JPH09229920A - グラジェント液体クロマトグラフィー溶離液の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】グラジェント液体クロマトグラフィーによ
りカラムから連続的に流出する溶離液を検出器に導入す
る前に処理する方法であって、該溶離液に追加溶離液を
その組成を変化させながら混合して、溶離物質を除く溶
離液成分の組成が検出中に実質的に変化しないようにし
たことを特徴とする溶離液の処理方法。 【効果】本発明の溶離液の処理方法によると、いかなる
グラジェント分離に対してもキャピラリー管での線速度
や溶離液組成を一定に保つことができ、各種検出器によ
る溶離液の安定かつ正確な測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グラジェント液体
クロマトグラフィー溶離液の処理方法に関し、より詳細
には、追加溶離液の混合により溶離液成分の組成が検出
中に実質的に変化しないようにした、グラジェント液体
クロマトグラフィー溶離液の処理方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、質量分析法に関しては、ＦＡＢ
（高速中性原子衝撃イオン化法），ＦＤ（電界脱離イオ
ン化法），ＴＳＰ（サーモスプレーイオン化法），ＡＰ
ＣＩ（大気圧下化学的イオン化法），ＥＳＩ（エレクト
ロスプレーイオン化法）と呼ばれる種々のソフトイオン
化法、構造解析に非常に有効な方法であるＭＳ／ＭＳ
法、超高分子領域まで質量分析できるＦＴ−ＭＳ（フ−
リエ変換式質量分析装置），ＴＯＦ／ＭＳ（飛行時間型
質量装置）が開発されたことにより、この分野における
測定技術や解析理論が急速に進歩している。

【０００３】そのようなＭＳ新技術開発の中、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＬＣ）の検出器に質量
分析装置（ＭＳ）をオンライン接続したＬＣ／ＭＳが、
新規複合化構造解析技術あるいは新規複合化分離技術と
して急速に発達しており、合成研究から環境衛生研究や
薬物動態研究に至るまで幅広い分野の分析研究に応用さ
れている。

【０００４】従来より未知化合物の構造解析を行なう場
合、未知成分をカラムクロマトやＨＰＬＣにより分取精
製し、ＮＭＲ，ＩＲ，ＵＶ，ＭＳ等で得られるスペクト
ルにより構造解析を行なっている。この方法は現在のと
ころ最も確実な構造解析が行える方法であるが、解析に
時間や手間がかかり非効率であることが最大の難点であ
る。一方、ＬＣ／ＭＳを構造解析の手段として使用した
場合、ＨＰＬＣ分離後、直接オンラインで質量分析がで
きるため、ＨＰＬＣの極性分離的解析、ＭＳスペクトル
やＭＳクロマトグラム解析、合成あるいは反応経路の推
定等を加味することにより、未知成分を迅速にある程度
まで構造解析ができる。つまり、ＬＣ／ＭＳは、確実に
全ての未知成分の構造解析ができる方法ではないが、未
知成分構造解析の一次スクリーニング的な分析には非常
に迅速かつ有効な方法であるといえる。

【０００５】また、混合物の定量分析は、通常ＨＰＬＣ
により極性分離を行ない得られるクロマトグラムのピー
ク面積から算出して行なう。この定量方法は汎用的に行
なわれているが、現在検出器として用いられているＵ
Ｖ，ＲＩ，ＥＬＳＤは未知化合物に対し選択的検出がで
きないことや、混合物中の極微量成分の定量分析ができ
ないことに難点がある。これに対しＬＣ／ＭＳを混合物
の定量分析の手段として使用した場合、ＨＰＬＣだけで
は分離が不十分なピークであっても質量分離によりピー
ク分離ができるため正確に混合物の選択的検出ができ
る。また、ノイズに埋もれている極微量成分ピークであ
っても、ＭＳの高感度かつ選択的な質量分離によりピー
ク抽出をし正確な定量分析ができる。つまり、ＬＣ／Ｍ
Ｓは、ＭＳの高感度に質量分離ができる選択的検出器の
特徴を活かすことにより、より正確に混合成分の定量分
析ができる非常に有効な方法であるといえる。

【０００６】従って、このような高度解析用のＭＳは、
数々の合成物質や配合組成物の成分の構造解析に広く利
用することができると考えられる。しかし、実際にはこ
のシステムでは、以下で述べる問題のため、混合微量成
分の詳細な構造解析や特定成分の微量定量分析など、Ｍ
Ｓの特徴を活かした分析はできていなかった。

【０００７】例えば、ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシ
ステム（多孔板上連続高速中性原子衝撃イオン化ＬＣ／
ＭＳシステム）について言えば、測定そのものが難しい
状態で、得られるＬＣ／ＭＳのトータルイオンクロマト
グラムもＳ／Ｎ（シグナルノイズ比）が悪く解析できな
いという大きな問題を抱えていたため、ＬＣ／ＭＳを微
量混合成分の構造解析などの分析手段として活用するこ
とができなかった。従って、このような問題により、正
確で詳細なＭＳスペクトルやＭＳクロマトグラムが得ら
れず、微量混合成分の構造解析を行なうことは不可能で
あった。

【０００８】ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳは、ＬＣ／
ＭＳシステムとしては初期に開発された装置で、高度構
造解析用であるがＬＣ／ＭＳ専用機として開発された装
置ではない。従ってこのシステムは、溶媒除去用の予備
差動排気室を持っておらず、ＭＳの高真空度を維持する
必要があるため、溶離液の流速に関しては大きな制限が
ある。具体的には、溶離液の流速は最大でも数μｌ／ｍ
ｉｎという制限があるため、コンベンショナルなＨＰＬ
Ｃとオンライン接続するためには、溶離液の９９．５％
以上をスプリットアウトしなくてはいけない。つまり、
ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステムは、溶離液の流
速をｍｌ／ｍｉｎオーダーから数μｌ／ｍｉｎオーダー
まで流量コントロールできる空気圧スプリッター装置を
システムに組み込むことでオンライン分析を可能として
いる。

