하기 위한 개선된 분석 방법이 요구되고 있다.

발명의 개요

[0007] 이하에 이러한 요구사항을 만족하는, 디안히드로갈락티톨의 순도를 결정하고 디안히드로갈락티톨 제제에 있어서 불순물 및 분해 산물을 검출하기 위한 개선된 분석 방법을 설명한다.

[0008] 일반적으로, 이 분석 방법은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하며, 특히 굴절률(RI: refractive index) 검사와 함께 HPLC를 이용한다.

[0009] 한 가지 별법에서, 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 불순물의 존재여부와 양을 분석하는 분석 방법은 다음 단계들, 즉:

(1) 이동상 구배 용리를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피로 디안히드로갈락티톨 제제를 처리함으로써 디안히드로갈락티톨을 둘시톨 및 상기 제제의 다른 오염물질로부터 분리시켜 디안히드로갈락티톨 제제를 분석하는 단계; 및

(2) 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물을 나타내는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석된 1 이상의 피크의 상대 농도를 구하는 단계

를 포함한다.

[0010] 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물들은: (1) 둘시톨; (2) 둘시톨 이외의 불순물; 및 (3) 디안히드로갈락티톨의 분해 산물 중 적어도 1종일 수 있다.

[0011] 이 방법의 또 다른 별법에서, 용리(elution)는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용한다. 좋기로는, 용리는 약 1.5 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용한다. 더욱 좋기로는, 용리는 약 1 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용하는 것이 바람직하다.

[0012] 이 방법의 또 다른 별법에서 용리는 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드와의 조합 구배를 이용하되 여기서 암모늄 포르메이트와 암모늄 아세테이트의 총 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 좋기로는, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 1.5 mM 내지 약 0.1 mM인 것이 바람직하다. 더욱 좋기로는, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 1 mM 내지 약 0.1 mM인 것이 바람직하다. 일반적으로, 암모늄 히드록사이드 대 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 비율은 용리 개시 무렵 약 100:1에서 용리 말기에는 약 1:100로 변한다.

[0013] 일반적으로, 이 방법에서, 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물을 나타내는 고성능 액체 크로마톡래피에 의해 해상된 1 이상의 피크의 상대 농도를 구하는 단계는 증기광산란 검출기에 의해 수행된다. 일반적으로, 증기광산란 검출기는 전기분무(electrospray) LC/MS와 병용가능하다. 일반적으로, 증기광산란 검출기는 100% 수성 이동상의 증발을 향상시키기 위해 휘발성 용매를 포스트-컬럼 첨가하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이 휘발성 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.

[0014] 또 다른 별법에서는, 전기분무 직렬식 질량 분광계(electrospray tandem mass spectrometer)가 설치되어 ELSD와 함께 HPLC 시스템에 온-라인 연결된다. 일반적으로, 이 별법에서는 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재할 지 모르는 각각의 불순물들에 대한 화학 정보를 제공하는 질량 분광 데이터가 수집된다. 또한, 일반적으로, 이 별법에서는, 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재할 지 모르는 각각의 불순물들에 대한 구조 정보를 제공하는 직렬식 질량 분광 데이터가 수집된다.

[0015] 이 방법은 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 적어도 1개의 특이적인 물질 피크의 예비 HPLC 수집을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 적어도 1개의 물질 피크는 불순물일 수 있다.

[0016] 또 다른 별법에서는, 구배 용리 대신, 등용매 용리(isocratic elution)가 이용될 수 있다. 등용매 용리가 이용되면, 이 방법은 다음의 단계들, 즉:

(1) 등용매 이동상 용리를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피로 디안히드로갈락티톨 제제를 처리함으로써 디안히드로갈락티톨을 둘시톨 및 상기 제제의 다른 오염물질로부터 분리시켜 디안히드로갈락티톨 제제를 분석하는 단계; 및

를 포함한다.

[0017] 이 방법의 또 다른 별법에서, 등용매 용리가 이용될 경우, 등용매 이동상은 NaOH이며, NaOH의 농도는 약 5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 좋기로는, NaOH의 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 더욱 좋기로는, 용리는 NaOH의 농도는 약 1 mM인 것이 바람직하다.

[0018] 또 다른 별법에서, 등용매 용리가 사용될 경우, 등용매 이동상은 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드와의 조합이며, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 5 mM 내지 0.1 mM이다. 좋기로는 암모늄 히드록사이드와 휘발성 암모늄 아세테이트의 총 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM인 것이 바람직하다. 더욱 좋기로는, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 1 mM인 것이 바람직하다. 일반적으로, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 비율은 약 50:50이다.

[0019] 일반적으로, 한 가지 별법에서, 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물을 나타내는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 해상된 1 이상의 피크들의 상대 농도를 구하는 단계는, 전술한 바와 같이 증기광산란 검출기 (ELSD)에 의한다. 일반적으로, 증기광산란 검출기는 전기분무 LC/MS와 병용가능하다. 일반적으로, 증기광산란 검출기는 100% 수성 이동상의 증발을 향상시키기 위해 휘발성 용매를 포스트-컬럼 첨가하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이 휘발성 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.

[0020] 이 별법에서도, 전기분무 직렬식 질량 분광계를 설치하여 ELSD와 함께 HPLC 시스템에 온-라인 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 이 별법에서는 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재할 지 모르는 각각의 불순물들에 대한 화학 정보를 제공하는 질량 분광 데이터가 수집된다. 또한, 일반적으로, 이 별법에서는, 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재할 지 모르는 각각의 불순물들에 대한 구조 정보를 제공하는 직렬식 질량 분광 데이터가 수집된다.

[0021] 본 발명에 따른 방법의 이 별법은 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 적어도 1개의 특이적인 물질 피크의 예비 HPLC 수집을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 적어도 1개의 물질 피크는 불순물일 수 있다.

[0022] 또 다른 별법에서, an analytical method for analyzing the presence 및 quantity of impurities present in a preparation of 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 불순물의 존재여부와 양을 분석하는 분석 방법은 이동상 구배 용리를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 디안히드로갈락티톨 제제를 처리함으로써 디안히드로갈락티톨을 둘시톨 및 상기 제제의 다른 오염물질로부터 분리시켜 디안히드로갈락티톨 제제를 분석하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 고성능 액체 크로마토그래피는 광산란검출법(ELSD)를 이용하는 것이다.

[0023] 일반적으로, HPLC 컬럼은 C18 화합물에 결합되고 루이스산-루이스-염기 화학을 이용한 엔드캡 처리 마감된 실리카겔 컬럼이다.

[0024] 일반적으로, 용리는 95% 물/5% 아세토니트릴 내지 70% 물/30% 아세토니트릴의 구배로 수행하다가 다시 95% 물/5% 아세토니트릴의 구배로 수행한다. 일반적으로, 용리액(eluant)의 변화 시간 스케쥴은 다음과 같다: 0분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15.1분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20.1 내지 35분, 95% 물/5% 아세토니트릴. 일반적으로, 이 방법으로 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 모노에폭사이드 다이머, 및 둘시톨이 검색된다. 좋기로는, 이 방법은 축합산물 및 디안히드로갈락티톨의 다이머도 검색한다.

[0025] 일반적으로, HPLC로부터 결과된 피크들을 LC-MS에 의해 분석한다.

[0026] 일반적으로, 이 방법은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해, 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 화합물을 나타내는 것으로 해석된 1 이상의 피크들의 상대 농도를 구하는 단계를 더 포함한다.

[0027] ELSD에 의한 검출을 위한 한 가지 별법에서, 일반적으로, 컬럼 온도는 약 30℃이다.

[0028] 일반적으로, 유속은 약 0.5 mL/분이다. 일반적으로, ELSD 검출기는 드리프트관(drift tube) 온도 35℃ 및 게인(gain) 400, 2 pps, 45 PSI의 냉각 모드에서 작동된다. 일반적으로, 이 별법에서는, 이동상 A는 물 중 0.05% 포름산인 이동상 A와 100% 메탄올인 이동상 B가 사용된다. 일반적으로, 이들 이동상에서, 용리는 물 중 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 25분, 물 중 0.05% 포름산 90% 및 100% 메탄올 10%에서 25분 내지 25.1분, 물 중 0.05% 포름산 10% 및 100% 메탄올 90%에서 25.1분 내지 35분, 및 물 중 0.05% 포름산 100%에서 35.1분 내지 50분이다.

