JP2015508174A - ジアンヒドロガラクチトール中の夾雑物を分析および測定するための改良分析方法 - Google Patents

Abstract

ジアンヒドロガラクチトールの試料を分析するための改良された分析方法は、ジアンヒドロガラクチトールの純度を測定し、およびジアンヒドロガラクチトールの試料中の夾雑物を検出する方法、ならびにこのような夾雑物全部の同定方法を提供する。この方法は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）,特に屈折率（ＲＩ）検出とともに高速液体クロマトグラフィＨＰＬＣを使用する。ＨＰＬＣに引続いて、タンデム質量分析を行うことができる。この方法はジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定物質のピークの調整用ＨＰＬＣ採集工程をさらに含むことができる。

Description

（関連発明）
本出願は２０１２年２月２７日付けで出願されたＸｉａｃｙｕｎ Ｌｕによる「ジアンヒドロガラクチトール中の夾雑物を分析および測定するための改良分析方法」と題する米国仮特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／６０３，４６４に優先権を主張するものであり、その内容をこの引用によってそれら全体をここに組入れる。

（発明の分野）
本発明は、特に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を包含するジアンヒドロガラクチトール用の改良された分析方法に関する。

（発明の背景）
ジアンヒドロガラクチトール（１，２：５，６−ジアンヒドロガラクチトールまたはＤＡＧ）は化学療法活性を包含する重要な薬理学的活性を有する多くのヘキシトールまたはヘキシトール誘導体の１種である。特に、ジアンヒドロガラクチトールはＮｉｅｌｓｅｎ等に対する米国特許第７，１５７，０５９号におけるように化学療法における使用が示唆されている。

ジアンヒドロガラクチトールは多くの新生物に対する活性を有する。しかしながら、ジアンヒドロガラクチトールを治療剤して成功裏に使用すべき場合、格別に高度の純度および夾雑物の除去が必須である。夾雑物の存在は望ましくない副作用を導くことがある。タンパク質の正常構成成分であるアミノ酸トリプトファンのバッチ中に存在する夾雑物が好酸球酢増加性筋肉痛症候群の有意の発症に責任があった場合、数年後に副作用が生じた例があり、これは多数の永久的障害の原因になり、また少なくとも３７人を死亡させている。このことは特に、ジアンヒドロガラクチトールなどの治療剤を弱体化された免疫系または肝臓または腎臓機能不全を有する患者、あるいは高齢の患者に使用しなければならない場合に重要である。このような患者は彼等の夾雑物に対する感受性によって望ましくない副作用のより大きい発生を経験することがある。

ジアンヒドロガラクチトールの試料中に見出される夾雑物の１種はズルシトールである。それらの製造方法によって、その他の夾雑物もジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する。

従って、ジアンヒドロガラクチトールを治療目的で投与する場合、副作用の誘発をまた最小にするより高い純度を達成するためにジアンヒドロガラクチトールの試料中の夾雑物および分解生成物を検出する改良された分析方法が必要である。

（発明の要旨）
これらの要求に適合するジアンヒドロガラクチトールの純度を測定し、およびジアンヒドロガラクチトールの試料中の夾雑物および分解生成物を検出をするための改良された分析方法をここに開示する。

一般に、この分析方法では高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）,特に屈折率（ＲＩ）検出と組合せたＨＰＬＣを使用する。

態様の一つにおいて、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する夾雑物の存在および量を分析するための分析方法は下記工程を含む：
（１）試料を移動相勾配による溶出を使用し、ズルシトールおよび試料中のその他の成分を分離する高速液体クロマトグラフィに付すことによってジアンヒドロガラクチトールの試料を分析する；次いで
（２）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離された１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する。

ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物は少なくとも１種の（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の夾雑物；および（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解生成物であることができる。

本方法の一態様において、溶出は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。好ましくは、溶出は約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。最も好ましくは、溶出は約１ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。

本方法のもう一つの態様において、溶出は水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せを用い、ギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムの総濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１ｍＭ〜約０．１ｍＭである。代表的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合は溶出の初期における約１００：１から溶出の終了時における約１：１００に変化させる。

典型的に、この方法において、ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離された１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する工程は蒸発光散乱検出（evaporative light scattering detection）によって行う。典型的に、この蒸発光散乱検出はエレクトロスプレイ（electrospray）ＬＣ／ＭＳと両立することができる。典型的に、蒸発光散乱検出は１００％水性移動相の蒸発を強化するための揮発性溶媒のポスト−カラム添加を含む。典型的に、揮発性溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群から選択される。