【０００９】図１にかかる空気圧スプリッター装置の例
を示す。アイソクラティックＨＰＬＣ、即ち溶離液組成
の変化しない一液系のＨＰＬＣから送液された溶離液１
は、汎用的もしくは一般的に使用されているＬＣ分離用
カラム２での分離後、空気圧スプリッター７によりスプ
リット（分配）され、Ｔバー３を通じてキャピラリー４
に導入される。溶離液のスプリット比あるいはＭＳ導入
量は、プレッシャーレギュレーター８やガスフローバル
ブ１１によりコントロールされる。

【００１０】ＭＳ導入部に用いられるキャピラリーは、
溶液の流動性に対して高い抵抗力を持つため、ＭＳの高
真空を維持するためには絶対必要な物である。しかし、
キャピラリー管での溶液の流動性に対する高い抵抗力に
より、ＬＣポンプの圧力だけでは充分な量の溶離液がキ
ャピラリー内に侵入しないので、廃液側の配管に背圧を
かける必要がある。つまり、背圧をかけられる空気圧ス
プリッターを用いることで、溶離液をキャピラリー内に
侵入させている。この装置は、アイソクラティック（一
液系）の溶離液であれば、背圧コントロールすることで
キャピラリー管内の溶離液の流速がコントロールできる
装置である。

【００１１】この様に、空気圧スプリッター装置は、Ｆ
ＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステム上どうしても必要
な装置であるが、溶離液のグラジェントによる溶液の粘
性や流動性や組成比の変化に対し、キャピラリー管内で
の線速度や溶媒組成が変化し、イオン化条件が変化した
りクロマトグラムのピーク変動が起こり、得られるクロ
マトグラムのＳ／Ｎが悪く、安定したＭＳ測定ができな
い、という大きな問題がある。また、上記システムに限
らず、他のシステムにおいても溶離液の線速度や溶媒組
成が変化すると、スペクトルやクロマトグラムのベース
ライン悪化やピーク消失など種々の問題が生じる場合が
ある。

【００１２】一般的にＨＰＬＣの分離分析では、グラジ
ェント分析はより幅広い極性物質を短時間に正確に分離
分析できる手法として用いられている。従ってＦＲＩＴ
−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳにおいてもグラジェント分析は幅
広い極性物質の詳細な構造解析をするのに有効な方法で
あるが、空気圧スプリッター装置はこのＬＣ分離時のグ
ラジェント変化に対し一定のスプリット比でスプリット
することができない。すなわち、空気圧スプリッター
は、グラジェント分析時にＭＳへの溶離液導入量を完全
にコントロールできない。

【００１３】例えば、流動性の高い溶離液や粘性の低い
溶離液が空気圧スプリッター装置に導入されると、廃液
側にどんどん排出され、スプリッター背圧が減少するこ
とによりキャピラリーでの溶離液の線速度は減少する。
逆に流動性の悪い溶離液や粘性の高い溶離液が空気圧ス
プリッター装置に導入されると、廃液側の排出量は減少
し、スプリッター背圧が増加することによりキャピラリ
ーでの溶離液の線速度は増加する。このような線速度の
変化は、得られるクロマトグラムのサンプルピークの保
持時間変動を起こすだけでなく、サンプル導入量変化に
よるピーク強度変動を引き起こし、同時に測定されるＵ
ＶやＲＩやＥＬＳＤ検出器により得られたＨＰＬＣクロ
マトグラムとの比較が困難になってしまう。つまり、微
量混合成分由来ピークの位置関係が分らなくなってしま
う。また、ＭＳ内部へ導入される溶離液の組成変化は、
溶離液の揮発性や熱容量の変化を伴うため、イオン源温
度やＭＳ真空度などのＭＳイオン化環境に影響を与え、
最適なイオン化条件を維持できなくなる。

【００１４】従来、これら２つの影響により、ＭＳイオ
ン化条件が不安定となり、正確で詳細な再現性のあるＭ
ＳスペクトルやＭＳクロマトグラムが得られなくなって
いた。装置メーカーでもグラジェントモードでのＭＳイ
オン化の不安定性に関する問題点は認識され、イオン化
条件が安定するようなシステムの改良検討が行なわれて
いる。

【００１５】例えば空気圧スプリッターを改良するもの
として、特開平５−２９９０５３号公報には抵抗管つき
排出流路を用いて溶離液の粘性変化の影響を少なくし
て、イオン源に導入される溶離液の流量をグラジェント
に対して一定化する方法が開示されている。また、グラ
ジェントに対して溶離液の霧化温度やＭＳ内部の温度を
コントロールしイオン化条件を一定に維持できる測定シ
ステムの開発（特開平３−１９４４６６号公報、特開平
５−９９９１１号公報、特開平６−３０８０８６号公
報）、及びグラジェントに対して排出弁を調整してＭＳ
内部の真空度をコントロールしイオン化条件を一定に維
持できる測定システムの開発（特開昭６４−７７８５５
号公報）、等が行なわれている。