[0029] 이 방법은 또한 불순물에 대하여 외부보정 스탠다드 곡선(external calibration standard curve)을 작성하는 것을 더 포함할 수 있다. 불순물은 둘시톨, 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 및 디안히드로갈락티톨의 다이머로부터 선택될 수 있다. 이 방법은 디안히드로갈락티톨 레퍼런스 물질의 크로마토그래피에 의해 수립된 보정 스탠다드 곡선을 이용함으로써 미지의 불순물의 함량을 평가할 수 있다.

[0030] HPLC 및 ELSD를 이용하는 또 다른 별법은 이중 용리 시퀀스(dual elution sequence)를 이용한다. 이 이중 용리 시퀀스는 다음과 같다: 용리 시퀀스의 첫 번째 부분은, 물 중 0.05% 포름산 100%에서 0 내지 25분, 물 중 0.05% 포름산 90% 및 메탄올 10%에서 25분 내지 25.1분, 물 중 0.05% 포름산 10% 및 메탄올 90%에서 25.1분 내지 35분, 및 물 중 0.05% 포름산 10%에서 35.1분 내지 50분 및 물 중 0.05% 포름산 100%에서 35.1분 내지 50분으로 용리가 수행되고, 용리 시퀀스의 두 번째 부분에서는 용리가 다음과 같이 수행된다: 0.05% 포름산 100%에서 0 내지 7.5분; 0.05% 포름산 97% 및 메탄올 3%에서 7.5분 내지 7.6분; 0.05% 포름산 100%에서 7.6분 내지 20분. 이 별법에서, 일반적으로 HPLC의 컬럼 온도는 약 30℃, HPLC를 위한 샘플 온도는 약 5℃, HPLC 유속은 약 0.5 mL/분이고, 주사 용량은 약 10-100 μL이다. 이 별법에서, 일반적으로, ELSD의 경우, 게인은 약 400, 트리프트관 온도는 약 45℃, 가스 압력은 약 35 PSI의 질소, 네뷸라이저는 냉각으로 설정하고, 데이터 속도(data rate)는 2 포인트 퍼 세컨드(points per second), 및 레일리(Rayleigh) 인자(factor)는 약 6.0이다. 일반적으로, 이 별법에서, 둘시톨 스탠다드를 0.1, 0.08, 0.05, 0.03, 0.01, 0.005 mg/mL로 사용하여 시스템의 감도와 선형성을 구하였다. 일반적으로, 이 별법에서, 둘시톨의 체류시간은 약 6.4분이고 디안히드로갈락티톨은 약 12.1분이다. 이 별법에서, the amount 및 percentage of a 둘시톨 불순물의 양과 백분율을 HPLC 및 ELSD의 결과로부터 구할 수 있다. 또한, 이 별법에서, 둘시톨 이외의 미지의 불순물의 양과 백분율도 HPLC 및 ELSD의 결과로부터 구할 수 있다.

[0031] 본 발명의 이들 및 기타 특징, 측면 및 장점은 첨부된 도면과 특허청구범위를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다. 첨부된 도면에 관하여 이하에 설명한다:
[0032] 도 1은 디안히드로갈락티톨 제제의 대표적인 HPLC/RI 크로마토그램으로서, 벌크 약물(bulk drug)과 약물 제품(drug product) 중 RRT ~0.6에서 둘시톨과 미지의 관련 물질의 레졸루션을 나타낸다.
[0033] 도 2는 스탠다드로서 디안히드로갈락티톨과 둘시톨, 그리고 대조군으로서 물 블랭크의 레졸루션을 보여주는 대표적인 HPLC 크로마토그램이다; 도 2에서, 디안히드로갈락티톨-둘시톨 스탠다드는 상부 패널에, 물 블랭크는 하부 패널에 나타내었다.
[0034] 도 3은 분해산물로서 모노에폭사이드 및 둘시톨과 함께, 디안히드로갈락티톨 다이머과 축합산물이 존재할 수 있음을 나타내는 검출을 위한 증발 광산란 검출기를 이용한 디안히드로갈락티톨 임상 샘플의 HPLC 크로마토그램이다.
[0035] 도 4는 도 3의 HPLC 크로마토그램의 22.6분에서 발생한 불순물 피크의 질량 분석 프로파일이다.
[0036] 도 5는 이동상 A로서 물 중 0.05% 포름산 및 이동상 B로서 메탄올을 사용하여 실시예 3에서 수행된 바와 같은 디안히드로갈락티톨 샘플의 크로마토그램이다.
[0037] 도 6은 실시예에서 4에서 수행된 바와 같은 블랭크 용액의 크로마토그림의 일례이다.
[0038] 도 7은 실시예 4에서 수행된 바와 같은 0.10% 둘시톨의 크로마토그램의 일례이다.
[0039] 도 8은 실시예 4에서 수행된 바와 같은 테스트 용액의 크로마토그램의 일례이다.

발명의 상세한 설명

[0040] 본 발명은 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 불순물의 존부 및 그 농도를 구하고 디안히드로갈락티톨의 순도를 구하기 위한 개선된 분석 방법에 관한 것이다.

[0041] 디안히드로갈락티톨의 구조는 이하의 화학식 (I)에 도시되어 있다.

(I)

[0042] 디안히드로갈락티톨 제제 중에 존재하는 중요한 불순물들 중 하나는 둘시톨이다. 둘시톨의 구조는 하기 화학식 (II)에 도시되어 있다. 디안히드로갈락티톨 제제에는 다른 기타의 불순물들도 존재하는 것으로 알려져 있다.

(II)

[0043] 디안히드로갈락티톨 제제의 개선된 분석 방법은 증기광산란 검출기 (ELSD)와 함께 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)에 기초한다. 한 가지 별법에서, 이러한 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 모든 유의적인 성분들을 검출 및 동정하기 위해, HPLC를 질량 분광계(mass spectroscopy: MS)와 조합시키기도 한다.

[0044] HPLC의 이론과 실제는 L.R. Snyder 등의 문헌, "Introduction to Modern Liquid Chromatography" (3^rd ed., John Wiley & Sons, New York, 2009)에 잘 설명되어 있다. MS의 이론과 실제는 E. de Hoffmann & V. Stroobant의 문헌, "Mass Spectroscopy: Principles and Applications" (3^rd ed., John Wiley & Sons, New York, 2007)에 설명되어 있다.

[0045] HPLC 방법은 RRT 0.6에서 관찰된 미지의 관련 물질의 레졸루션에 더해, 디안히드로갈락티톨 제제 내의 합성 중간체, 둘시톨의 레졸루션을 입증하였다 (도 1). 도 1은 벌크 약물과 약물 제품에서 RRT ~ 0.6에서의 둘시톨 및 미지의 관련 물질의 레졸루션을 나타내는, 디안히드로갈락티톨 제제의 대표적인 HPLC/RI 크로마토그램이다. 스탠다드에서의 디안히드로갈락티톨 및 둘시톨의 레졸루션, 및 대조를 위한 물 블랭크에서의 레졸루션을 나타내는 대표적인 HLPC 크로마토그램을 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 디안히드로갈락티톨-둘시톨 스탠다드는 상부 패널에, 물 블랭크는 하부 패널에 나타내었다.

[0046] 본 발명은 잠재적인 공-용리(co-eluting) 물질의 레졸루션에 대한 개선된 HPLC 크로마토그래피 조건을 설명한다. 둘시톨 및 기타 관련 불순물과 분해 산물의 레졸루션에 적절한 크로마토그래피 조건을 확인하기 위해, 열에 의한 스트레스를 받은 디안히드로갈락티톨 제품 샘플을 평가한다. 이어서, LC/MS 및 LC/MS/MS를 실시하여 RRT ~ 0.6에서의 미지의 DAG-관련 물질을 특징화시켜 이 미확인 성분의 질량 분광 특성과 화학 구조를 구한다.