一態様において、エレクトロスプレイタンデム質量分析計（electrospray tandem mass spectrometer）を配置し、ＥＬＳＤを備えたＨＰＬＣ装置にオンラインで接続する。典型的に、この態様において、ジアンヒドロガラクチトール試料中に存在することができる夾雑物のそれぞれに係わる化学情報を提供する質量分析データが採集される。また、典型的に、この態様において、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在することができる夾雑物のそれぞれに係わる構造上の情報を提供するタンデム質量分析データが採集される。

本方法はまた、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定の物質のピークの調整用ＨＰＬＣ採集を行う工程をさらに含んでいる。ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定の物質のピークは夾雑物であることができる。

もう一つの態様において、勾配溶出の代わりに等溶出（isocratic elution）を使用することができる。等溶出を使用する場合、一般に、この方法は下記工程を含む：
（１）試料を等移動相による溶出を使用する高速液体クロマトグラフィに付し、ズルシトールおよび試料中のその他の夾雑物からジアンヒドロガラクチトールを分離することによってジアンヒドロガラクチトールの試料を分析する；次いで
（２）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離された１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する。

一態様において、等溶出を使用する場合、等移動相はＮａＯＨであり、ＮａＯＨの濃度は約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、ＮａＯＨの濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、ＮａＯＨの濃度は約１ｍＭである。

もう一つの態様において、等溶出を使用する場合、等移動相は水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せであり、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムおよび揮発性酢酸アンモニウムの総濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１ｍＭである。典型的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合は約５０：５０である。

典型的に、この態様において、この方法において、ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離された１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する工程は前記したように蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）によって行う。典型的に、この蒸発光散乱検出はエレクトロスプレイＬＣ／ＭＳと両立することができる。典型的に、蒸発光散乱検出は１００％水性移動相の蒸発を強化するための揮発性溶媒のポスト−カラム添加を含む。典型的に、揮発性溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群から選択される。

この態様においてはまた、エレクトロスプレイタンデム質量分析計を配置し、ＥＬＳＤを備えたＨＰＬＣ装置にオンラインで接続することができる。典型的に、この態様において、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在することができる夾雑物のそれぞれに係わる化学情報を提供する質量分析データが採集される。また、典型的に、この態様において、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在することができる夾雑物のそれぞれに係わる構造上の情報を提供するタンデム質量分析データが採集される。

本発明に従うこの態様はさらに、ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定の物質のピークの調整用ＨＰＬＣ採集を行う工程をさらに含むことができる。ジアンヒドロガラクチトールの製造において存在する少なくとも１種の特定の物質のピークは夾雑物であることができる。

（図面の簡単な説明）
本発明のこれらのおよびその他の特徴、態様および利点は下記説明、添付特許請求の範囲および添付図面を参照してより良く理解されるようになるだろう。

図１はジアンヒドロガラクチトール試料の代表的ＨＰＬＣ／ＲＩクロマトグラムを示しており、粗製医薬および医薬製品のＲＲＴ〜０．６におけるズルシトールおよび未知の関連物質の分離を示す。

図２は標準のジアンヒドロガラクチトールおよびズルシトールおよび比較用の水ブランクの分離を示す代表的ＨＰＬＣ／ＲＩクロマトグラムを示す；図２において、ジアンヒドロガラクチトール−ズルシトール標準は上部パネルに示されており、および水ブランクは下部パネルに示されている。

（発明の詳細な説明）
本発明はジアンヒドロガラクチトールの純度を測定し、およびジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する夾雑物の存在および濃度を測定するための改良された分析方法に関する。

ジアンヒドロガラクチトールは下記式（Ｉ）で示される：

ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する重要な夾雑物の１種はズルシトールである。ズルシトールは下記式（ＩＩ）で示される。その他の夾雑物もジアンヒドロガラクチトール試料中に存在することが知られている：

ジアンヒドロガラクチトール試料の改良された分析方法は蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）と組合せたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）に基づいている。一態様において、このようなジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する有意の夾雑物の全部を検出および同定するためにＨＰＬＣを質量分析（ＭＳ）と組合わせる。

ＨＰＬＣの理論と実践はＬ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ等による「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００９）に記載されている。ＭＳの理論と実践はＥ．ｄｅ Ｈｏｆｆｍａｎｎ ＆ Ｖ．Ｓｔｒｏｏｂａｎｔによる「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｓｃｏｐｙ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００７）に記載されている。

