JPH04297868A - オリゴ糖の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、充填剤として炭素系粒
子を含む液体クロマトグラフィーカラムを用いるオリゴ
糖の分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、オリゴ糖は甘味料の他、機能性を
持つ食品素材として注目されており、ビフィズス菌増殖
活性（整腸効果）、抗う触活性、低カロリー性、コレス
テロール値抑制作用、血糖値調整作用、免疫促進活性等
の生理活性機能があるとされている。このような種々の
特性を有するオリゴ糖の機能を明らかにし、食品や医薬
等への用途を開発していく上で、オリゴ糖の分離分析が
重要になってきている。

【０００３】従来、液体クロマトグラフィーによるオリ
ゴ糖の分離はイオン交換系充填剤、化学修飾型分配系充
填剤、ＧＰＣ系充填剤を用いて行われており、これらの
充填剤には、シリカ系のものと有機ポリマー系のものが
知られている。これらのうち、シリカ系の充填剤は、使
用可能ｐＨが２〜７．５と比較的狭く、これよりも酸性
又はアルカリ性で使用するとシリカの溶出が起きるため
、分析条件の選択の範囲が限られたものとなるうえ、カ
ラム性能が低下した際にもアルカリ洗浄による再生を行
うことができない。また、有機ポリマー系の充填剤は、
耐圧性、耐熱性が悪く、また、溶媒により膨潤する性質
を有しているため分析条件の選択の範囲が狭い。また、
化学修飾型分配系充填剤であるＯＤＳ−シリカ系充填剤
やＮＨ２　−シリカ系充填剤は修飾基の化学安定性の問
題による充填剤の劣化があったり、アセトニトリルのよ
うな高価な有機溶媒を高濃度含む移動相を用いる必要が
あるなどの欠点があった。さらに、ＧＰＣ系充填剤にお
いては分子サイズの差で分離するために、オリゴ糖の異
性体どうしを明瞭に分離することは不可能であった。ま
た、還元糖のα−、β−アノマーの分離は従来イオン交
換系充填剤が使用されていたが、分離に時間と手間がか
かるので、短時間にアノマー分析ができる充填剤の開発
が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、耐酸性、耐アルカリ性、耐圧性及び耐熱性に優れた
充填剤を用いた液体クロマトグラフィーにより移動相に
比較的低濃度の有機溶媒を含む水を用いて短時間に効率
よくオリゴ糖の異性体及び還元糖のα−、β−アノマー
を分離することができる方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、炭素系粒子を充填剤とした液体クロマトグラフ
ィーカラムを用いるとき、分離能が高く短時間に効率よ
くオリゴ糖を分離することができ、かつ、該充填剤は耐
酸性、耐アルカリ性、耐圧性及び耐熱性に優れているこ
とを見出し本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、炭素系粒子を充填剤
とした液体クロマトグラフィーカラムを用いることを特
徴とするオリゴ糖の分析方法を提供する。

【０００７】本発明の分析方法は、充填剤として炭素系
粒子を用いることを特徴とする。

【０００８】本発明に用いる炭素系粒子の細孔容積指数
（１０−５０）／（１−５０）は好ましくは５０％以上
、より好ましくは６０％以上、最も好ましくは８０％以
上である。ここで、細孔容積指数（１０−５０）／（１
−５０）とは、半径が１０ｎｍないし５０ｎｍの細孔の
容積の和と半径が１ｎｍないし５０ｎｍの細孔の容積の
和との比を意味する。細孔容積指数（１０−５０）／（
１−５０）が５０％未満であると液体クロマトグラフィ
ーカラムの充填剤として用いた場合のクロマトグラフィ
ーの分離能が低下する。

【０００９】本発明に用いる炭素系粒子の総細孔容積は
好ましくは０．１５　ｍｌ／ｇ　以上、より好ましくは
０．２　ｍｌ／ｇ以上である。炭素系粒子の総細孔容積
が０．１５　ｍｌ／ｇ　よりも少ないと、溶質を適度に
保持することが困難になりクロマトグラフィー充填剤と
して用いた場合の分離能が低下する。

【００１０】本発明に用いる炭素系粒子の半径５０ｎｍ
以上の細孔の容積は好ましくは０．１　ｍｌ／ｇ以下、
より好ましくは０．０５　ｍｌ／ｇ　以下である。半径
５０ｎｍ以上の細孔の容積が０．１　ｍｌ／ｇを越える
と粒子の強度が弱くなり、高圧下で行なう高速液体クロ
マトグラフィーの充填剤として用いると粒子が破壊され
て再現性良くクロマトグラフィー分離を行なうことがで
きなくなるおそれがある。

【００１１】なお、以上述べた炭素系粒子中の細孔容積
は以下のようにして測定されるものである。測定は窒素
ガス吸着法による。装置はＯＭＩＣＲＯＮ　　ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＹ社製ＯＭＮＩＳＯＲＰ　　３６０　　ａｎ
ｄ　　１００型を用い、計算はＢＪＨ法（Ｂａｒｒｅｔ
　−　Ｊｏｙｎｅｒ・Ｈａｌｅｎｄａ　等により提出さ
れた方法）によった。