[0047] 디안히드로갈락티톨 및 그의 관련 물질을 50 mM NaOH 이동상을 이용한 등용매 용리를 포함하는 HPLC 조건에 의해 분석할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부로서 사용된, 이러한 조건들에 대한 개선에 있어서, 구배 이동상이 이용된다. 한 가지 별법은 농도 구배에 있어서 NaOH의 사용이다. 만일 농도 구배에 NaOH가 사용되면, 일반적으로 용리는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용한다. 좋기로는, 용리는 약 1.5 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용하는 것이 바람직하다. 더욱 좋기로는, 용리는 약 1 mM 내지 약 0.1 mM의 NaOH 구배를 이용하는 것이 바람직하다.

[0048] 또 다른 별법에서, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드와의 조합이 용리액으로서 이용될 수 있다. 이 별법에서, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트이 총 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 좋기로는, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 1.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 더욱 좋기로는, 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드의 총 농도는 약 1 mM 내지 약 0.1 mM이다. 일반적으로, 암모늄 히드록사이드 대 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 비율은 용리 초기 약 100:1에서 용리 말기는 약 1:100으로 가변적이다.

[0049] 기타 구배 용리 계획이 기술 분야에 알려져 있다.

[0059] 일반적으로, 본 발명에 따른 HPLC 분석법에서, 검출은 증기광산란 검출법(evaporative light scattering: ELSD)에 의한다. 증기광산란 검출기(ELSD)는 컬럼 용출물(eluate)을 아토마이즈하여, 결과적인 미립자 성분에 광선을 비춰, 결과적인 산란광을 검출한다. 이론적으로, ELSD는 어떤 비휘발성 성분이든지 모두 검출해낼 수 있다. 비-유색성(non-chromogenic) 화합물의 증기광산란 검출은 HPLC 용리액의 네불라이제이션(nebulization) 및 광산란 검출을 위한 용질 입자들의 아토마이징을 생성하기 위한 이동상 용매의 증발에 기초한다. 이러한 아토마이징 피분석물 용질 입자를 생산하기 위한 용매 증발 공정과 네불라이제이션은 전기분무 LC/MS 공정에 필적한다. 일반적으로, ELSD 검출은 전기분무 LC/MS와 병용가능하다.

[0051] 전기분무 LC/MS 적용과 병용가능한 ELSD 검출을 이용하는 HPLC 방법의 수행은 100% 수성 이동상의 증발을 향상시키기 위한 휘발성 용매의 포스트-컬럼 첨가를 포함한다. 이 휘발성 용매는 일반적으로 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.

[0052] 따라서, 본 발명에 따른 방법에서는 전기분무 직렬식 질량 분광계가 설치되어 ELSD가 구비된 HPLC 시스템에 온-라인으로 연결된다. 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재할 수 있는 각각의 불순물에 대해 분자 정보를 제공하는 질량 분광 데이터 및 화학 구조 정보를 제공하는 직렬식 질량 분광 데이터를 수집할 수 있다. HPLC와 연계된 질량 분광법은 관찰된 각각의 불순물과 분해 산물에 대한 분자 수준의 이온 정보와 일치하는 분자량을 갖는 분자 수준의 이온 정보 및 가능한 화학 구조를 제공해준다.

[0053] 또 다른 별법에서, DAG 제제에 존재하는 불순물들을 비롯한, 특이적인 DAG-관련 물질 피크의 예비적 HPLC 수집이 수행될 수 있다.

[0054] 따라서, 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 불순물의 존재여부와 양을 분석하기 위한 한 가지 분석 방법은 다음 단계들, 즉:

를 포함한다.

[0055] 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물들은: (1) 둘시톨; (2) 둘시톨 이외의 불순물; 및 (3) 디안히드로갈락티톨의 분해 산물 중 적어도 1종일 수 있다.

[0056] 일반적으로, 한가지 별법에서, 이 방법에서는 이동상 구배가 소듐 히드록사이드 구배이다.

[0057] 또 다른 별법에서, 이 방법에서는, 이동상 구배가 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이드와의 조합의 구배이다.

[0058] 일반적으로, 이 방법에서, 검출은 증기광산란에 의한다. 일반적으로, 증기광산란이 이용될 경우, 이 방법은 이동상 성분들의 증발을 향상시키기 위해 휘발성 용매를 포스트-컬럼 첨가하는 단계를 더 포함한다.

[0059] 일반적으로, 본 발명은 전기분무 직렬식 질량 분광법에 의한 고성능 액체 크로마토그래피로부터 용리되는 하나 이상의 피크들을 분석하는 단계를 더 포함한다.

[0060] 한 가지 별법에서, 본 발명은 적어도 1개의 특이적인 DAG-관련 물질 피크의 예비적인 HPLC 수집 단계를 더 포함한다.

[0061] 불순물 또는 분해 산물 (둘시톨 이외)이 존재할 경우, 이 미지의 불순물 또는 분해 산물은 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 및 후속적으로 미지의 고체 샘플을 얻기 위한 적어도 1회의 정제 공정에 의해 동정될 수 있으며, 이어서 상기 샘플은 핵자기공명법(NMR: nuclear magnetic resonance), 질량분광법(MS: mass spectroscopy), 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy), 원소분석법, HPLC에 의한 순도 결정 및 칼 피셔 적정법에 의한 수분함량 결정법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 스탠다드 분석 공정에 의해 특징화되어 동정될 수 있다. 이러한 방법들은 기술 분야에 잘 알려져 있다.

[0062] 또 다른 별법에서, 이 방법은:

를 포함한다.

[0063] 구배 용리를 이용하는 방법에서와 같이, 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 다른 화합물들은: (1) 둘시톨; (2) 둘시톨 이외의 불순물; 및 (3) 디안히드로갈락티톨의 분해 산물 중 적어도 1종일 수 있다.

[0064] 이 별법에서, 등용매 이동상을 이용한 용리는 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과 암모늄 히드록사이ㄷ와의 조합을 이용하는 용리이거나 또는 소듐 히드록사이드를 이용한 용리일 수 있다. 만일 등용매 이동상이 소듐 히드록사이드이면, 일반적으로, NaOH의 농도는 약 5 mM 내지 0.1 mM이다. 좋기로는, NaOH의 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 더욱 좋기로는, NaOH의 농도는 약 1 mM이다. 만일 등용매 이동상이 암모늄 히드록사이드 및 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염과의 조합이면, 암모늄 히드록사이드 및 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 총 농도는 약 5 mM 내지 0.1 mM이다. 좋기로는, 암모늄 히드록사이드 및 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 총 농도는 약 2.5 mM 내지 약 0.1 mM이다. 더욱 좋기로는, 암모늄 히드록사이드 및 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 총 농도는 약 1 mM이다. 일반적으로, 암모늄 히드록사이드 대 암모늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 암모늄염의 비율은 약 50:50이다.

[0065] 레졸루션을 향상시키기 위한 한 가지 별법에서, 변경된 용리 조건을 이용하는 증발 광산란 검출기(ELSD)가 이용된다. 일반적으로 이 방법에서, HPLC 컬럼은 예컨대 YMC C18 컬럼처럼, C18 화합물에 결합되고 루이스산-루이스-염기 화학을 이용한 엔드캡 처리 마감된 실리카겔 컬럼이다. 일반적으로, 용리는 95% 물/5% 아세토니트릴에서 70% 물/30% 아세토니트릴로, 다시 95% 물/5% 아세토니트릴의 구배에서 수행한다. 좋기로는, 용리액 변화를 위한 시간 스케쥴은 다음과 같이 하는 것이 바람직하다: 0분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15.1분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20.1 내지 35분, 95% 물/5% 아세토니트릴. HPLC 방법이 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 모노에폭사이드 다이머, 및 둘시톨을 검출하는 것이 좋다. 더욱 좋기로는, HPLC 방법이 디안히드로갈락티톨의 다이머 및 축합산물도 검출하는 것이 바람직하다.