ＨＰＬＣ法はＲＲＴ０．６で見出される未知の関連物質の分離に加え、ジアンヒドロガラクチトール試料中の合成中間体、ズルシトールの分離を証明した（図１）。図１はジアンヒドロガラクチトール試料の代表的ＨＰＬＣ／ＲＩクロマトグラムであり、粗製医薬および医薬生成物中のＲＲＴ〜０．６におけるズルシトールおよび未知の関連物質の分離を示している。標準および比較用の水ブランクにおけるジアンヒドロガラクチトールとズルシトールとの分離を示す代表的ＨＰＬＣクロマトグラムは図２に示されている。図２において、ジアンヒドロガラクチトール−ズルシトール標準は上部パネルに示されており、および水ブランクは下部パネルに示されている。

本明細書は潜在的に共−溶出性物資を分離するための改良されたＨＰＬＣクロマトグラフィ条件を開示するものである。熱的にストレスを負荷されたジアンヒドロガラクチトール生成物サンプルを評価し、ズルシトールおよびその他の関連物質および分解生成物の分離に適するクロマトグラフィ条件の確認を提供する。引続いて、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行い、これによりＲＲＴ〜０．６における未知のＤＡＧ関連物質を特定し、この未同定成分の化学構造の決定および質量分析特徴を得る。

従来使用されてきたＨＰＬＣ条件は、５０ｍＭ ＮａＯＨ移動相を用いるジアンヒドロガラクチトールおよびその関連物質の等溶出を包含する。本明細書に記載の方法の一部として使用されているこれらの条件に対する改良において、勾配移動相を使用する。一態様では濃度勾配でＮａＯＨを使用する。ＮａＯＨを濃度勾配で使用する場合、典型的には、溶出は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。好ましくは、溶出は約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。さらに好ましくは、溶出は約１ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる。

もう一つの別法において、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せを溶出剤として使用することができる。この別法において、ギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムの総濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１ｍＭ〜約０．１ｍＭである。典型的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合は溶出の初期において約１００：１から溶出の終了時における約１：１００まで変化させる。

別の勾配溶出スキームは当技術で公知である。

典型的に、本発明に従うＨＰＬＣ分析法において、検出は蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）の手段によって行う。蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）ではカラム溶出液を霧化し、生じる特定の成分に光を発光させ、次いで生じる散乱光を検出する。理論的に、ＥＬＳＤは非揮発性成分の全部を検出することができる。非クロモゲン性化合物の蒸発光散乱検出は光散乱検出のための霧化溶質粒子を生じさせるために、ＨＰＬＣ溶出液の霧化および移動相溶媒の蒸発に基づいている。この霧化アナライト溶質粒子を生じさせるための霧化および溶媒蒸発プロセスはエレクトロスプレイＬＣ／ＭＳ法と両立することができる。典型的に、ＥＬＳＤ検出はエレクトロスプレイＬＣ／ＭＳと両立することができる。

エレクトロスプレイＬＣ／ＭＳ適用と両立することができるＥＬＳＤ検出を用いるＨＰＬＣ法の実行は１００％水性移動相の蒸発を強化するための揮発性溶媒のポスト−カラム添加を包含する。揮発性溶媒は典型的に、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群から選択される。

従って、本発明による方法において、エレクトロスプレイタンデム質量分析計を配置し、これをＥＬＳＤを備えたＨＰＬＣ装置にオンラインで接続する。ジアンヒドロガラクチトール試料中に存在することができる夾雑物のそれぞれに係わる分子情報および化学構造情報を提供するタンデム質量分析データを採集することができる。ＨＰＬＣと組合わせたタンデム質量分析は見出される夾雑物および分解生成物のそれぞれに係わる分子イオン情報と一致する分子量を有する可能な化学構造および分子イオン情報を提供する。

もう一つの別法において、ＤＡＧ試料中に存在する夾雑物を包含する特定のＤＡＧ−関連物資ピークの調整用ＨＰＬＣ採取を行うことができる。

従って、ジアンヒドロガラクチトール試料中に存在する夾雑物の存在および量を分析するための分析方法の一つは下記工程を含む：
（１）ジアンヒドロガラクチトール試料を移動相勾配による溶出を使用する高速液体クロマトグラフィに付し、ズルシトールおよび試料中のその他の夾雑物を分離することによってジアンヒドロガラクチトール試料を分析する；次いで
（２）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する。

ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物は少なくとも１種の（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の夾雑物；および（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解生成物であることができる。

典型的に、別法の一つにおいて、この方法における移動相勾配は水酸化ナトリウム勾配である。

もう一つの別法において、この方法では移動相勾配は水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せの勾配である。