【００１２】本発明の分析法に用いる炭素系粒子は、そ
の炭素原子の含有量が好ましくは９７重量％以上、より
好ましくは９９％以上である。炭素含有率が９７％未満
であると炭素以外の不純物であるＳ、Ｏ、Ｈ、Ｎ、メタ
ル等が非特異吸着点となり、分離能を低下させる。

【００１３】また、本発明に用いる炭素系粒子の粒径は
、特に限定されないが、通常１μｍないし３０μｍ　程
度がクロマトグラフィーカラムの充填剤として好ましい
。

【００１４】本発明に用いる炭素系粒子は、以下のよう
にして製造することができる。

【００１５】先ず、平均分子量３００以上のピッチと、
有機ポリマーのモノマーと重合開始剤を含む混合物を懸
濁重合反応させ、生成したビーズを回収する。

【００１６】ここで採用される有機ポリマーとしては実
質的に球状の網状ゲルを形成することができるものであ
ればいずれの有機ポリマーをも採用することができるが
、好ましい有機ポリマーの例としてポリジビニルベンゼ
ン、ポリトリビニルベンゼン等の芳香族ビニルポリマー
やポリエチレンジメタクリレートを挙げることができる
。

【００１７】また、用いられる原料ピッチの平均分子量
は好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上で
ある。平均分子量が３００未満であると、上記した細孔
分布特性を有する粒子を形成することが困難になる。平
均分子量はクロロホルムを溶媒として一般的な手法であ
る蒸気圧平衡法を用いて測定する。また、原料としては
石油処理工程中で得られるピッチ、石炭の乾留工程で得
られるピッチ、ナフタリン、ポリ塩化ビニル等から得ら
れる合成ピッチを使用できる。

【００１８】懸濁重合の条件は基本的に従来の合成樹脂
製造の場合と同様である。出発時における溶媒中の有機
モノマーの濃度は通常２ないし２０重量％、好ましくは
４ないし１０重量％であり、原料ピッチの濃度は通常２
ないし２０重量％であり、好ましくは４ないし１０重量
％である。重合開始剤としては従来と同様、例えばα、
α−アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル及
び２，２’−　アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニ
トリル）等を用いることができる。好ましい溶媒は水で
ある。また、従来と同様、必要に応じてトルエン、キシ
レン、ベンゼン及びベンゾニトリルのような有機溶媒を
希釈剤として用いることができる。さらに、必要に応じ
、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロースのよ
うな懸濁安定剤を加えることもできる。

【００１９】有機モノマー、ピッチ及び重合開始剤並び
に必要に応じて希釈剤及び懸濁剤を溶媒中で攪拌して均
一な懸濁物を生ぜしめた後（２０℃以下で高速攪拌する
ことが好ましい）、通常５０℃ないし９０℃で４時間な
いし１０時間、好ましくは６０℃ないし８０℃で５時間
ないし８時間重合させるる。

【００２０】上記操作により、有機モノマーが重合し、
かつ架橋して実質的に球状の有機ポリマーの網状ゲルが
形成され、この網状ゲルの中にピッチが包み込まれた粒
子が得られるのでこれを回収する。回収は、ろ過により
行なうことができる。

【００２１】次いで、このようにして得られたビーズを
不融化する。不融化はビーズを空気中で２５０℃ないし
３８０℃程度に数時間加熱することにより行なうことが
できる。

【００２２】次いで、このようにして不融化したビーズ
を、１１００℃以上の温度下で、通常、１１００℃ない
し３０００℃の温度下で、真空中又は、アルゴンや窒素
等のような不活性雰囲気下で焼成する。焼成温度が１１
００℃未満であると、粒子の炭素含量が本発明で規定す
る９７重量％に到達しないおそれがある。

【００２３】上記のようにして得られた炭素系粒子は、
従来のものと同様の態様で液体クロマトグラフィーカラ
ム、特に高速液体クロマトグラフィーカラムの充填剤と
して用いてオリゴ糖を分析することができる。

【００２４】炭素系粒子はカラムに充填した後液体クロ
マトグラフィー装置に接続し、高速液体クロマトグラフ
ィーを行なう。オリゴ糖を含む試料液をカラムにかけ、
水と水に可溶で極性を有する適当な移動相、（例えばア
セトニトリル、メタノールのようなアルコール類、テト
ラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルスルホキ
シド等）との混液で展開することにより、オリゴ糖を分
離することができる。