[0066] 좋기로는, 이 방법의 별법에서, HPLC로부터의 피크들을 LC-MS에 의해 분석하는 것이 바람직하다.

[0067] 또 다른 별법에서, 실시예 3에 나타난 바와 같이, Atlantis HPLC 컬럼이 사용된다. 일반적으로, 이 방법에서, 컬럼 온도는 약 30℃이다. 일반적으로, 이 방법에서, 유속은 약 0.5 mL/분이다. 일반적으로, 이 방법에서, 주사 용량은 약 10 μL 내지 약 100 μL이다. 일반적으로, 이 방법에서, ELSD 검출기가 사용된다. 일반적으로, 이 방법에서, ELSD 검출기는 드리프트관 온도 35℃ 및 게인 400, 2 pps, 45 PSI의 냉각 모드에서 작동된다. 일반적으로, 이 방법에서, 물 중 0.05% 포름산인 이동상 A 및 100% 메탄올인 이동상 B가 사용된다. 일반적으로, 이 방법에서, 용리는 물 중 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 25분, 물 중 0.05% 포름산 90% 및 100% 메탄올 10%에서 25분 내지 25.1분, 물 중 0.05% 포름산 10% 및 100% 메탄올 90%에서 25.1분 내지 35분 및 물 중 0.05% 포름산 100%에서 35.1분 내지 50분에서 수행된다.

[0068] 일반적으로, 이 별법은 불순물에 대하여 외부 보정 스탠다드 곡선을 제작하는 것을 더 포함한다. 불순물은 둘시톨, 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 및 디안히드로갈락티톨의 다이머로 이루어진 군으로부터 선택된 불순물일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이 방법에서, 미지의 불순물의 경우, 이 미지의 불순물의 함량은 디안히드로갈락티톨 레퍼런스 물질의 크로마토그래피에 의해 수립된 보정 스탠다드 곡선을 이용하여 평가할 수 있다.

[0069] 또 다른 별법에서, 실시예 4에 나타난 바와 같이, 전술한 용리 시퀀스 후에, 즉, 물 중 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 25분, 물 중 0.05% 포름산 90% 및 100% 메탄올 10%에서 25분 내지 25.1분, 물 중 0.05% 포름산 10% 및 100% 메탄올 90%에서 25.1분 내지 35분, 및 물 중 0.05% 포름산 100%에서 35.1분 내지 50분에서 용리를 수행한 후, 부가적인 용리 시퀀스를 다음과 같이 수행한다: 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 7.5분; 0.05% 포름산 97% 및 메탄올 3%에서 7.5분 내지 7.6분; 및 0.05% 포름산 100%에서 7.6분 내지 20분. 이 별법에서, 일반적으로, HPLC의 컬럼 온도는 약 30℃, HPLC를 위한 샘플 온도는 약 5℃, HPLC의 유속은 약 0.5 mL/분, 및 주사 용량은 약 100 μL이다. 이 별법에서, 일반적으로, ELSD의 경우, 게인은 약 400, 드리프트관 온도는 약 45℃, 가스 압력은 약 35 PSI의 질소, 네뷸라이저는 냉각 설정하고, 데이터 속도는 2 포인트 퍼 세컨드이고, 레일리 인자는 약 6.0이다. 일반적으로, 이 별법에서는, 시스템의 감도와 선형성을 알아내기 위해 0.005 내지 0.1 mg/mL로 둘시톨 스탠다드가 사용된다. 일반적으로, 이 별버에서, 둘시톨의 체류 시간은 약 6.4분이고 디안히드로갈락티톨의 체류 시간은 약 12.1분이다. 이 별법에서, 둘시톨 불순물의 양과 백분율을 HPLC 및 ELSD의 결과로부터 구할 수 있다. 또한, 이 별법에서, 둘시톨 이외의 미지의 불순물의 양과 백분율도 HPLC 및 ELSD의 결과로부터 구할 수 있다.

[0070] 다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이들 실시예들은 어디까지나 설명 목적을 위하여 제공된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.

실시예

실시예 1

등용매 소듐 히드록사이드 용리를 이용하는 디안히드로갈락티톨 제제의 HPLC 분석

[0071] 이 실시예에 설명된 공정은 굴절률 탐지와 함께 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 디안히드로갈락티톨 약물 제제 내에서 둘시톨 및 관련된 불순물들을 탐지하는데 사용된다.

[0072] 이 공정에서, 샘플들을 5 mg/mL의 표적 농도로 디안히드로갈락티톨과 함께 준비한다. 둘시톨, 디안히드로갈락티톨, 및 관련 불순물들을, 굴절률 검출과 함께 등용매 이동상으로서 50 mM NaOH를 이용하여 음이온 교환 컬럼(Hamilton RCX-10, 250 x 4.1 mm, 7 ㎛)을 이용하여 분리한다. 둘시톨 농도는 외부 레퍼런스 스탠다드를 이용하여 구하고 관련 물질의 함량은 DAG 레퍼런스 스탠다드를 이용하여 평가한다.

[0073] 적절한 HPLC 시스템 및 데이터 획득 시스템은 Agilent Technologies 1200 Series HPLC 시스템 또는 다음이 장착된 등가물이다: Quat 펌프, Model G1311A 또는 등가물; 오토 샘플러, Model 1329A 또는 등가물; RID 검출기, Model 1362A 또는 등가물; 30±3℃로 조절 가능한 컬럼 온도 조절기; 및 탈기장치(degasser), Model G1322 또는 등가물. 컬럼은 Hamilton RCX 음이온 교환 컬럼 250 x 4.1 mm, 7 ㎛, P/N 79440, 또는 등가물이다. 데이터 획득은 ChemStation 및 ChemStore Client/Server 또는 등가 데이터 시스템에 의해 수행한다.

[0074] 다음의 화학물질이 사용된다. 물은 Milli-Q 워터 또는 탈이온수이다. 소듐 히드록사이드는 스탠다드 정제 등급이다. 둘시톨 및 DAG 레퍼런스 스탠다드의 순도는 > 98.0%이다.

[0075] 이동상(50 mM NaOH)으로서, 2.0 g NaOH를 물 1 리터에 용해시킨다. 이 용액을 0.45-㎛ 필터를 통해 여과시킨다. 이동상은 실온에서 1 개월까지 보관가능하다. 둘시톨 레퍼런스 원액으로서 (명목 500 ㎍/mL), 25 mg의 둘시톨 레퍼런스 스탠다드를 50-mL 메스 플라스크(volumetric flask)에 정확히 칭량하여 첨가한다. 이 둘시톨을 탈이온수로 적정 부피로 희석하고 잘 혼합한다. 제조된 원액은 2-8℃에서 3일까지 보관할 수 있다. DAG 레퍼런스 원액으로서 (명목 500 ㎍/mL), 25 mg의 DAG 레퍼런스 스탠다드를 50-mL 메스 플라스크에 정확히 칭량하여 첨가한다. DAG를 탈이온수로 적정 부피로 희석하고 잘 혼합한다. 제조된 원액은 2-8℃에서 3일까지 보관할 수 있다. 둘시톨-DAG 스탠다드 용액으로서 (둘시톨 50 ㎍/mL + DAG 50 ㎍/mL; 각각 5 mg/mL DAG 1%로 사용됨), 1.0 ml의 둘시톨 원액 및 1.0 ml의 DAG 원액을 각각 정량적으로 10-mL 메스 플라스크에 칭량하여 첨가하고, 물로 적정 부피가 되도록 희석한 다음 잘 혼합한다.

[0076] API 샘플 (명목 1 mg/mL)로부터의 DAG 샘플 제제로서, DAG의 API 샘플 약 25 mg을 청정 25-mL 메스 플라스크에 정확히 칭량하여 첨가한다. DAG API 샘플을 약 5 mL의 탈이온수에 용해시키고, 탈이온수로 적정 부피로 희석 및 혼합한다. 테스트 샘플 1 내지 2 mL의 분주액을 HPLC 바이알에 옮긴다. 조제된 샘플들은 2-8℃에서 2일까지 보관가능하다.