典型的に、この方法では、検出は蒸発光散乱による。典型的に、蒸発光散乱を使用する場合、この方法は移動相の成分の蒸発を強化するために揮発性溶媒のポストカラム添加工程をさらに含んでいる。

典型的に、本発明は高速液体クロマトグラフィから溶出する１個または２個以上のピークをエレクトロスプレイタンデム質量分析により分析する工程をさらに含んでいる。

別法の一つにおいて、本発明は少なくとも１個の特定ＤＡＧ関連物質の調整用ＨＰＬＣ採集工程をさらに含んでいる。

夾雑物または分解生成物（ズルシトール以外）が存在する場合、未知の夾雑物または分解生成物はカラムクロマトグラフィによる分離、および引続く固形の未知試料を生成する少なくとも１種の精製処理を行うことによって同定する。この固形の未知試料はついで、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）、フーリエ変換赤外線分光分析（Fourier transform infrared spectroscopy）（ＦＴ−ＩＲ）、元素分析、ＨＰＬＣによる純度の測定、およびカールフィッシャー（karl Fischer）滴定法による水含有量の測定からなる群から選択される少なくとも１種の標準的分析方法によって同定し、確認することができる。これらの方法は当技術で周知である。

もう一つの別法において、この方法は下記工程を含む：
（１）ズルシトールおよび試料中のその他の夾雑物からジアンヒドロガラクチトールを分離するために、試料を等移動相による溶出を使用する高速液体クロマトグラフィに付すことによってジアンヒドロガラクチトールの試料を分析する；次いで
（２）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する。

勾配溶出を使用する方法と同様に、ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物は（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の夾雑物；および（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解生成物の少なくとも１種であることができる。

この別法において、等溶出による溶出は水酸化ナトリウムを用いて溶出するか、または水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せを用いて溶出することができる。等溶出移動相が水酸化ナトリウムである場合、典型的に、ＮａＯＨの濃度は約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、ＮａＯＨの濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、ＮａＯＨの濃度は約１ｍＭである。等移動相が水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せである場合、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムおよび揮発性酢酸アンモニウムの総濃度は約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度は約１ｍＭである。典型的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合は約５０：５０である。

本発明を下記実施例によって説明する。この例は例示の目的のみであって、本発明を制限しようとするものではない。
（例）
等水酸化ナトリウム溶出を使用するジアンヒドロガラクチトール試料のＨＰＬＣ分析

本例に記載されている方法は、屈折率検出を用いるイオン交換高速液体クロマトグラフィによるジアンヒドロガラクチトール医薬試料中のズルシトールおよび関連夾雑物の測定に使用される。

この方法において、サンプルは５ｍｇ／ｍＬの目標濃度でジアンヒドロガラクチトールを用いて調製する。ズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールおよび関連夾雑物はアニオン交換カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸ−１０、２５０ｘ４．１ｍｍ、７μｍ）を屈折率検出とともに等溶出移動相として５０ｍＭ ＮａＯＨを用いて分離する。ズルシトール濃度は外部対照標準を用いて測定し、および関連物質の内容はＤＡＧ対照標準を用いて推定する。

適当なＨＰＬＣ装置およびデータ情報装置は下記装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ装置またはその均等装置である：Ｑｕａｔ ｐｕｍｐ、Ｍｏｄｅｌ Ｇ１３１１Ａまたはその均等装置；オートサンプラー、Ｍｏｄｅｌ １３２９Ａまたはその均等装置：ＲＩＤ検出器、Ｍｏｄｅｌ １３６２Ａまたはその均等装置；３０±３℃のカラム温度制御器ケーブル；および脱気装置、Ｍｏｄｅｌ １３２２またはその均等装置。カラムはＨａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸ アニオン交換カラム ２５０ｘ４．１ｍｍ、７μｍ、Ｐ／Ｎ７９４４０またはその均等装置である。データ集積はＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｓｔｏｒｅ Ｃｌｉｅｎｔ／Ｓｅｒｖｅｒまたはその均等データ装置により行う。

次の化学物質を使用する。水はＭｉｌｌｉ−Ｑ水または脱イオン水である。水酸化ナトリウムは標準純度品質である。ズルシトール対照標準は純度９９．９５％のものである。ＤＡＧ対照標準は純度９８．７２のものである。

