KR20160004733A

KR20160004733A - 마보플록사신의 혈중 농도 정량분석 방법

Info

Publication number: KR20160004733A
Application number: KR1020140083607A
Authority: KR
Inventors: 강정우; 이광직; 박해철; 장양호; 지순옥; 소병재
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부)
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2016-01-13

Abstract

본 발명은 동물에서 채취한 혈액에 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하여 마보플록사신을 추출하고, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계 및 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 혈액 시료 중의 마보플록사신의 농도를 정량 및 검증(validation)을 포함하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 제공한다.

Description

마보플록사신의 혈중 농도 정량분석 방법{Method of analyzing blood marbofloxacin concentration}

본 발명은 마보플록사신의 혈중 농도 정량분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물에서 채취한 혈액에 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하여 마보플록사신을 추출하고, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계 및 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 혈액 시료 중의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 마보플록사신의 혈중 농도 정량법 개발 및 검증 방법에 관한 것이다.

우리나라의 동물용 항균물질중 마보플록사신(maborfloxacin)은 최근 소·돼지의 폐렴과 유방염 등에 많이 사용되는 3세대 퀴놀론계 항균물질로서, 내성으로 약효가 떨어진 엔로플록사신(enrofloxacin)에 이어 새롭게 부상되는 항균 제제이기 때문에, 제조업체가 다양한 형태로 제품 개발 및 품목허가 신청을 추진 중에 있는 항균 물질이다.

최근 국가 잔류검사 프로그램(NRP) 결과, 돼지에서의 마보플록사신의 잔류 위반율이 매우 높게 나타나, 과학적인 투여 용법 및 투여 용량의 설정이 필요한 실정이다. 하지만, 현재 마보플록사신의 혈중 분석을 위하여 주로 사용되는 방법은 고압액체크로마토그래피(HPLC)로서, 상기 방법은 마보플록사신의 검출 한계는 100 ppb로서, 그 한계가 높은 관계로, 미량의 마보플록사신의 검출에 부적합한 방법이다.

그리고, 혈중 미량 존재하는 마보플록사신의 정량을 위해 상대적으로 검출한계가 낮은 LC-MS/MS 분석법이 개발되고 있지만, 대부분의 시료 전처리 방법에 고독성 에테르, 클로로포름 등과 같은 유기용매를 사용하여 인체에 유해한 방법을 이용하고 있는 실정이다.

또한, 회수율을 높이기 위해 유사 내부표준물질(ISTD)을 첨가하여 분석하는 방법을 사용하고 있지만(J. vet. Pharmacol. Therap. 33, 507510, 2009); J. vet. Pharmacol. Therap. 34, 8285, 2010), 아직까지 ISTD 사용 분석법에 대한 논란이 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 마보플록사신의 약동학 지표를 구하기 위해 혈중 농도측정이 필요하기에 LC-MS/MS를 이용하여 혈중 미량 존재하는 마보플록사신을 검출하는 방법을 개발하여 보다 검출한계 및 정량한계가 낮고 인체에 덜 유해한 분석방법을 제공하기 위함이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 동물에서 채취한 혈액에 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하여 마보플록사신을 추출하고, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계; 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 혈액 시료 중의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 제공한다.