[0077] API 샘플용 DAG 샘플 조제(명목 5 mg/mL)를 위해, 약 50 mg의 API 샘플을 청정 10-mL 메스 플라스크에 정확히 칭량하여 첨가한다. DAG API 샘플을 약 5 mL의 물에 용해시키고, 물로 적정 용량으로 희석 및 혼합한다.

[0078] 동결건조된 (40 mg/바이알) 샘플로부터 DAG 샘플 조제를 위해, 샘플이 보관된 냉장고로부터 샘플을 꺼내어 밀봉을 제거한다. 5.0 mL 부피의 물을 정량적으로 옮겨 담고 용액을 혼합하여 DAG를 용해시켜, 8 mg/mL 용액을 얻는다. 재조성된 용액 1.0 g 분주액을 탈이온수를 이용하여 8.0 g으로 희석 및 혼합한다. 테스트 샘플 1 내지 2 mL의의 추가 분주액을 HPLC 바이알에 옮겨 담는다. 조제된 샘플은 2-8℃에서 2일까지 보관가능하다.

[0079] 동결건조 분말 (40 mg/바이알)을 이용하여 약물 제품용 DAG 샘플 조제(명목 5 mg/mL)를 위해, 바이알의 마개를 세척 및 제거한다. 동결건조된 바이알을 8.0 mL 물로 재조성하여 5 mg/mL 용액을 만든다. 1 내지 2 mL의 분주액을 HPLC 바이알에 옮겨 담는다. 샘플들을 2개씩 제조한다 (2개의 바이알을 이용함). 제조된 샘플들은 2-8℃에서 24시간까지 보관가능하다.

[0080] HPLC 분석을 위해, HPLC 시스템을 켜고 적어도 20분간 검출기를 예열시킨다. 필요한 경우, 상기와 같이 제조된 HPLC 이동상을 적절한 용매 주입구에 넣는다. 용매 라인을 이동상으로 프라임시킨다. 적어도 30분간 1.5 mL/분의 유속으로 HPLC 이동상을 이용하여 시스템과 컬럼을 평형시킨다. 샘플 분석 시퀀스를 생성한다. 일단 시스템이 적절히 확인되면, 물 블랭크를 주입하고 이어서 스탠다드를 주입한 다음 샘플을 주입한다. 둘시톨-DAG 스탠다드를, 샘플 매 10회 주입 후에 삽입하고 실시 말기 마지막 브래케팅 스탠다드(bracketing standard)를 삽입한다. 적절한 샘플 분석 시퀀스를 표 1에 나타내었다.

[0081] 샘플을 RID를 이용하여 분석한다. 전술한 바와 같이, 적절한 컬럼은 Hamilton RCX 이온 교환 컬럼 (250 x 4.1 mm, 7 ㎛), P/N 79440 또는 등가물이다. 이동상은 탈이온수 중 50 mM NaOH이다(등용매 용리). 유속은 1.5 ml/분이다. 컬럼 온도는 30℃이다. 주입 용량은 50 μL이다. 검출은 35℃에서 RID에 의한다. 런타임은 8분이다.

[0082] 크로바토그램의 분석 및 통합을 위해, HPLC 소프트웨어를 사용한다. 블랭크, 샘플 및 테스트 스탠다드에 대한 크로마토그램을 점검 및 비교한다. 몇몇 피크들의 수동 통합과 어싸인먼트가 필요할 수 있다. 기울기 민감도, 피크 너비, 거부를 위한 피크 높이 역치, 숄더 피크의 통합 유형, 베이스라인 및 분할 피크, 그 리고 기타 변수들과 같은 통합 변수들을 조정하여 적절한 통합을 달성하고 이들 변수들의 값을 기록하여 모든 샘플과 스탠다드에 적용한다.

[0083] 시스템의 적정성은 다음과 같이 평가한다. 둘시톨-DAG 스탠다드 용액의 6개의 복제된 주입을 표 2의 크로마토그래피 실시 요건을 이용하여 평가한다.

[0084] 브래케팅 스탠다드 용액에서의 둘시톨 및 DAG 피크 면적은 앞서의 SST 주입에서의 각각의 평균 피크 면적의 80% 내지 120%여야 한다. 하나의 브래케팅 스탠다드가 이 기준을 만족하지 못하면, 최후 통과 브래케팅 스탠다드 후에 분석된 샘플은 재분석하여야 한다.

[0085] 데이터 분석에서, 상대 피크 면적 = (피크 면적/총 피크 면적) x 100이고, 여기서, "피크 면적"은 개별적인 피크 면적이며 "총 피크 면적"은 모든 피크들의 피크 면적의 합이다.

[0086] 둘시톨 농도는 다음과 같이 계산한다: 둘시톨 (Cu, ㎍/mL) = Cs x 평균 샘플 피크 면적 / Dul-DAG 스탠다드 주입의 평균 둘시톨 피크 면적, 여기서 Cs는 둘시톨 농도로서 ㎍/mL 단위이다.

[0087] DAG 약물 물질 또는 약물 제품 중의 둘시톨 함량 (wt %)는 다음과 같이 계산한다: 둘시톨 wt % = Cu (㎍/mL) /1000 / SC (mg/mL) x 100%, 여기서 Cu는 상기와 같이 계산된 둘시톨 농도 (㎍/mL)이고, SC는 약물 물질 또는 약물 제품용으로 제조된 샘플 농도(mg/mL)이다. 만일 둘시톨이 존재하면, 둘시톨의 중량 백분율이 보고되며, 0.05% 이상이면; 가장 근사한 0.01%로 보고된다.

[0088] 만일 둘시톨 이외의 미지의 또는 이전의 미확인 불순물이 DAG 제제에 존재하면, 그의 농도는 다음과 같이 계산된다: 미지의 불순물 농도(㎍/mL) = Cs x 평균 샘플 피크 면적 / Dul-DAG 스탠다드 주입의 평균 DAG 피크 면적. 존재할 경우, 미지의 불순물 중량 백분율은 다음과 같이 계산된다: Cu (㎍/mL) /1000 / SC (mg/mL) x 100%, 여기서 Cu = 전술한 바와 같이 계산된 미지의 농도 (㎍/mL)이고, SC = 약물 물질에 관해 8.2.2에 제조되거나 또는 약물 제품에 대해 8.2.2.에 제조된 샘플 농도(mg/mL) 이다. 각각의 미지의 불순물은 존재할 경우, 만일 0.05% 이상이면 보고되며; 가장 근사한 0.01%로 보고된다.

[0089] 중량 백분율로 표시되는 어세이 결과를 각 샘플 및 이중 샘플(duplicate samples)에 대해서 계산한다.

실시예 2

물/ 아세토니트릴 구배를 이용하는 증발 광산란 검출기를 이용한 HPLC 분석

[0090] 불순물의 레졸루션을 향상시키기 위해, 후술하는 바와 같이 물/아세토니트릴 구배에 의해 증발 광산란 검출기(ELSD)를 이용하는 또 다른 HPLC 분석법을 이용하였다.

[0091] 굴절률(refractive index: RI) 검출기의 제한으로 인해, HPLC/RI 방법은 신뢰할만한 불순물 프로파일 데이터를 얻기에 충분한 특이성을 갖지는 않으며, 이로 인해 환자들이 알려지지 않거나 또는 불완전하게 특징화된 허용불가능한 수준의 불순물에 노출될 위험이 있다. 이러한 우려를 불식시키기 위해, 디안히드로갈락티톨 약물질 또는 약물 제품에서 발견되는 불순물을 탐지하는데 있어서, Agilent 사가 제조한 증발 광산란 검출기(ELSD)와 같은 보다 민감한 검출기를 HPLC 시스템과 연계적으로 사용하였다.