移動相（５０ｍＭ ＮａＯＨ）として、ＮａＯＨ ２．０ｇを水１リットルに溶解する。この溶液を０．４５μｍフィルターに通して濾過する。この移動相は室温で１ヶ月まで保存することができる。ズルシトール対照保存溶液（名目上、５００μｇ／ｍＬ）として、ズルシトール対照標準２５ｍｇを正確に計量し、５０−ｍＬ容積フラスコに入れる。このズルシトールを脱イオン水で容量まで希釈し、次いで充分に混合する。調製された保存溶液は２〜８℃において３日間まで保存することができる。ＤＡＧ対照保存溶液（名目上、５００μｇ／ｍＬ）として、ＤＡＧ対照標準２５ｍｇを正確に計量して５０−ｍＬ容積フラスコに入れる。このＤＧＡを脱イオン水で容量まで希釈し、次いで充分に混合する。調製された保存溶液は２〜８℃において３日間まで保存することができる。ズルシトールＤＧＡ標準溶液（ズルシトール５０μｇ／ｍＬ ＋ＤＧＡ５０μｇ／ｍＬ；それぞれ５ｍｇ／ｍＬＤＡＧの１％）として、ズルシトール保存液１．０ｍｌおよびＤＡＧ保存液１．０ｍｌをそれぞれ、正確に計量して１０−ｍＬ容積フラスコに移し、水で容量まで希釈し、次いで充分に混合する。

ＡＰＩサンプル（名目上、１ｍｇ／ｍＬ）からのＤＡＧサンプル試料として、ＤＡＧのＡＰＩサンプル約２５ｍｇを正確に計量して清明な２５−ｍＬ容積フラスコに入れる。このＤＡＧ ＡＰＩサンプルを約５ｍＬの脱イオン水中に溶解し、脱イオン水で容量まで希釈し、次いで混合する。この被験サンプルの適量１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。調製されたサンプルは２〜８℃において２日間まで保存することができる。

ＡＰＩサンプル用のＤＡＧサンプル試料（名目上、５ｍｇ／ｍＬ）として、ＡＰＩサンプル約５０ｍｇを正確に計量して清明な１０−ｍＬ容積フラスコに入れる。ＤＡＧ ＡＰＩサンプルを水約５ｍＬに溶解し、容量まで水で希釈し、次いで混合する。

凍結乾燥された（４０ｍｇ／バイアル）サンプルからのＤＡＧサンブル試料として、サンプルを保存していた冷蔵庫から取り出し、次いで封を取り除く。水５．０ｍＬを計量して移し、この溶液を混合してＤＡＧを溶解させ、８ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。この再構成した溶液の適量１．０ｇを脱イオン水で８．０ｇまで希釈し、次いで混合する。この被験サンプルの別の１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。調製されたサンプルは２〜８℃において２日間まで保存することができる。

凍結粉末（４０ｍｇ／バイアル）を用いる医薬製品用のＤＡＧサンブル試料（名目上、５ｍｇ／ｍＬ）として、バイアルの封を洗浄し、次いで取り除く。凍結乾燥されたバイアルを水８ｍＬで再構成し、５ｍｇ／ｍＬ溶液を生成する。適量１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。サンプルは２回形式（２本のバイアルを使用する）で調製する。調製されたサンプルは２〜８℃において２４時間まで保存することができる。

ＨＰＬＣ分析のために、ＨＰＬＣ装置のスイッチを入れ、検出器を少なくとも２０分間かけて温まるままにする。必要に応じて、適当な溶媒導入口中に上記のとおりに調製されたＨＰＬＣ移動相を入れる。溶媒線が移動相で覆われるようにする。この装置およびカラムを１．５ｍＬ／分の流動速度で少なくとも３０分間かけてＨＰＬＣ移動相により平衡化する。サンプル分析を順次開始する。装置の安定性が確認されたならば、水ブランクを注入し、次いで標準液を注入し、次いでサンプルを注入する。ズルシトールＤＡＧ標準液は１０回のサンプル注入の各１回後毎に注入し、次いで実験の終了時点で最後の分岐標準を注入する。適当なサンプル分析順序を表１に示す。

ＲＩＤを用いてサンプルを分析する。上記したように、適当なカラムはＨａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸ イオン交換カラム（２５０ｘ４．１ｍｍ、７μｍ）、Ｐ／Ｎ７９４４０またはその均等装置である。移動相は脱イオン水中の５０ｍＭ ＮａＯＨである（等抽出）。流動速度は１．５ｍｌ／分である。カラム温度は３０℃である。注入容積は５０．０μＬである。検出は３５℃においてＲＩＤによる。操作時間は８分間である。