【００１６】しかしながら、これらの装置自体にもそれ
ぞれ問題点があり、例えば抵抗管つき排出流路を用いる
方法では、溶離液導入量を変更したい場合は抵抗管を取
り替える必要があること、導入量は一定にできるが溶離
液組成は変化するためＭＳイオン化条件に影響を与える
ことが挙げられる。また、溶離液の霧化温度やＭＳ内部
の温度をコントロールする方法では、装置が大がかりで
個人では開発できないこと、測定条件検討に相当時間が
かかること、システム導入のためのコストがかかること
が挙げられる。更に排出弁を調整してＭＳ内部の真空度
をコントロールする方法では精度よく調整することが困
難で、グラジェント分離に対してＭＳ内部への導入量や
溶離液組成が変化することが挙げられる。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、かか
る課題を解決すべく、いかなるグラジェント分離に対し
てもキャピラリー管での線速度や溶離液組成を一定に保
つことができ、各種検出器による溶離液の安定かつ正確
な測定が可能となる溶離液の処理方法を提供することに
ある。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、検出器に
導入する前の溶離液に追加溶離液をその組成を変化させ
ながら混合して、溶離物質を除く溶離液成分の組成が検
出中に実質的に変化しないようにすることにより、上記
目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至
った。

【００１９】即ち、本発明の要旨は、（１） グラジェ
ント液体クロマトグラフィーによりカラムから連続的に
流出する溶離液を検出器に導入する前に処理する方法で
あって、該溶離液に追加溶離液をその組成を変化させな
がら混合して、溶離物質を除く溶離液成分の組成が検出
中に実質的に変化しないようにしたことを特徴とする溶
離液の処理方法、（２） 追加溶離液の組成を変化させ
る方法が、グラジェント液体クロマトグラフィー用ポン
プを用いて、カラムに導入する溶離液のグラジェントの
変化に対応してそれを相殺する組成の追加溶離液を混合
する方法である上記（１）記載の溶離液の処理方法、
（３） 検出中における溶離液成分の組成の変化が、各
成分でそれぞれ±５％の範囲内である上記（１）又は
（２）記載の溶離液の処理方法、（４） 検出器が、質
量分析検出器（ＭＳ）、核磁気共鳴検出器（ＮＭＲ）、
赤外線吸収検出器（ＩＲ）、示差屈折検出器（ＲＩ）、
又は光散乱レーザー検出器（ＥＬＳＤ）である上記
（１）〜（３）いずれか記載の溶離液の処理方法、
（５） 検出器が質量分析検出器（ＭＳ）であり、追加
溶離液がイオン化促進剤とともに供給される上記（１）
〜（３）いずれか記載の溶離液の処理方法、に関する。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明の溶離液の処理方法は、グ
ラジェント液体クロマトグラフィーによりカラムから連
続的に流出する溶離液を検出器に導入する前に処理する
方法であって、該溶離液に追加溶離液をその組成を変化
させながら混合して、溶離物質を除く溶離液成分の組成
が検出中に実質的に変化しないようにしたことを特徴と
するものである。ここで、「溶離液成分の組成が検出中
に実質的に変化しない」とは、検出中における溶離液成
分の組成の変化により、検出に悪影響を与えない程度に
組成変化が少ないことをいい、好ましくは検出中におけ
る溶離液成分の組成の変化が、各成分でそれぞれ±５％
の範囲内、より好ましくは±３％の範囲内である。

【００２１】本発明では、上記のように追加溶離液の組
成を変化させて溶離物質を除く溶離液成分の組成が検出
中に実質的に変化しないようにして、検出器に導入され
る溶離液混合物の流量が検出中に実質的に変化しないよ
うにすることができる。

【００２２】即ち、一般的にグラジェントモードによる
ＨＰＬＣ分析では、溶離液成分の組成が実質的に変化し
なければその流動性も変化しないため、キャピラリーと
空気圧スプリッター装置等の組み合わせにより、キャピ
ラリー中の線速度を一定にすることが可能である。な
お、本発明ではカラムに導入する溶離液の流量が変化す
る場合でも、追加溶離液の供給量を変化させることによ
り、混合後の溶離液混合物の流量を実質的に変化しない
ようにすることも可能である。

【００２３】グラジェント液体クロマトグラフィーにつ
いては、溶離液がグラジェントされる形式のものであれ
ばクロマトグラフィーの種類は特に限定されることはな
い。例えば吸着クロマトグラフィー、順相系クロマトグ
ラフィー、逆相系クロマトグラフィー、サイズ排除クロ
マトグラフィー等が挙げられる。また、グラジェントの
形式も、勾配式と段階式のいずれでもよい。

【００２４】また、用いられる溶離液としては、通常の
グラジェント液体クロマトグラフィーに用いられるもの
であれば特に限定されることなく、例えばメタノール、
エタノール、プロパノール、アセトニトリル、ヘキサ
ン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、水、クロロホル
ム、ジクロルメタン、トルエン等が挙げられる。

【００２５】本発明は、検出器に導入前の溶離液に追加
溶離液をその組成を変化させながら混合して、溶離物質
を除く溶離液成分の組成が検出中に実質的に変化しない
ようにするものであるが、当該追加溶離液の組成を変化
させる方法としては次の方法が挙げられる。

【００２６】例えば、グラジェント液体クロマトグラ
フィー用ポンプを用いて、カラムに導入する溶離液のグ
ラジェントの変化に対応してそれを相殺する組成の追加
溶離液を連続的に混合する方法（これには分離用と調製
用のポンプの流量は最初から同じで、組成のみを両者が
相殺されるように変化させるものも含まれる）、複数
の送液ポンプと溶離液タンク、及び流量制御手段の組み
合わせにより、溶離液のカラム導入と追加溶離液の混合
をトータルで制御する方法、カラムに導入される溶離
液の組成を検出してオンラインで追加溶離液の組成を制
御する方法等が挙げられるが、装置の簡便さ、コスト、
汎用性等の観点より上記の方法が好ましい。

【００２７】上記において、追加溶離液はそれ単独で供
給してもよいが、検出器の方式に応じて適宜添加される
添加剤と共に供給してもよい。例えば、検出器が質量分
析検出器（ＭＳ）でありイオン化促進剤の供給が必要な
場合には、追加溶離液をイオン化促進剤とともに供給す
ることができる。