[0092] 예를 들어, 하기 표 3에 명시된 구배로 YMC C18 컬럼을 이용하여 HPLC/ELSD에 의해 DAG 샘플을 분석하였다:

[0093] 크로마토그램 (도 3)에 나타나 있는 바와 같이, 둘시톨은 체류 시간4.5분에서 용리되었다. 둘시톨 직후에 용리된 피크들은 표 4에 요약되니 LC-MS 데이터로부터 지지되는 바와 같이, 모노에폭사이드 관련 화합물들인 것으로 동정되었다. 11.46분에서 관찰된 피크는 아마도 DAG 다이머이며 22.6분에서 용리된 피크는 LC-MS 271, 357, 417, 512 m/z의 다중 피크 및 축합산물일 수 있는 다른 피크를 나타내는 듯 하다 (도 4). 이들 데이터는 이전의 연구에 의해 예상되었던 불순물 프로파일과 일치한다. 예상했던 대로, 모노에폭사이드 및 둘시톨은 이 방법으로 얻어진 2가지 주요 분해산물이다.

실시예 3

모노에폭사이드 피크의 레졸루션을 향상시키기 위한 물/ 메탄오로 구배에서 포름산을 이용한 HPLC 분석

[0094] 모노에폭사이드 피크의 레졸루션을 향상시키기 위해, 새로운 방법을 개발하였다. 이 새로운 방법에는 다음의 파라미터들이 이용되었다: 컬럼은 Atlantis C18, 250 x 4.6mm, 5μm이었다. 컬럼 온도는 30℃였다. 유속은 0.5 mL/분이었다. 주사 용량은 100 μL였다. ELSD 검출기는 드리프트관 온도 35℃ 및 게인 400, 2 pps, 45 PSI의 냉각 모드에서 작동하였다. 이동상 A는 물 중 0.05% 포름산이었다. 이동상 B는 100% 메탄올이었다. 구배는 표 5에 나타나 있는 바와 같다:

[0095] 초기 불순물에 대해 보다 나은 레졸루션이 관찰되었다 (도 5 하단의 DAG 샘플의 크로마토그램 참조). 피크 2 표지된 둘시톨은 체류시간 6.26분 또는 상대 체류시간 (RRT: relative retention time) 0.59에서 용리되었다. 디안히드로갈락티톨은 10.86분에서 용리되었다.

[0096] ELSD 반응은 선형이 아니기 때문에, 테스트된 디안히드로갈락티톨 샘플 중의 불순물 함량을 알아내기 위해서는 둘시톨과 같은 기지의 불순물에 대한 외부 보정 스탠다드 곡선이 요구된다. 디안히드로갈락티톨 샘플 내에 함유된 미지의 불순물의 경우, 이러한 미지의 불순물 함량은 디안히드로갈락티톨 레퍼런스 물질의 크로마토그래피에 의해 수립된 보정 스탠다드 곡선을 이용하여 평가할 수 있다.

실시예 4

이중 구배 HPLC 용리를 이용한 불순물의 검출 또는 탐지를 위한 보다 개선된 방법

[0097] 디안히드로갈락티톨 중의 불순물을 검출 또는 탐지하기 위한 보다 개선된 분석 방법은 HPLC와 ELSD를 이용하되 HPLC에서 이중 구배 용리를 이용한다. 이 방법에 대하여 이하에 설명한다.

[0098] 이 분석 방법에서, 다음의 재료와 장비를 사용한다: Atlantis C18, 250 x 4.6-mm, 5-μm HPLC 컬럼; 사중 또는 이중 HPLC 펌프; 증발 광산란 검출기(ELSD); 통합장치 또는 컴퓨터-기반 분석 시스템; 보정된 분석용 저울; 클래스 A 볼륨 플라스크 및 피펫. 다음의 시약과 스탠다드를 사용한다: 전술한 바와 같은 둘리톨 레퍼런스 스탠다드; HPLC 등급 물; HPLC 등급 또는 동급의 포름산 (FA); HPLC 등급 또는 동급의 아세토니트릴 (ACN); 및 HPLC 등급 또는 동급의 메탄올 (MeOH).

[0099] 이 방법에 사용되는 용액에 대해, 분석에 필요하게 용량을 적절히 계량할 수 있다. 모든 이동상은 여과하는 것이 중요하다. 여과 장치 내의 소결 유리가 ELSD에서 감도를 간섭할 수 있는 완충물질의 소스가 될 수 있다. 모든 여과 장비는 Milli-Q 등급 물로 철저히 세척하여야 한다. 이를 수행하기 위해, 약 500의 Milli-Q 등급 물을 여과 장치를 통해 여과시킨다. 물을 폐기한 다음 이동상을 여과한다.

[0100] 테스트 용액 제제는 적절한 PPE(장갑, 실험복 및 안전 안경)를 이용하여 흄 후드(fume hood)에서 만든다. 테스트 용액 제제는 처분을 위해 흄 후드에서 보관하고 적절히 표식을 붙인다.

[0101] 이동상 A는 1000 mL의 물에 0.5 mL의 포름산을 피펫 첨가하고 잘 혼합하여 만든다. 이동상 A를 여과하고 가스 제거(degassed)한다.

[0102] 이동상 B는 MeOH이다. 이동상 B를 여과하고 가스 제거한다

[0103] 희석액 A는 물이다. 희석액 B는 물 180 mL와 ACN 20 mL를 혼합하고 잘 섞어서 만든다.

[0104] 스탠다드 및 샘플 용액 제제에 관하여 이하에 설명한다. 블랭크 용액은 물이다. 둘시톨 원액은 100 mg의 둘시톨 레퍼런스 스탠다드를 20 mL 메스 플라스크에 정확히 옮겨 담아 제조한다. 약 15 mL의 희석액 B를 첨가하고 초음파처리하여 용해시킨다. 용액을 실온으로 냉각시키고 희석액 B를 이용하여 희석 및 잘 혼합한다(5 mg/mL). 다음의 스탠다드 용액을 제조한다: 0.2, 0.1, 0.08, 0.05, 0.03, 0.01 및 0.005 mg/mL (시스템 감도 용액). 50-mL 메스 플라스크에 둘시톨 원액 2.0 mL를 피펫팅 첨가하여 4.0% 스탠다드 용액을 제조한다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.2 mg/mL). 10-mL 메스 플라스크에 4.0% 스탠다드 용액 5.0 mL를 피펫팅 첨가하여 2.0% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.10 mg/mL). 10-mL 메스 플라스크에 4.0% 스탠다드 용액 4.0 mL를 피펫팅 첨가하여 1.6% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.08 mg/mL). 10-mL 메스 플라스크에 4.0% 스탠다드 용액 2.5 mL를 피펫팅 첨가하여 1.0% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.05 mg/mL). 20-mL 메스 플라스크에 4.0% 스탠다드 용액 3.0 mL를 피펫팅 첨가하여 0.60% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.30 mg/mL). 20-mL 메스 플라스크에 4.0% 스탠다드 용액 1.0 mL를 피펫팅 첨가하여 0.20% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.01 mg/mL). 10-mL 메스 플라스크에 0.20% 스탠다드 용액 5.0 mL를 피펫팅 첨가하여 0.10% 스탠다드 용액을 만든다. 이 용액을 물로 부피 희석하고 잘 혼합한다 (0.005 mg/mL).

[0105] 테스트 샘플 작업 용액을 이중으로 만든다(A 및 B). 샘플 주입은 샘플 용액 제조 15분 이내에 수행되어야 한다. 몇몇 경우, 오버로드된 불순물을 정량하기 위해, 샘플 희석이 필요할 수 있다.

[0106] 샘플 제조를 위해, 약 50 mg의 테스트 샘플을 10-mL 메스 플라스크에 정확히 옮긴다. 테스트 샘플을 물에 용해시켜 부피 희석하고 잘 혼합한다 (5 mg/mL).

[0107] HPLC 작업 조건은 다음과 같다: 컬럼은 Atlantis C18 250 x 4.6 mm, 5μm HPLC 컬럼이다. 이동상 A는 물 중 0.05% FA이다. 이동상 B는 MeOH이다. 구배 A 및 B는 표 6에 설명되어 있다. 컬럼 온도는 30℃이다. 샘플 온도는 5℃이다. 유속은 0.5 mL/분이다. 주사 용량은 100 μL이다. 런 타임은 구배 A의 경우 50분이고 구비 B의 경우 20분이다.