クロマトグラムの分析および集積にはＨＰＬＣソフトウエアを使用する。ブランク、サンプルおよび試験標準にかかわるクロマトグラムを観察し、比較する。いくつかのピークの手動による集積および指示が必要であることがある。傾斜感度、ピークの幅、ピークの高さ、廃棄用の閾値、ショルダーピーク、ベースラインおよび分裂ピークの集積タイプなどの集積パラメータ、ならびにその他のパラメータを調整し、適当な集積値を得、次いでこれらのパラメータの数値を記録し、サンプルおよび標準の全部に適用する。

装置の適合性は下記のとおりに評価する。ズルシトールＤＡＧ標準溶液の６回の再注入を表２のクロマトグラフイ性能要件を用いて評価する。

分岐標準溶液注入におけるズルシトールおよびＤＡＧピーク面積は従来のＳＳＴ注入におけるそれぞれの平均ピーク面積の８０％〜１２０％でなければならない。分岐標準の臨界値に適合することに失敗した場合、分岐標準の最終通過後に分析されたサンプルは再分析されるべきではない。

データの分析に際し、相対ピーク面積＝（ピーク面積／総ピーク面積）ｘ１００である（式中、ピーク面積は各ピーク面積であり、および総ピーク面積は全ピークからピーク面積の合計である）。

ズルシトール濃度は次のとおりに計算する：ズルシトール（Ｃｕ、μｇ／ｍＬ）＝Ｃｓ ｘ 平均サンプルピーク面積／Ｄｕｌ−ＤＡＧ標準注入液の平均ズルシトールピーク面積。この式において、Ｃｓはμｇ／ｍＬ単位によるズルシトール濃度である。

ＤＡＧ医薬物質または医薬製品中のズルシトール含有量は下記のとおりに計算することができる：ズルシトール重量％＝Ｃｕ（μｇ／ｍＬ）／１０００／ＳＣ（μｇ／ｍＬ）ｘ １００。この式において、Ｃｕは上記のとおりにして計算されるズルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）であり、およびＳＣは医薬物質または医薬製品から準備されたサンプル濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。ズルシトールが存在する場合、ズルシトールの重量パーセントは０．０５％に等しいか、またはそれ以上であるかとして報告される；これは最も近い０．０１％として報告される。

未知または予め同定されていないズルシトール以外の夾雑物がＤＡＧ試料中に存在する場合、その濃度は次のとおりに計算される：未知夾雑物濃度（μｇ／ｍＬ）＝Ｃｓ ｘ 平均サンプルピーク面積／Ｄｕｌ−ＤＡＧ標準注入液の平均ＤＡＧピーク面積。存在する場合、未知夾雑物重量パーセントは次のとおりに計算される：Ｃｕ（μｇ／ｍＬ）／１０００／Ｓｃ（ｍｇ／ｍＬ）ｘ １００（式中Ｃｕ＝前記のとおりに計算された未知濃度（μｇ／ｍＬ）であり、およびＳｃ＝医薬物質について８．２．２．または医薬製品について８．２．３で準備されたものとしてのサンプル濃度（μｇ／ｍＬ）である）。存在する場合、未知夾雑物はそれぞれ、０．０５％に等しいか、またはそれ以上であるかとして報告される；最近似値０．０１％として報告される。

重量パーセントによる分析結果は各サンプルおよび２種のサンプルの平均について計算する。
［発明の効果］

（発明の利点）
本発明はズルシトールおよび未知夾雑物を包含するジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する夾雑物を検出および定量するための改良された分析方法、ならびにジアンヒドロガラクチトール試料中に存在する未知夾雑物を単離および同定する方法を提供する。本発明の方法は医薬用途に適する高純度のジアンヒドロガラクチトールの大規模製造を可能にし、また医薬用を目的とするジアンヒドロガラクチトール試料中に夾雑物が存在することにより生じる有意の副作用の可能性を減少させる。

本発明による方法はジアンヒドロガラクチトール試料の分析およびジアンヒドロガラクチトール試料中の夾雑物の測定および定量に工業的用途を有する。

数値の範囲に関し、別段の明確な記載がないかぎり、本発明は少なくとも下限単位の１０分の１までの範囲で上限と下限の間の各中間の数値を包含する。さらに、特別に記述範囲から逸脱しないかぎり、本発明は範囲の上限および下限のどちらか、またはその両方を包含する範囲および記述されている全部の数値を包含する。

別段の規定が無いかぎり、本明細書に使用されている全部の技術的および科学的用語の意味は本発明が属する通常の当業者によって容易に理解される用語である。当業者にとってまた、本明細書に記載されている方法および物質に類似するか、または均等である全部の方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができることは明白であろう。