【００２８】例えばＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳと呼
ばれるシステムでは、そのイオン化方法として高速原子
衝突法（ＦＡＢ：ＦＡＳＴ ＡＴＯＭ ＢＯＭＢＡＲＤ
ＭＥＮＴ）を採用しており、このようなシステムでは、
試料それだけではイオン化が困難であるため、イオン化
効率を向上させるためイオン化の際グリセリン等のイオ
ン化促進剤と呼ばれる添加剤を必要とする。このため追
加溶離液をイオン化促進剤とともに供給することが装置
構成を簡略化する上で好ましい。

【００２９】以上の本発明の処理方法により正確で再現
性があり、Ｓ／Ｎの良いスペクトルやクロマトグラムが
得られるようになった。即ち、グラジェントのＬＣ／Ｍ
Ｓ時の安定したＭＳイオン化を目的に、装置メーカーで
はシステム本体の改造や改良を行っているのに対し、本
発明の処理方法を利用すれば、グラジェントポンプを１
台追加しただけでよい。本発明の処理方法によれば、簡
単かつ安価なシステム変更でありながらグラジェントモ
ードのＬＣ／ＭＳ時でも安定したＭＳイオン化が可能
で、正確で再現性がありＳ／Ｎの良いスペクトルやクロ
マトグラムが得られるようになったため、汎用的なＬＣ
／ＭＳ技術として確立することができる。

【００３０】ＬＣ／ＭＳ法は、ＨＰＬＣの検出器にＭＳ
を用いた測定方法であり、ＭＳの高感度・質量選択的検
出ができる特徴から超微量分析や分析業務効率化を可能
にしたり、ＭＳスペクトルやＭＳ／ＭＳスペクトルやマ
スクロマトグラムの解析により有機化合物（および一部
の無機化合物）の同定や構造解析を可能にする等、分離
分析や構造解析手法としては非常に有効な分析方法であ
る。特に、本発明は、ＨＰＬＣと、質量分析検出器（Ｍ
Ｓ）、核磁気共鳴検出器（ＮＭＲ）、赤外線吸収検出器
（ＩＲ）、示差屈折検出器（ＲＩ）、又は光散乱レーザ
ー検出器（ＥＬＳＤ）等の検出器とのオンラインシステ
ムの最適化の際には効果的な方法として使用できるた
め、非常に応用範囲の広い技術と言える。

【００３１】近年、新しいＨＰＬＣ検出器としてＭＳ，
ＮＭＲ，ＩＲが検出器として応用されてきている。これ
らの検出器は、サンプルに対して選択的、高感度、定性
的検出が可能である。グラジェントＨＰＬＣは幅広い極
性を持つ混合物を短時間に分離できる非常に有効な方法
であるが、これらの検出器はグラジェント分離による溶
離液組成比変化に影響を受け易いため、スペクトルやク
ロマトグラムのベースライン悪化やピーク消失など種々
の問題が発生している。また、従来からのＲＩ，ＥＬＳ
Ｄ検出器も溶離液組成比変化に影響を受け易く、特にＲ
Ｉ検出器はグラジェントＨＰＬＣ時には使用できない。

【００３２】本発明の処理方法は、グラジェントＨＰＬ
Ｃ分離による溶離液組成比変化をアイソクラティックな
溶離液組成比にすることが可能なため、ＭＳ，ＮＭＲ，
ＩＲ，ＲＩ，ＥＬＳＤなどの検出器のＨＰＬＣとのオン
ライン化における種々の問題を解決し、これらの機器を
ＨＰＬＣ検出器として応用できる可能性がある。また、
今回は低圧グラジェント方法で検討したが、溶離液のミ
キシング能力の高い高圧グラジェント方法を採用すれ
ば、さらに溶離液環境を一定にすることが可能であろ
う。以下、種々の検出方式に対応する本発明の応用につ
いて述べる。

【００３３】（１）スプレー式ＬＣ／ＭＳへの応用 ＬＣ／ＭＳ専用機は、ＡＰＣＩ（ＡＴＭＯＳＰＨＥＲＩ
Ｃ ＰＲＥＳＳＵＲＥＣＨＥＭＩＣＡＬ ＩＯＮＩＺＡ
ＴＩＯＮ），ＴＳＰ（ＴＨＥＲＭＯ ＳＰＲＡＹ），Ｅ
ＳＩ（ＥＬＥＣＴＲＯ ＳＰＲＡＹ ＩＯＮＩＺＡＴＩ
ＯＮ），ＩＳＰ（ＩＯＮ ＳＰＲＡＹ），ＴＩＳ（ＴＵ
ＲＢＯ ＩＯＮ ＳＰＲＡＹ）と呼ばれるスプレー式イ
オン化方法が一般的となっている。前述のようにＦＲＩ
Ｔ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステムは、ＨＰＬＣ溶離液を
液体のままＭＳに導入しなくてはいけないため、溶離液
流量は最大でも数μｌ／ｍｉｎであるが、上記のスプレ
ー式ＬＣ／ＭＳシステムは、ＨＰＬＣ溶離液を予備差動
排気室で溶媒除去することができるため、溶離液流量は
最大２ｍｌ／ｍｉｎが可能である。