[0108] ELSD 작업 조건은 다음과 같다: 게인은 400이다. 드리프트관 온도는 45℃이다. 가스 압력(질소)는 35 PSI이다. 네뷸라이저는 냉각 설정한다. 데이타 속도는 2 포인트 퍼 세컨드이다. 검출기에 직접 설정한 레일리 인자는 6.0이다.

[0109] 주입 시퀀스를 표 7에 나타내었다. 블랭크 주입은 안정하고 재생가능한 베이스라인이 얻어질 때까지 반복한다.

[0110] 부가적인 테스트 샘플 주입은 필요에 따라 추가할 수 있다. 0.20% 스탠다드 용액 체크 주사를 반복하기 전에 6회 미만의 테스트 샘플 용액 주사를 실시한다.

[0111] 평가를 위해, 모든 피크들은 검출된 미지의 불순물들과 통합되어야 한다. 베이스라인 노이즈가 문제가 될 경우, 검출기로부터 폐기물을 적절히 배출시키도록 한다. ELSD로부터 폐기물을 배수시키는 관 내부에 어떠한 액체도 축적되지 않도록 점검할 필요가 있을 수 있다. 관의 위치는 필요에 따라 교정하여야 한다. 만일 폐기물이 적절히 배출되었는데 베이스라인 노이즈가 문제될 경우, 검출기를 세척할 수 있다. 필요에 따라, 분석 전에 다음의 세척 방법을 이용할 수 있다. 세척을 위한 HPLC 조건은 다음과 같다: 기기로부터 컬럼을 제거하고 유니온(union)을 사용한다. 이동상은 100% H₂O (등용매 100%)이다. 유속은 분 당 1.0 mL이다. 컬럼 온도는 주변 온도이다. 런 타임은 60분이다. ELSD 작업 조건은 다음과 같다: 게인은 50이다. 드리프트관 온도는 100℃이다. 가스 압력(질소)는 50 PSI이다. 네뷸라이저는 75%에서 가열로 설정한다.

[0112] 일반적인 체류 시간을 표 8에 나타내었다. 표 8에서, "DAG"는 디안히드로갈락티톨이다. 이 방법에서 테스트 샘플 중의 DAG은 정량되지 않는다. DAG는 필요한 DAG의 농도로 인해 넓은 피크로서 관찰된다. 샘플 용액 중의 DAG의 체류 시간은 대략 10 내지 13분이다.

[0113] 도 6은 블랭크 용액의 크로마토그램의 일례이다.

[0114] 도 7은 0.10% 스탠다드 용액 (시스템 감도용 용액)의 크로마토그램의 일례이다.

[0115] 도 8은 테스트 용액의 크로마토그램의 일례이다.

[0116] 시스템 적합성 요구 사항은 다음과 같다. 블랭크 용액 주입을 위해, 둘시톨 피크 또는 여타 공지의 불순물의 체류 시간에는 어떠한 간섭 피크도 관찰되어서는 안된다. 안정적이고 재생가능한 베이스라인이 관찰되어야 한다; 이 조건이 만족될 때까지 블랭크 용액을 지속적으로 주입한다. 시스템 민감성을 위해, 0.10% 스탠다드 용액 주입 후의 둘시톨 피크를 관찰하여야 한다. 둘시톨 피크에 있어서 시그널-대-노이즈 비율을 보고하여야 한다. 이동상의 오염이 의심되면(즉 베이스라인 노이즈가 1.0 LSU보다 클 경우) 또는 둘시톨 피크가 관찰되지 않을 경우, 이동상을 다시 만들거나 전술한 세척 공정을 실시하여야 한다. 0.20% 스탠다드 용액의 최초 및 최후 주입을 위한 둘시톨 피크의 USP 테일링 인자는 2.0 이하이다. 정확성을 기하기 위해, 5회 주사에 있어서 피크 면적의 로그에 대한 % RSD를 계산한다. % RSD는 15% 이하여야 한다.

[0117] 계산을 위해, 블랭크에 기여하지 않은 모든 피크들은 통합하여야 한다. 둘시톨에 대하여 0.10% 내지 2.0% 스탠다드 용액에 대한 반응 대수(logarithm) 대 농도 대수(0.20% 스탠다드를 5회 정밀 주사하는 것 포함)를 플롯팅한다. 상관계수(r)는 선형성 곡선의 경우 0.98 이상이어야 한다. 곡선으로부터 기울기와 절편을 구한다. 둘시톨에 대한 선형성 곡선을 이용하여 샘플 내 미지물질 및 둘시톨 불순물의 농도를 mg/mL 단위로 구한다.

[0118] 샘플 내 개별적인 미지의 불순물을 알아내기 위해, 전술한 바와 같이, 둘시톨에 대한 선형성 곡선으로부터 기울기와 절편을 이용한다. 미지물질의 로그(면적 반응)을 이용하여, 미지물질의 로그[농도]를 다음과 같이 방정식 (1)을 이용하여 구한다:

(1)

[0119] 미지의 불순물의 양 (mg/mL 단위)을 다음과 같이 방정식 (2)를 이용하여 구한다:

(2).

[0120] 미지의 불순물의 백분율은 다음과 같이 방정식 (3)을 이용하여 구한다:

(3).

[0121] 별법으로, 둘시톨 스탠다드를 이용한 정량은 Empower (Waters Corp)의 로그-로그 선형 함수를 이용하여 형성할 수 있다.

[0122] Similar 샘플 내 둘시톨 불순물을 알아내기 위해, 방정식, 특히 방정식 (4)-(6)을 이용한다.

[0123] 둘시톨에 대한 로그 [면적 반응], 둘시톨에 대한 로그 [농도]는 방정식 (4)를 이용하여 구한다:

(4).

[0124] 둘시톨 불순물의 농도 (mg/mL 단위)는 방정식 (5)를 이용하여 구한다:

(5).

[0125] 둘시톨 불순물의 백분율은 방정식 (6)을 이용하여 구한다:

(3).

발명의 장점

[0126] 본 발명은 둘시톨과 미지의 불순물을 비롯한, 디안히드로갈락티톨 제제 내에 존재하는 불순물을 검출 및 정량하기 위한 개선된 분석 방법 및 디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 미지의 불순물들을 분리 및 동정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 의약 용도에 적합한 고순도의 디안히드로갈락티톨의 대규모 제조를 가능케 하며 의약 용도로 의도된 디안히드로갈락티톨 제제 내의 불순물의 존재로 인해 야기되는 심각한 부작용 가능성을 감소시켜 준다.

[0127] 본 발명에 따른 방법은 디안히드로갈락티톨 제제의 분석과 디안히드로갈락티톨 제제 내의 불순물의 탐지 및 정량에 있어서 산업적 응용성을 갖는다.

[0128] 값(values)의 범위와 관련하여, 본 발명은 그 문맥이 달리 명백히 반대 의미를 나타내지 않는 한, 해당 범위의 상한값과 하한값 사이의 각각의 개재 값들을 포함하되, 상기 개재 값들은 하한값 단위의 적어도 10분의 1까지의 값일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 그 문맥이 달리 명백히 반대 의미를 나타내지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 중 일방 또는 양방을 모두 포함하여 그 사이에 개재하는 모든 값들을 포괄한다.

[0129] 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어의 의미는 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자가 공통적으로 이해하는 그런 의미이다. 통상의 기술자는 또한 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료들 역시 본 발명을 실시하거나 테스트하는데 이용될 수 있음을 이해할 것이다.

[0130] 본 명세서에서 논의된 간행물과 특허문헌들은 오로지 본 출원의 출원일 전에 제공된 것들에 한한다. 이들 인용문헌들 중 어느 것에 의해서도, 본 발명이 그러한 간행물보다 선행 발명으로서의 지위가 없다고 인정되는 것은 아니다. 또한, 제시된 간행일은 실제 간행일과 다를 수 있으며 그 경우 별도 확인을 거칠 필요있을 수 있다.

[0131] 간행된 특허, 특허출원 및 참조 문헌 뿐 아니라 이들 간행된 문헌에 병합된 간행물들을 비롯하여 본 명세서에서 인용된 모든 간행물들은 본 발명에 참조 병합된다. 그러나, 참조 병합된 간행물이 간행될 것이라는 정보를 언급하는 경우에는, 본 출원인들은 본 출원의 출원일 이후에 간행된 그러한 정보는 선행기술로서 인정하지 않는 바이다.