본 발명에 의한 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법은 간편하고 신속하며, 독성이 적은 유기용매를 최소로 사용함으로써, 위해성이 낮을 뿐만 아니라, 소량의 시료중 미량으로 존재하는 마보플록사신을 신속하고 정확하게 측정할 수 있으므로, 마모플록사신의 안전성유효성 평가 및 다른 제형개발 등에 필요한 약동학적 지표 개발에 이용될수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 혈중 마보플록사신을 추출하기 위한 시료에서의 새로운 전처리 공정을 나타낸 것이다.
도 3a는 혈중 마보플록사신을 분석하기 위한 액체크로마토그래피(LC)의 이동상(mobile phase) 및 매스 스펙트로미터/매스 스펙트로미터(MS/MS)의 분석 조건을 나타낸 것이다.
도 3b는 액체크로마토그래피(LC) 이동상의 농도구배(샘플당 10분) 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 마보플록사신의 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring; MRM) 등 매스 크로마토그래피(mass chromatography)의 조건을 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 상기 도 4에 의한 다중 반응 검지법(MRM)의 조건으로 획득한 전구체 이온 및 프로덕트 이온의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 혈중 마보플록사신을 LC-MS/MS로 측정한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 7은 Codex에서 권고한 싱글 랩(single lab) 검증 기준법에 따라, 마보플록사신 LC-MS/MS 분석법을 검증(validation)한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 의한 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 이용하여 약동학적 지표(pharmacokinetic index)를 위한, 경로별 혈중 마보플록사신의 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 동물에서 채취한 혈액에 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하여 마보플록사신을 추출하고, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 혈액 시료 중의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 제공한다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법에서, 상기 “LC-MS/MS”라 함은, 액체크로마토그래피(LC)로 화합물을 분리한 뒤, 매스 스펙트로미터(MS)로 보내어 분석의 정량 및 전성까지 정확하게 분석하기 위한 시스템을 의미한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법에서, 상기 "MS/MS"는 두 종류의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 있는 시스템을 의미한다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 상기 전처리 단계에서, 부피 기준으로 상기 혈액 시료 대비, 2배 내지 4배의 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 상기 전처리 단계에서, 상기 혈액 시료 0.5㎖에 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴 1.5㎖을 첨가할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 상기 전처리 단계에서, 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴은 0.1%(v/v)의 포름산을 함유할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 상기 전처리 단계는 상기 추출한 마보플록사신을 원심분리하고, 농축하여 여과하는 단계를 포함할 수 있다

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 상기 전처리 단계에서, 상기 원심분리는 4,000g~6,000g, 바람직하게는 5,000g의 회전 속도로 20분~40분, 바람직하게는 30분 동안 수행하고, 상기 농축은 질소 분위기 하에서 상기 혈액 시료와 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴 부피 합의 1/3~1/5, 바람직하게는 1/4의 부피로 되도록 수행할 수 있다.

종래의 전처리법은 회수율을 보정하기 위해 마보플록사신 유사 동의원소를 내부 표준물질(internal standard; ISTD)로 첨가하거나, 혈액 시료에서 층분리가 가능한 에테르 및 클로로포름 등과 같은 독성 유기용매로 혈액 시료를 전처리하였지만, 본 발명에서는 상기 내부 표준물질(ISTD)을 사용하지 않고 유해성이 적은 아세토니트릴(acetonitrile) 만으로 시료에서 마보플록사신을 추출할 수 있고, 쉽고 간단하며 소량의 샘플, 바람직하게는 0.5㎖ 만을 사용하는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 전처리 단계에서, 포름산, 바람직하게는 0.1%(v/v)의 포름산을 사용하는 이유는, 본 발명에서 사용한 마보플로사신이 산성 조건에서 보다 잘 검출될 수 있기 때문이다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계에서, 상기 액체크로마토그래피의 이동상은, 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 증류수 및 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 아세토니트릴로 구성되고, 상기 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 증류수 0~90 중량% 및 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 아세토니트릴 10~100 중량%로 구성될 수 있다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계에서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring)의 조건은, 전구체 이온(precursor ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 363 m/z이고, 정량 이온(quantification ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 72 m/z이며, 확인 이온(confirmation ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 320 m/z일 수 있다. 상기에서 단위 "m/z"은 "질량/이온"을 의미한다.

본 발명에 의한 상기 혈중 농도 분석방법은 상기 (b) 단계 후에, 코데스(Codex)의 CAC/GL 71-2009의 동물 표적 조직(근육, 장기, 혈액 등) 분석에 대한 검증 기준에 의해, 검증하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 이용하여, 동물에서 채취한 혈액중 마보플록사신의 약동학적 지표를 측정하는 단계를 포함하는 약동학적 지표의 측정방법을 제공한다.