【００３４】この様に大量導入が可能であるスプレー式
ＬＣ／ＭＳシステムであるが、グラジェントＨＰＬＣ時
にスプレーノズル先端（スプレーＭＳイオン化部）やス
キマーコーン部（ＭＳ導入孔）での塩類の析出による目
詰まり問題が起こっている。このような塩の析出の結
果、ＭＳイオン化環境が変化し安定したＭＳ測定ができ
なくなる。グラジェントＨＰＬＣ分析は、短時間に幅広
い極性物質を分離できる非常に有効な方法であるが、分
離向上のため各種の塩の添加が行なわれており、塩は緩
衝液，イオンペア試薬，シラノール基吸着抑制剤として
使用され欠くことができない。この目詰まり問題の原因
としては、グラジェントの溶離液組成比変化により溶媒
の揮発性や熱容量が変化し、溶離液中の塩類の蒸発環境
が変化するためノズル先端やスキマーコーン部に析出す
ると考えられる。従って、このようなグラジェントＨＰ
ＬＣ／ＭＳ時の塩の析出による目詰まり問題に対して、
本発明の処理方法によりグラジェントＨＰＬＣによる溶
離液組成比変化をアイソクラティックな溶離液組成比に
することで、塩類の蒸発環境を一定にし塩の析出を防止
し目詰まりを防ぐことができることから、本発明は非常
に有効であるといえる。

【００３５】装置メーカーでもこの析出問題を解決する
方法として、スプレーノズルの形状改良、ＭＳイオン化
室温度と真空度のコンピュータコントロール化、および
ガスカーテンによるスキマーコーンの大径化など、が検
討されているが、ＭＳ装置そのものの改良が必要とな
り、コストもかかるため汎用的な方法とは言えない。こ
れに対し、本発明を利用したスプレー式ＬＣ／ＭＳシス
テムは、従来のシステムにグラジェントポンプを１台追
加しただけで塩類の析出問題を解決し、安定したＭＳ測
定を可能にする非常に有効なシステムと言える。

【００３６】（２）ＨＰＬＣ／ＮＭＲへの応用 近年のＮＭＲの高性能化が進み、ＮＭＲ測定に必要なサ
ンプル量は極微量になり、測定時間として秒単位での分
析が可能になってきた。そして、この高性能ＮＭＲをＨ
ＰＬＣの検出器として用いるＨＰＬＣ／ＮＭＲの開発が
行なわれている。ＬＣ／ＮＭＲは、ＮＭＲの構造解析機
器としての特徴を活かした検出方法により、定性分析を
目的とする連続フロー測定、詳細な構造解析を目的とす
るストップフロー測定など、種々の測定方法を行うこと
ができる。

【００３７】今後、分析分野においてＬＣ／ＮＭＲの有
効性が期待されるが、グラジェントＨＰＬＣ時に溶媒ロ
ックがかかりにくくなり、ＮＭＲ測定ができなくなって
しまう可能性がある。つまり、アイソクラティックＨＰ
ＬＣの場合は溶離液組成比が一定であるため溶媒ロック
がずれることはないが、グラジェントＨＰＬＣの場合は
溶離液組成比が変化により溶媒ロックがずれ、溶媒ロッ
クがかかりにくくなる。その結果ＮＭＲ測定ができなく
なり、ＮＭＲスペクトル情報が得られなくなるのに加
え、ＬＣ／ＮＭＲとしてのクロマトグラムも得られない
ため非常に大きな問題となる。

【００３８】このグラジェントＨＰＬＣ／ＮＭＲ時の溶
媒ロックずれ問題に対して、本発明の処理法は、グラジ
ェントＨＰＬＣによる溶離液組成比変化をアイソクラテ
ィックな溶離液組成比にすることができ溶媒ロックずれ
を防止できることから、非常に有効な方法であるといえ
る。

【００３９】（３）ＨＰＬＣ／ＩＲへの応用 ＦＴ−ＩＲなど装置の高性能化がすすみ、測定に必要な
サンプル量は微量になり、測定時間としてミリ秒単位で
の分析が可能となってきている。近年、このＦＴ−ＩＲ
を利用しＨＰＬＣの検出器として用いるＨＰＬＣ／ＦＴ
−ＩＲの開発が行なわれている。ＬＣ／ＩＲは、ＩＲの
構造解析機器としての特徴を活かした検出方法により、
官能基や構造選択的な定性的検出を行なうことができ
る。ＩＲは溶離液の影響を非常に受け易いので、ＨＰＬ
Ｃとのオンライン化においてはスポットスキャン方式
（ＩＲセル上で溶媒蒸発させ目的物を乾固し連続スポッ
ト測定する方法）やスプレースキャン方式（真空中に溶
離液を噴霧し溶媒除去した後、気化した目的物を測定す
る方法）などが検討されている。

【００４０】今後分析分野においてＬＣ／ＩＲの有効性
が期待されるが、グラジェントモードでのＬＣ／ＩＲ時
に、溶離液自身の揮発性の変化やＩＲ強度変化により、
ＩＲスペクトルやＬＣ／ＩＲクロマトグラムに影響を与
える問題がある。この問題は、アイソクラティックＨＰ
ＬＣの場合は溶離液組成比が一定であるため溶媒の揮発
性や熱容量に変化はなく溶媒除去条件は一定であるが、
グラジェントＨＰＬＣの場合は溶離液組成比が変化する
ことで、溶媒の揮発性や熱容量が変化し溶媒除去条件が
変化することでおこる。その結果、ＩＲスペクトルやＬ
Ｃ／ＩＲクロマトグラムは、溶媒のＩＲ強度の変化によ
る影響を受け、ベースライン変動が起こってしまう。こ
のグラジェントＨＰＬＣ／ＩＲ時の溶媒によるＩＲ強度
変化の問題に対して、本発明の処理方法は、グラジェン
トによる溶離液組成比変化をアイソクラティックな溶離
液組成比にすることで溶媒除去条件を一定にし、溶離液
のＩＲ強度変化の影響を最小にすることができることか
ら、非常に有効な方法であるといえる。