【００２５】本発明の方法により分析することができる
オリゴ糖は、いずれのオリゴ糖であっても良く、オリゴ
糖中の糖単位に含まれる炭素数も特に限定されない。す
なわち、本発明の方法により分析できるオリゴ糖として
、例えば、シュクロース、ラクトース、セロビオース、
トレハロース、マルトース、イソマルトース、コージビ
オース、ニゲロース、ソホロース、ラミナリビオース、
ゲンチビオース、キトビオース、メリビオース及びツラ
ノース等の二糖並びにメレチトース、パノース、ラフィ
ノース等の三糖を挙げることができるがこれらに限定さ
れるものではない。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２７】実施例１ 平均分子量６００の減圧蒸留残渣油５体積％、ジビニル
ベンゼン５体積％、ポリビニルアルコール１重量％、ア
ゾビスイソブチロニトリル０．２５重量％、トルエン５
体積％及びイオン交換水（残部）からなる混合物を２０
℃以下の温度下でラボラトリーディパーザーを用いて高
速攪拌した。次いで該混合物を攪拌しながら８０℃に６
時間加熱した。次いで生成したビーズをろ過により回収
し、１００℃で乾燥させた。次いでビーズを３５０℃で
３時間空気中で加熱して不融化した。これを窒素ガス雰
囲気下、２５００℃で焼成した。焼成後、ベンゼン中で
超音波処理し、メタノール／エーテルで洗浄し、１００
℃で乾燥し、分級し、炭素系粒子を得た。

【００２８】得られた粒子の元素分析結果は、炭素１０
０％であり、水素、酸素、窒素及びイオウは検出されな
かった。また、総細孔容積は０．４４４２　ｍｌ／ｇ　
であり、細孔半径が１〜１０ｎｍの細孔の容積が０．０
７６８ｍｌ／ｇ　、１０〜５０ｎｍの細孔の容積が０．
３５６９　ｍｌ／ｇ　、５０ｎｍ以上の細孔の容積が０
．０１０５　ｍｌ／ｇ　であり、従って、細孔容積指数
（１０−５０）／（１−５０）は８２．３％であった。

【００２９】得られた炭素系粒子を内径４．６ｍｍ　、
長さ１００　ｍｍのステンレススチール製カラムに平衡
スラリー法で充填し、充填カラムを作製した。このカラ
ムを用いて、トレハロース、シュクロース、マルトース
、ラクトースの各試料液をクロマトグラフィーにより分
析した。各試料液の濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭとした。試
料液をカラムに流した後、移動相の４％アセトニトリル
水溶液を流速１ｍｌ／分、温度１５℃で流し、示差屈折
計で検出してクロマトグラムを得た。

【００３０】結果を図１〜４に示す。図１〜４から明ら
かなように、還元糖の場合α−、β−のアノマーを分離
検出することができる。したがって平衡状態の研究に利
用できるし、また配糖体などからオリゴ糖を切り離した
場合に結合様式の推定が可能になる。また、分離に要す
る時間が非常に短く二糖類の検出が迅速に行えることが
分かる。

【００３１】実施例２ 実施例１で作製したカラムを用い、トレハロース、を４
ｍＭ、マルトース、ゲンチビオース、セロビオースを各
８〜９ｍＭの濃度で含む試料液を分析した。試料液をカ
ラムに流した後、移動相として４％のアセトニトリル水
溶液（１ｍＭ水酸化ナトリウムを含む）を流速１ｍｌ／
分、室温で流し、示差屈折計で検出してクロマトグラム
を得た。

【００３２】結果を図５に示す。数種のオリゴ糖の一斉
分析の場合は、移動相を水酸化ナトリウム等でアルカリ
性とし還元糖のアノマー分離を抑えて分析する。図５中
、ピーク１はトレハロース、ピーク２はマルトース、ピ
ーク３はゲンチオビオース、ピーク４はセロビオースの
ピークをそれぞれ示す。図５から明らかなように、これ
らの４種類の二糖異性体は明瞭に分離されており、本発
明の方法により、オリゴ糖の異性体が分離可能であるこ
とが明らかになった。

【００３３】

【発明の効果】本発明により充填剤として炭素系粒子を
含む液体クロマトグラフィーによるオリゴ糖の分析法が
提供された。本発明の分析法によると、有機溶媒濃度の
低い移動相を用いても、オリゴ糖を短時間に効率よく分
析することができる。また、オリゴ糖の異性体の同時分
離も可能であり、還元糖の場合はα−、β−のアノマー
を分離検出することも可能である。さらに、本発明の方
法に用いる炭素系粒子は、耐酸性、耐アルカリ性、耐圧
性及び耐熱性に優れており、分析条件の選択の範囲が広
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法によるトレハロースの分析結果を
示す図。

【図２】本発明の方法によるシュクロースの分析結果を
示す図。

【図３】本発明の方法によるマルトースの分析結果を示
す図。

【図４】本発明の方法によるラクトースの分析結果を示
す図。

【図５】本発明の方法による二糖異性体の分析結果を示
す図。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　炭素系粒子を充填剤として含む液体ク
   ロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするオ
   リゴ糖の分析方法。
2. 【請求項２】　　炭素系粒子の細孔容積指数（１０−５
   ０）／（１−５０）が５０％以上、総細孔容積が０．１
   ５　ｍｌ／ｇ　以上、半径５０ｎｍ以上の細孔の容積が
   ０．１　ｍｌ／ｇ以下であり、炭素の含量が９７重量％
   以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　細孔容積指数（１０−５０）／（１−
   ５０）が８０％以上であることを特徴とする請求項２記
   載の方法。