본 발명에 의한 상기 약동학적 지표의 측정방법에서, 상기 “약동학(pharmacokinetics)”라 함은, 생체에 투여한 약물(마보플록사신)의 체내 움직임과 그 해석 방법을 의미한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 약동학적 지표의 측정방법에서, 상기 “약동학적 지표(pharmacokinetics index)”라 함은, 마보플록사신의 동물 생체내 동태, 분포(distribution), 대사(metabolism), 배설(excretion) 등을 의미한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로서, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 혈중 마보플록사신 분석을 위한 혈액시료의 전처리

도 2에서 보는 바와 같이, 돼지로부터 채취한 소량의 시료 0.5㎖을 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 아세토니트릴 1.5㎖로 추출한 후, 5000g, 20분의 조건으로 원심분리한 다음, 질소 분위기에서 0.5㎖가 되도록 농축을 하고, 0.2㎛ 크기의 가스히트 펌프(gas engine heat pump)로 여과하여 혈중 마보플록사신의 농도 측정을 위한 전처리를 하였다.

< 실시예 2> 마보플록사신 분석을 위한 LC - MS / MS 분석 조건의 확립

분석기기로 아질런트(Agilent)사의 6410 모델을 사용하여, 도 3(a) 및 도 3(b)와 같은 LC 분석 조건을 확립하였다.

도 3(a)를 참조하면, 마보플록사신 분석을 위한 액체 크로마토그래피의 이동상(mobile phase)은 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수(A)와 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B)을 사용하였다.

또한, 도 3(b)는 액체크로마토그래피(LC) 이동상의 농도구배(샘플당 10분) 조건을 나타낸 것으로서, 도 3(b)를 참조하면, 상기 이동상의 농도구배는 0.1%v/v)의 포름산이 함유된 증류수(A) 0~90 중량% 및 0.1%(v/v)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B) 10~100 중량%로 구성됨을 알 수 있다.

한편, 도 4는 마보플록사신의 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring; MRM) 등 매스 크로마토그래피(mass chromatography)의 조건을 나타낸 것이고, 도 5a는 마보플록사신의 전구체(precursor) 이온 크로마토그램을 나타낸 것이며, 도 5b는 프로덕트(product) 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 4를 참조하면, 검출기(detector)인 매스 스펙트로미터(MS)로 분석하기 위한 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring)의 조건은, 전구체 이온(precursor ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 363 m/z이고, 프로덕트 이온(product ion)으로서 정량 이온(quantification ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 72 m/z이며, 확인 이온(confirmation ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 320 m/z 임을 알 수 있다.

또한, 5a 및 도 5b는 상기의 다중 반응 검지법(MRM)의 조건으로 획득한 전구체 이온 및 프로덕트 이온의 크로마토그램을 나타낸 것이다.

< 실시예 3> 확립된 LC - MS / MS 분석방법을 이용한 마보플록사신의 분석

상기 실시예 2에서 확립된 도 4에 기재된 조건으로 LC-MS/MS 분석을 한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 블랭크(blank) 시료(A)를 제외한 마보플록사신 표준품 100 ppb를 스파이크(spike)한 시료(B)와 실험 샘플(C)에서 마보플록사신의 피크가 나타남능 알 수 있다. 이때, 체류 시간(retention time)은 2.4분으로 동일하였으며, 정량 이온인 72 m/z의 피크가 측정되었다(도 6의 b 및 c 참조).

< 실시예 4> 확립된 LC - MS / MS 분석방법의 검증( validation )

상기 실시예 2 및 실시예 3에서 확립된 LC-MS/MS 분석방법을 국제기구인 코덱스(Codex)의 CAC/GL 71-2009에 의한 근육, 장기, 혈액 등의 동물 표적 조직 분석에 대한 검증기준(single lab validation)에 따라 검증한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

Analyte	RT (min)	STD curve(r²)	average recovery (%)		coefficient of variation (CV, %)		LOD (ng/mL)	LOQ (ng/mL)
			10ng/mL	100ng/mL	10ng/mL	100ng/mL
marbofloxacin	2.4	0.9999	92	87	4	5	2	5

상기 표 1 및 도 7을 참조하면, 표쥰 곡선(STD curve)의 검량선 직선성(calibration curve lineality)은 0.999 이상이고, 10 ng/㎖ 및 100 ng/㎖의 평균 회수율(average recovery %)은 92% 및 87%로 나타났다.