【００４１】（４）ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤへの応用 ９４年より素材研においてＥＬＳＤ（光散乱レーザー検
出器）がＨＰＬＣの検出器として検討され、現在では各
種分離分析に応用されている。このＥＬＳＤ検出器は、
大気圧下の高温空気に溶離液をスプレーすることで噴霧
状態となった液滴にレーザー光を当て散乱強度変化を検
出する装置である。ＥＬＳＤの特徴は、光学的吸収の無
い化合物を検出できるだけでなく、グラジェントＨＰＬ
Ｃの溶離液組成比変化に対しても影響を受けにくいこと
から、ＨＰＬＣ分離分析には有効な検出器である。

【００４２】現在分析分野においてＬＣ／ＥＬＳＤを有
効に活用しているが、グラジェントＨＰＬＣ時にスプレ
ーノズル先端での塩類の析出による目詰まり問題が起こ
っている。塩の析出の結果、スプレーによる噴霧状態が
変化し安定したＥＬＳＤ検出ができなくなり、特にピー
ク強度の安定性や再現性に影響を与える。（グラジェン
トＨＰＬＣ分析は、短時間に幅広い極性物質を分離でき
る非常に有効な方法である。分離向上のため各種の塩の
添加が行なわれているが、塩は緩衝液，イオンペア試
薬，シラノール基吸着抑制剤として使用されており、欠
くことができない。）この塩析出問題の原因としては、
グラジェントの溶離液組成比変化により溶媒の揮発性や
熱容量が変化し溶離液中の塩類の蒸発環境が変化するた
め、スプレーノズル先端に塩が析出すると考えられる。
このグラジェントＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ時のスプレー先端
での塩析出問題に対して、本発明の処理方法は、グラジ
ェントによる溶離液組成比変化をアイソクラティックな
溶離液組成比にすることで、塩類の蒸発条件を一定にし
塩の析出を防止することができることから、非常に有効
な方法であるといえる。今後、定量分析などクロマトグ
ラムの高度な再現性を要求する測定に対し、この方法を
応用していきたい。

【００４３】（５）ＨＰＬＣ／ＲＩへの応用 従来より、ＨＰＬＣの検出器としてＲＩ（示差屈折検出
器）が幅広く分離分析に利用されている。このＲＩ検出
器は、対象溶媒に対する溶離液の屈折率の変化を検出す
る装置であり、光学的吸収の無い化合物でも検出できる
ことが特徴である。しかし、対象溶媒に対する示差屈折
検出のため、グラジェントＨＰＬＣの溶離液組成比変化
に対して大きな影響を受けることから、アイソクラティ
ックモードのＨＰＬＣ分析しか使用できない検出器であ
る。今後、本発明を利用したＬＣ／ＩＲは、ポンプコン
トロール性向上・高圧グラジェントの採用・ミキシング
チャンバーの改良・デッドボリュームの最小化・装置の
一体化などＨＰＬＣ周辺装置の最適条件化ができれば、
グラジェントモードＬＣによる溶離液組成比変化を完全
にアイソクラティックな溶離液組成比にすることができ
るため、グラジェントＨＰＬＣの検出器としてＲＩを使
用できる可能性がある。

【００４４】

【実施例】以下、実施例および参考例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。

【００４５】参考例 図２に、混合物サンプル（アルキルサルフェートソーダ
（Ｒ：Ｃ１２〜１８、Ｃ１８Ｆ₁ ）の、従来法によるグ
ラジェントモードでの（Ａ）ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／
ＭＳと、（Ｂ）ＬＣ／ＥＬＳＤによるクロマトグラムの
例を示す。ＬＣ／ＭＳクロマトグラムは、ＬＣ／ＥＬＳ
Ｄクロマトグラムと比較すると、再現性が悪いためクロ
マトグラム間のピーク比較が困難で、Ｓ／Ｎが悪いため
ベースラインノイズが大きくなりほとんどの微量混合成
分がピークとして現れていないため、同定や構造解析は
非常に困難であった。

【００４６】実施例 ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステムにおける本発明
の有効性を検討した。図３に、従来法によるグラジェン
トモードでのＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステムを
示す。分離用カラム２８より流出したグラジェントＨＰ
ＬＣ溶離液は、ポストカラム方式でイオン化促進剤溶液
２６とミキシングチャンバー２１で混合される。従来法
では、ポストカラムにより添加されるイオン化促進剤溶
液はアイソクラティックな溶液であるため、ミキシング
チャンバーでの混合後も溶離液はグラジェント状態のま
ま空気圧スプリッターへ導入され、空気圧スプリッター
背圧に影響を与える問題があった。その結果、キャピラ
リーでの線速度が変化かつ溶媒組成が変動するため、Ｍ
Ｓイオン化が不安定になり正確なＭＳ測定ができなかっ
た。

【００４７】図４に、本発明の処理方法を利用したグラ
ジェントモードでのＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシス
テムを示す。分離用カラム２８より流出したグラジェン
トＨＰＬＣ溶離液は、ポストカラム方式によりイオン化
促進剤を含む溶離液とミキシングチャンバー２１で混合
されるが、本発明の最大の特徴は、グラジェントポンプ
３１を用いることにより、ポストカラムにより添加され
るイオン化促進剤溶液の溶媒もグラジェントモードで溶
媒組成を変化させられることである。そのため、ＨＰＬ
Ｃのグラジェントによる溶離液組成変化を、ミキシング
チャンバーでの混合により一定の溶媒組成にすることが
可能である。つまり、グラジェントＨＰＬＣの溶離液組
成変化を追加溶離液の溶媒組成比変化で打ち消すような
設定をすることにより、ミキシングチャンバーでの溶離
液をアイソクラティックな環境にすることができる。そ
の結果、どんなグラジェントＨＰＬＣ測定を行なって
も、空気圧スプリッターでの溶離液組成は一定となるた
め、キャピラリーでの線速度と溶離液組成は一定にな
り、安定したＭＳイオン化が可能になる。