[0132] 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형의 단어는 복수형의 의미도 포괄한다. 예를 들어, "a," "an," 및 "the"는 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수형도 포함한다. 또한, 어떤 일련의 시리즈의 요소들에 선행하는 "적어도"라는 용어는 그 시리즈 중의 모든 요소들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에 특히 개시되지 않은 어떠한 요소 또는 요소들, 제한, 또는 제한사항이 부재하여도 적절히 실시될 수 있다. 그러므로, 예컨대, "포함하는", "비롯한", "함유하는" 등의 표현은 제한 없이 확장적으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현들은 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아니며, 이러한 용어와 표현을 사용함에 있어서, 장래 나타나거나 설명될 여하한 등가물 또는 그의 일부를 배제하는 것이 아니며, 다양한 변형이 본 발명의 특허청구범위 내에서 가능함을 이해하여야 한다. 따라서, 비록 바람직한 구체예들과 임의의 특성에 의해 본 발명을 특별히 이제까지 설명하였으나, 통상의 기술자들은 본 명세서에 개시된 본 발명을 변형 및 변경시킬 수 있으며, 이러한 변형과 변경 역시 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다. 이제까지 본 발명을 포괄적으로 그리고 일반적으로 설명하여 왔다. 본 발명의 일반적인 개시 범위 내에 속하는 보다 좁은 종(species) 및 아속(subgeneric) 그루핑 각각 역시 본 발명의 일부를 구성한다. 여기에는 제외된 물질이 특히 그 안에 있는지 여부와 관계없이, 해당 속으로부터 어떤 물질을 배제한다는 단서 또는 네거티브 한정을 갖는 각 발명의 일반적 설명이 포함된다. 또한, 본 발명의 특성 또는 측면들이 마쿠쉬 그룹 표현으로 설명될 경우, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 마쿠쉬 그룹의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 서브그룹의 관점에서도 같은 취지로 설명되는 것임을 이해할 것이다. 또한 전술한 설명은 어디까지나 예시적인 것으로서, 제한적이 아니라는 것도 이해되어야 한다. 통상의 기술자라면 본 발명의 설명을 참조함으로써 유사한 많은 구체예들을 상정할 수 있다. 그러므로 본 발명의 범위는 전술한 특정 설명을 기준으로 정해지는 것이 아니라, 첨부된 특허청구범위를 참조로 결정되는 것이며, 이러한 청구범위가 주장하는 것과 동등한 전 범위가 이에 포괄된다. 통상의 기술자라면 일상적인 실험만으로도, 본 명세서에 설명된 본 발명의 특정 구체예들의 다른 많은 등가물이 가능함을 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 이러한 등가물 역시 첨부된 특허청구범위에 포괄되도록 의도된다.

Claims

디안히드로갈락티톨 제제에 존재하는 불순물의 존재여부와 양을 분석하는 분석 방법으로서:
이동상 구배 용리를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼 상에서 HPLC로 디안히드로갈락티톨 제제를 처리함으로써 디안히드로갈락티톨을 둘시톨 및 상기 제제의 다른 오염물질로부터 분리시켜 디안히드로갈락티톨 제제를 분석하는 단계를 포함하되;
고성능 액체 크로마토그래피는 증발 광산란 검출기(ELSD: evaporative light scattering detection)를 이용하는 것인 분석 방법.
제1항에 있어서, HPLC 컬럼은 C18 화합물에 결합되고 루이스산-루이스-염기 화학을 이용하여 엔드캡 처리 마감된 실리카겔 컬럼인 것인 분석 방법.
제1항에 있어서, 용리는 95% 물/5% 아세토니트릴에서 70% 물/30% 아세토니트릴로, 다시 95% 물/5% 아세토니트릴의 구배를 이용하는 것인 분석 방법.
제3항에 있어서, 용리액의 시간 변화 스케쥴은 다음과 같은 것인 분석 방법: 0분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15분, 95% 물/5% 아세토니트릴; 15.1분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20분, 70% 물/30% 아세토니트릴; 20.1 내지 35분, 95% 물/5% 아세토니트릴.
제1항에 있어서, 상기 방법은 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 모노에폭사이드 다이머, 및 둘시톨을 검출하는 것인 분석 방법.
제5항에 있어서, 상기방법은 디안히드로갈락티톨의 다이머 및 축합산물도 검출하는 것인 방법.
제1항에 있어서, HPLC로부터 얻어진 피크들은 LC-MS에 의해 분석되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 디안히드로갈락티톨 자체가 아닌 화합물들을 나타내는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 해상된 1 이상의 피크들의 상대 농도를 구하는 단계를 추가로 포함한느 것인 방법.
제1항에 있어서, 컬럼 온도는 약 30℃인 것인 방법.
제1항에 있어서, 유속은 약 0.5 mL/분인 것인 방법
제1항에 있어서, LSD 검출기는 드리프트관 온도 35℃ 및 게인 400, 2 pps, 45 PSI에서 쿨링 모드로 작동되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 물 중 0.05% 포름산인 이동상 A 및 100% 메탄올인 이동상 B가 사용되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 물 중 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 25분, 물 중 0.05% 포름산 90% 및 100% 메탄올 10%에서 25분 내지 25.1분, 물 중 0.05% 포름산 10% 및 100% 메탄올 90%에서 25.1분 내지 35분, 및 물 중 0.05% 포름산 100%에서 35.1분 내지 50분 동안 용리를 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 불순물에 대한 외부 보정 스탠다드 곡선을 제작하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 불순물에 대한 외부 보정 스탠다드 곡선을 제작하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 불순물은 둘시톨, 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 및 디안히드로갈락티톨의 다이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 불순물은 둘시톨, 디안히드로갈락티톨의 모노에폭사이드 분해산물, 및 디안히드로갈락티톨의 다이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 미지의 불순물의 경우, 미지의 불순물의 함량은 디안히드로갈락티톨 레퍼런스 물질의 크로마토그래피에 의해 수립된 보정 스탠다드 곡선을 이용하여 평가되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 미지의 불순물의 경우, 미지의 불순물의 함량은 디안히드로갈락티톨 레퍼런스 물질의 크로마토그래피에 의해 수립된 보정 스탠다드 곡선을 이용하여 평가되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 용리 시퀀스에 이어서, 다음과 같은 부가적인 용리 시퀀스가 수행되는 것인 방법: 0.05% 포름산 100%에서 0분 내지 7.5분; 0.05% 포름산 97% 및 메탄올 3%에서 7.5분 내지 7.6분; 0.05% 포름산 100%에서 7.6분 내지 20분.
제20항에 있어서, HPLC의 컬럼 온도는 약 30℃, HPLC를 위한 샘플 온도는 약 5℃, HPLC 유속은 약 0.5 mL/분, 주사 용량은 약 10-100 μL인 것인 방법.
제20항에 있어서, ELSD의 경우, 게인은 약 400, 드리프트관 온도는 약 45℃, 가스 압력은 약 35 PSI의 질소이고, 네뷸라이저는 냉각 설정되며, 데이터 속도는 2 포인트 퍼 세컨드이고 레일리 인자는 약 6.0인 것인 방법.
제20항에 있어서, 2.0% 둘시톨, 1.6% 둘시톨, 1.0% 둘시톨, 0.60% 둘시톨, 0.20% 둘시톨, 및 0.10% 둘시톨 스탠다드들을 이용하여 시스템의 감도와 선형성을 알아내는 것인 방법.
제20항에 있어서, 둘시톨의 체류시간은 약 6.4분이고 디안히드로갈락티톨의 체류시간은 약 12.1분인 것인 방법.
제20항에 있어서, 둘시톨 불순물의 양과 백분율은 HPLC와 ELSD의 결과로부터 구하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 둘시톨 이외의 미지의 불순물의 양과 백분율은 HPLC와 ELSD의 결과로부터 구하는 것인 방법.