本明細書に記載されている刊行物および特許は本出願の提出日に先立つそれらの記載を単に提供するのみである。本発明の優先権に基づいて、このような刊行物の先行性から本発明の権利が無いものと認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認する必要があることがある実際の刊行日とは相違していることがある。

引用されている全部の刊行物を、それらの全体を引用することによってここに組入れる。これらは全部の発行されている特許、特許出願書、および文献参考書、ならびにこれらの刊行物中に組入れられている全刊行物を包含する。しかしながら、引用によって本明細書に組入れられている刊行物の全部が発表された情報を参照する範囲まで、本出願人は本出願の提出日後に発表された全部の情報が従来技術であると認めるものでもない。

本明細書および添付特許請求の範囲に使用されているものとして、単数形態は複数形態を包含する。一例として、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段の明確な記載がないかぎり、複数の意味を包含する。さらに、一連の事項の前の「少なくとも」の用語は一連の事項のそれぞれを指すものと理解されるべきである。本明細書に例として記載されている本発明は、本明細書に特別に明記されていない１種または２種以上の事項、１種または２種以上の制限の全部が存在していなくても適当に実施することができる。すなわち、一例として、「含む」、「包含する」、「含有する」などの用語は拡大し、制限のない用語として読まれるべきである。さらに、本明細書で使用されている用語および表現は説明用語として使用されているものであって、制限する用語ではなく、またこのような用語および表現の使用は示されているおよび記載されている将来の均等物の全部またはそのいずれか一部を排除しようとするものではなく、および種々の修正は特許請求されている本発明の範囲内であることができる。従って、本発明は好適な態様および任意の特徴によって詳細に説明されているが、本明細書に記載されている発明の修正および変更は当業者が頼りにすることができるものであり、このような修正および変更は本明細書に記載の本発明の範囲内にあるものと理解されるべきである。本発明を本明細書に広く、一般的に説明されている。これらの一般的説明の範囲内に入る狭い範囲の用語および付属群は本発明の態様の一部を示すものである。これは、ここに特別に存在する物質を排除するか、または排除しないかに関係なく、その概念からの全部の主題を排除する否定的制限または但し書きによる各発明の一般的説明を包含する。さらに、発明の特徴または態様がマークシュ グループ（Markush group）の用語で説明されている場合、本発明はマークシュ グループの各一員または準一員の全部の用語で説明されているものと当業者は認識するだろう。前記記載は例示であって、制限するものではないことが理解されるべきである。かなりの態様は前記説明を再検討することによって当業者にとって明白である。従って、本発明の範囲は前記の記述を引用して決定されるべきではなく、その代わりに、添付特許請求の範囲が権利を有する範囲と同等の完全範囲とともに添付特許請求の範囲を引用して決定されるべきである。当業者は、さらに慣用の実験を使用することなく、記述されている本発明の特定の態様と均等であるかなりの態様を認識または確認することができる。このような均等な態様は下記特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (42)

1. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する夾雑物の存在および量を分析する分析方法であって、
   （ａ）ジアンヒドロガラクチトールの試料をズルシトールおよび試料中のその他の成分を分離する移動相勾配による溶出を使用する高速液体クロマトグラフィに付すことによってジアンヒドロガラクチトールの試料を分析する；次いで
   （ｂ）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する；
   工程を含む方法。
2. ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物が少なくとも１種の（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の夾雑物；および（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解生成物である、請求項１に記載の分析方法。
3. 溶出が約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる、請求項１に記載の分析方法。
4. 溶出が約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる、請求項３に記載の分析方法。
5. 溶出が約１ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨ勾配を用いる、請求項４に記載の分析方法。
6. 溶出が水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せの勾配を用い、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項１に記載の分析方法。
7. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約１．５ｍＭ〜約１．０ｍＭである、請求項６に記載の分析方法。
8. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約１．０ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項７に記載の分析方法。
9. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合を溶出の初期における約１００：１から溶出の終了時における約１：１００に変化させる、請求項４に記載の分析方法。
10. ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する工程を蒸発光散乱検出によって行う、請求項１に記載の分析方法。
11. 蒸発光散乱検出がエレクトロスプレイＬＣ／ＭＳと両立する、請求項１０に記載の分析方法。
12. 蒸発光散乱検出が１００％水性移動相の蒸発を強化するための揮発性溶媒のポスト−カラム添加を含む、請求項１０に記載の分析方法。
13. 揮発性溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群から選択される、請求項１２に記載の分析方法。
14. エレクトロスプレイタンデム質量分析計を配置し、ＥＬＳＤを備えたＨＰＬＣ装置にオンラインで接続する、請求項１に記載の分析方法。
15. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在することができる夾雑物および分解生成物のそれぞれに係わる化学情報を提供するタンデム質量分析データを採集する、請求項１４に記載の分析方法。
16. ＨＰＬＣと組合わせたタンデム質量分析が分子イオン情報および見出される夾雑物および分解生成物のそれぞれに係わる分子イオン情報と一致する分子量を有する可能な化学構造を提供する、請求項１５に記載の分析方法。
17. 少なくとも１種少なくとも１種の夾雑物または分解生成物をカラムクロマトグラフィにより分離し、引続いて固形未知試料を得るための少なくとも１種の精製処理によって同定する、請求項１５に記載の分析方法。
18. 固形未知試料を核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）、フーリエ変換赤外線分光分析（ＦＴ−ＩＲ）、元素分析、ＨＰＬＣによる純度の測定、およびカールフィッシャー滴定法による水含有量の測定からなる群から選択される少なくとも１種の標準的分析方法によって同定し、確認する、請求項１７に記載の分析方法。
19. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定の物質のピークの調整用ＨＰＬＣ採集を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
20. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の物質のピークが夾雑物である、請求項１９に記載の分析方法。
21. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の物質のピークが分解生成物である、請求項１９に記載の分析方法。
22. 分析方法であって、
    （ａ）ジアンヒドロガラクチトールの試料をズルシトールおよび試料中のその他の夾雑物を分離する等移動相による溶出を使用する高速液体クロマトグラフィに付すことによってジアンヒドロガラクチトールの試料を分析する；次いで
    （ｂ）ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度を測定する；
    ことを含む分析方法。
23. ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物が少なくとも１種の（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の夾雑物；および（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解生成物である、請求項２２に記載の分析方法。
24. 等移動相がＮａＯＨであり、およびＮａＯＨの濃度が約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項２２に記載の分析方法。
25. ＮａＯＨの濃度が約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項２４に記載の分析方法。
26. ＮａＯＨの濃度が約１ｍＭである、請求項２５に記載の分析方法。
27. 等移動相が水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との組合せであり、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項２２に記載の分析方法。
28. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである、請求項２７に記載の分析方法。
29. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との総濃度が約１ｍＭである、請求項２８に記載の分析方法。
30. 水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩との割合が約５０：５０である、請求項２７に記載の分析方法。
31. ジアンヒドロガラクチトールそれ自体以外の化合物を示す高速液体クロマトグラフィにより分離される１個または２個以上のピークの相対濃度の測定工程を蒸発光散乱検出によって行う、請求項２２に記載の分析方法。
32. 蒸発光散乱検出がエレクトロスプレイＬＣ／ＭＳと両立する、請求項３１に記載の分析方法。
33. 蒸発光散乱検出が１００％水性移動相の蒸発を強化するための揮発性溶媒のポスト−カラム添加を含む、請求項３２に記載の分析方法。
34. 揮発性溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群から選択される、請求項３３に記載の分析方法。
35. エレクトロスプレイタンデム質量分析計を配置し、ＥＬＳＤを備えたＨＰＬＣ装置にオンラインで接続する、請求項２２に記載の分析方法。
36. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在することができる夾雑物および分解生成物のそれぞれに係わる化学情報を提供するタンデム質量分析データを採集する、請求項２５に記載の分析方法。
37. ＨＰＬＣと組合されたタンデム質量分析が分子イオン情報および見出される夾雑物および分解生成物のそれぞれに係わる分子イオン情報と一致する分子量を有する可能な化学構造を提供する、請求項３６に記載の分析方法。
38. 夾雑物および分解生成物の少なくとも１種をカラムクロマトグラフィにより分離し、引続く固形未知試料を得るための少なくとも１種の精製処理によって同定する、請求項３６に記載の分析方法。
39. 固形未知試料を核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）、フーリエ変換赤外線分光分析（ＦＴ−ＩＲ）、元素分析、ＨＰＬＣによる純度の測定、およびカールフィッシャー滴定法による水含有量の測定からなる群から選択される少なくとも１種の標準的分析方法によって同定し、確認する、請求項３８に記載の分析方法。
40. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の特定の物質のピークの調整用ＨＰＬＣ採集を行う工程をさらに含む、請求項２２に記載の分析方法。
41. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の物質のピークが夾雑物である、請求項４０に記載の分析方法。
42. ジアンヒドロガラクチトールの試料中に存在する少なくとも１種の物質のピークが分解生成物である、請求項４０に記載の分析方法。