【００４８】図５に、ＨＰＬＣグラジェントモードプロ
グラム（Ａ）と、従来のグラジェントＬＣ／ＭＳ法
（Ｂ）および本発明を利用したグラジェントＬＣ／ＭＳ
法（Ｃ）によるミキサー位置でのメタノール比の変化を
示す。ＨＰＬＣグラジェントモードの影響で、従来法の
グラジェントＬＣ／ＭＳ法ではメタノール比が変化して
いるのに対し、本発明によるグラジェントＬＣ／ＭＳ法
ではメタノール比が一定になっている。

【００４９】図６に、ＨＰＬＣグラジェント条件により
影響を受ける従来のグラジェントＬＣ／ＭＳ法（Ａ）
と、本発明を利用したグラジェントＬＣ／ＭＳ法（Ｂ）
における、空気圧スプリッター背圧（ｋｇ／ｃｍ² ）と
キャピラリー線速度（μｌ／ｍｉｎ）の変化を表わすグ
ラフを示す。従来のグラジェント法では、ＨＰＬＣグラ
ジェントにより溶離液組成が変化すると空気圧スプリッ
ター背圧が変化するため、キャピラリー線速度にも影響
を与えていた。それに対し、本発明によるグラジェント
法では、ＨＰＬＣグラジェントでカラムに導入される溶
離液の組成が変化しても、ポストカラム方式によりミキ
シングチャンバー位置で溶離液を一定の溶媒組成にする
ことができるため、空気圧スプリッター背圧はほとんど
変化せず、キャピラリー線速度にもほとんど影響を与え
ていない。

【００５０】図７に、従来法であるグラジェント法
（Ａ）と本発明を利用したグラジェント法（Ｂ）による
混合物サンプルのＬＣ／ＭＳクロマトグラムの例を示
す。測定条件は次の通りである。

【００５１】ＨＰＬＣ用ポンプ：日立６５５Ａ−１１型
ＬＣポンプ、日立６５５Ａ−７１型プロポーショニング
バルブポストカラム用ポンプ ：日立６５５Ａ−１１型ＬＣポン
プ、日立６５５Ａ−７１型プロポーショニングバルブ分離用カラム ：ＴＳＫ−ｇｅｌ ８０ＴＳ，４．６×１
５０ｍｍ，２５℃（東ソー製）溶離液 ：ＭｅＯＨ（関東化学）ＨＰＬＣ用 Ｈ₂ Ｏ（Millipore によるＬＣ用イオン交換水）イオンペア試薬 ：ＣＨ₃ ＣＯＯＮＨ₄ （片山化学）特級イオン化促進剤 ：グリセリン（和光純薬）特級ミキシングチャンバー ：THE LEE COMPANY 製スプリッター ：日本電子製、純正品、スプリット比１／
８００キャピラリー ：日本電子製、純正品、６０μｍI.D.×１
００ｃｍフリット板 ：日本電子製、純正品

【００５２】ＭＳ：日本電子製、ＪＭＳ−ＳＸ102 ／Ｓ
Ｘ102 ，タンデム型質量分析装置 ＜条件＞ IONIZING VOLT 70Ｖ CHAMBER TEMP 60℃ ACCEL 8.0KV POST ACCELL -10.0KV ION MULTI -1.4 EMISSION CURRENT 10mA POLARITY − MAGNETIC FIELD HS DETECTOR GAIN 1 SCAN RANGE 300-500 CYCLE TIME 2S

【００５３】＜グラジエント、ポストカラムグラジエン
ト（溶液パターン）＞Ａ法：通常のグラジエント法 Ａ液（グラジエント分離用溶離液、３０mM酢酸アンモニ
ウム／メタノール溶液） Ｂ液（グラジエント分離用溶離液、３０mM酢酸アンモニ
ウム／水溶液） Ｃ液（ポストカラム用イオン化促進剤溶液、３％グリセ
ロール／メタノール溶液）

【００５４】

【表１】

【００５５】Ｂ法：ポストカラムグラジエント法 Ａ液（グラジエント分離用溶離液、３０mM酢酸アンモニ
ウム／メタノール溶液） Ｂ液（グラジエント分離用溶離液、３０mM酢酸アンモニ
ウム／水溶液） Ｃ液（ポストカラム用イオン化促進剤溶液、３％グリセ
ロール／メタノール溶液） Ｄ液（ポストカラム用イオン化促進剤溶液、３％グリセ
ロール／水溶液）

【００５６】

【表２】

【００５７】図８は、図７の各ＬＣ／ＭＳクロマトグラ
ムのベースライン部（保持時間Ｒ．Ｔ．＝６分３８秒〜
１９分５８秒）の拡大図を示すものであり、（Ａ）は従
来のグラジェント法の場合であり、（Ｂ）は本発明によ
るグラジェント法の場合である。図９は、図７の各ＬＣ
／ＭＳクロマトグラムの主ピーク存在部（保持時間Ｒ．
Ｔ．＝３３分１７秒〜４９分５７秒）の拡大図を示すも
のであり、（Ａ）は従来のグラジェント法の場合であ
り、（Ｂ）は本発明によるグラジェント法の場合であ
る。

【００５８】従来法では、再現性が悪く、また図８
（Ａ）の示すようにベースラインノイズも大きいため、
微量混合成分のピーク判別や検出が困難であった。本発
明によるグラジェント法では、再現性が向上するととも
に、図８（Ｂ）の示すようにベースラインノイズも小さ
くなり、微量混合成分由来のピークも明確になった。ま
た、図９の（Ａ）と（Ｂ）の対比より保持時間にずれが
生じていることがわかり、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ測定によ
るデータとの対比より、本発明によるグラジェント法の
場合（Ｂ）がより正確であることが判明した。