그리고, 분석의 반복 정밀도(coefficient of variation, CV)를 측정한 결과, 10 ng/㎖ 및 100 ng/㎖의 CV는 3.6% 및 5.1%로 나타나, 상기 코덱스(Codex)의 국제기준을 모두 충족하였음을 알 수 있다.

상기 표 1에서, “RT”는 체류 시간, “LOD”는 검출 한계, “LOQ”는 정량 한계를 의미한다.

< 실시예 5> 체내 투여된 마보플록사신의 약물 동태 분석

상기 실시예 2 내지 4에서 확립되고, 검증된 마보플록사신의 LC-MS/MS 분석방법을 이용하여 실험 동물(돼지, 각 투여 경로당 4마리)의 체내에 마보플로사신을 정맥 주사(IV), 근육 주사(IM) 및 경구 투여(PO)의 3가지 투여 경로를 통하여 2.5mg/kg.bw로 투여하고, 경시적으로 채혈하여 혈액시료를 LC-MS/MS로 분석하였다.

분석 대상인 혈액 시료는 상기 IV군, IM군, PO군 12 마리를 총 20회 채혈하여 얻은 총 240개의 시료를 상기 실시예 2 내지 실시예 4에서 확립된 방법으로 LC-MS/MS를 이용하여 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, IV군은 2,500 ng/㎖ 투여후 꾸준히 감소되어 60시간까지 정량 한계(LOQ)가 5 ng/㎖ 이상으로 측정 되었고, IM군은 투여후 45분에서 혈중 최고농도(Cmax)가 2,360 ng/㎖로 측정되었으며, 이후 점차 감소하여 120 시간후 정량 한계 수준까지 측정되었음을 알 수 있다.

한편, PO군은 투여후 2시간에 혈중 최고농도(Cmax)가 2,152 ng/ng로 측정되었고, 이후 감소 경향을 보이며, 120 시간까지 측정되었음을 알 수 있다.

이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.

본 발명의 LC-MS/MS를 이용한 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법은 향후 마보플록사신 제제의 개발 및 안전성, 유효성 평가에 필요한 약동학(Pharmacokinetics) 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

(a). 동물에서 채취한 혈액에 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하여 마보플록사신을 추출하고, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계; 및
(b). 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 혈액 시료 중의 마보플록사신의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 전처리 단계에서, 부피 기준으로 상기 혈액 시료 대비, 2배 내지 4배의 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴을 첨가하는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제2항에 있어서, 상기 혈액 시료 0.5㎖에 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴 1.5㎖을 첨가하는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 전처리 단계는 상기 추출한 마보플록사신을 원심분리하고, 농축하여 여과하는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴은 0.1%(v/v)의 포름산이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제4항에 있어서, 상기 원심분리는 4,000g~6,000g의 회전 속도로 20분~40분 동안 수행하고, 상기 농축은 질소 분위기 하에서 상기 혈액 시료와 상기 포름산이 함유된 아세토니트릴 부피 합의 1/3~1/5의 부피로 되도록 수행하는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피의 이동상은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴로 구성되고, 상기 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 0~90 중량% 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴 10~100 중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring)의 조건은, 전구체 이온(precursor ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 363 m/z이고, 정량 이온(quantification ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 72 m/z이며, 확인 이온(confirmation ion)에 대한 마보플록사신의 질량이 320 m/z인 것을 특징으로 하는, 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 후에, 코덱스(Codex)의 CAC/GL 71-2009의 동물 표적 조직 분석에 대한 검증 기준에 의해, 검증하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 마보플록사신의 혈중 농도 분석방법을 이용하여, 동물에서 채취한 혈액중 마보플록사신의 약동학적 지표를 측정하는 단계를 포함하는 약동학적 지표의 측정방법.