【００５９】以上より、本発明の溶離液の処理方法を利
用した、グラジェント法によるＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ
／ＭＳシステムを用いると、ＨＰＬＣでどのようなグラ
ジェント分離を行なっても、ポストカラム方式で溶離液
組成変化を打ち消すようなグラジェント溶液を添加する
ことにより、ミキシングチャンバーでアイソクラティッ
クな溶離液に変換することができる。その結果、ＭＳに
導入される溶離液の溶媒組成比や線速度は一定となり、
安定したＭＳイオン化が可能になるため、正確で再現性
がありＳ／Ｎの良いＭＳスペクトルやＭＳクロマトグラ
ムを得ることができるようになった。また、ベースライ
ンノイズの減少により微量混合成分のピークが明確にな
ったため、効率的に同定や構造解析が出来るようになっ
た。

【００６０】

【発明の効果】本発明の溶離液の処理方法によると、い
かなるグラジェント分離に対してもキャピラリー管での
線速度や溶離液組成を一定に保つことができ、各種検出
器による溶離液の安定かつ正確な測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、空気圧スプリッター装置の原理を説明
するための図である。

【図２】図２は、ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳとＬＣ
／ＥＬＳＤにより得られたクロマトグラムを対比したも
のであり、（Ａ）がＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳの場
合で、（Ｂ）がＬＣ／ＥＬＳＤの場合である。

【図３】図３は、従来法によるグラジェントモードでの
ＦＲＩＴ−ＦＡＢ−ＬＣ／ＭＳシステムの一例を示す図
である。

【図４】図４は、本発明の溶離液の処理方法を実施する
ための、グラジェントモードでのＦＲＩＴ−ＦＡＢ−Ｌ
Ｃ／ＭＳシステムの一例を示す図である。

【図５】図５は、あるグラジェントモードプログラム下
におけるミキサー位置でのメタノール比の変化を示すも
のであり、（Ａ）がＨＰＬＣグラジェントモードプログ
ラムを示し、（Ｂ）は従来のグラジェントＬＣ／ＭＳ法
でのメタノール比の変化であり、（Ｃ）は本発明による
グラジェントＬＣ／ＭＳ法でのメタノール比の変化を示
すものである。

【図６】図６は、グラジェントＬＣ／ＭＳ法における空
気圧スプリッター背圧（ｋｇ／ｃｍ² ）とキャピラリー
線速度（μｌ／ｍｉｎ）の変化を表わすグラフを示すも
のであり、（Ａ）はＨＰＬＣグラジェント条件により影
響を受ける従来のグラジェントＬＣ／ＭＳ法の場合であ
り、（Ｂ）は本発明によるグラジェントＬＣ／ＭＳ法の
場合である。

【図７】図７は、混合物サンプルのＬＣ／ＭＳクロマト
グラムの例を示すものであり、（Ａ）は従来のグラジェ
ント法の場合であり、（Ｂ）は本発明によるグラジェン
ト法の場合である。

【図８】図８は、図７の各ＬＣ／ＭＳクロマトグラムの
ベースライン部の拡大図を示すものであり、（Ａ）は従
来のグラジェント法の場合であり、（Ｂ）は本発明によ
るグラジェント法の場合である。

【図９】図９は、図７の各ＬＣ／ＭＳクロマトグラムの
主ピーク存在部の拡大図を示すものであり、（Ａ）は従
来のグラジェント法の場合であり、（Ｂ）は本発明によ
るグラジェント法の場合である。

【符号の説明】

１ 溶離液 ２ 分離用カラム ３ Ｔバー ４ キャピラリー ５ ＭＳ ６ 背圧用ガス ７ 空気圧スプリッター ８ プレッシャーレギュレーター ９ ストップバルブ １０ プレッシャーゲージ １１ ガスフローバルブ １２ 廃液・排ガス ２１ ミキシングチャンバー ２２ 空気圧スプリッター ２３ キャピラリー ２４ 溶離液 ２５ 溶離液 ２６ 追加溶離液 ２７ グラジェントＬＣ用ポンプ ２８ 分離用カラム ２９ 廃液タンク ３０ ＭＳ ３１ グラジェントＬＣ用ポンプ ３２ 追加溶離液

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 24/08 Ｇ０１Ｎ 27/62 Ｘ 27/62 30/62 Ｅ 30/62 30/72 Ｃ 30/72 30/74 Ｅ 30/74 Ｚ 24/08 ５１０Ｚ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グラジェント液体クロマトグラフィーに
   よりカラムから連続的に流出する溶離液を検出器に導入
   する前に処理する方法であって、該溶離液に追加溶離液
   をその組成を変化させながら混合して、溶離物質を除く
   溶離液成分の組成が検出中に実質的に変化しないように
   したことを特徴とする溶離液の処理方法。
2. 【請求項２】 追加溶離液の組成を変化させる方法が、
   グラジェント液体クロマトグラフィー用ポンプを用い
   て、カラムに導入する溶離液のグラジェントの変化に対
   応してそれを相殺する組成の追加溶離液を混合する方法
   である請求項１記載の処理方法。
3. 【請求項３】 検出中における溶離液成分の組成の変化
   が、各成分でそれぞれ±５％の範囲内である請求項１又
   は２記載の処理方法。
4. 【請求項４】 検出器が、質量分析検出器（ＭＳ）、核
   磁気共鳴検出器（ＮＭＲ）、赤外線吸収検出器（Ｉ
   Ｒ）、示差屈折検出器（ＲＩ）、又は光散乱レーザー検
   出器（ＥＬＳＤ）である請求項１〜３いずれか記載の処
   理方法。
5. 【請求項５】 検出器が質量分析検出器（ＭＳ）であ
   り、追加溶離液がイオン化促進剤とともに供給される請
   求項１〜３いずれか記載の処理方法。