CN104428664B - 用于分析和测定在卫康醇中杂质的改良分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于卫康醇制备物分析的改良分析方法，提供用于测定卫康醇纯度并侦测卫康醇制备物中杂质的方法，以及辨识任何此等杂质。所述方法采用高效液相色谱法(HPLC)，特别是，具有折射率(RI)侦测的高效液相色谱法，所述高效液相色谱法之后可进行串联质谱法。所述方法还可包括执行存在于卫康醇制备物中的至少一特定物质波峰的制备性高效液相色谱法的收集的步骤。

Description

用于分析和测定在卫康醇中杂质的改良分析方法
相关申请案
此案主张美国临时专利申请案第61/603,464号的优先权，命名为"用于分析和测定在卫康醇中杂质的改良分析方法"，由Xiaoyun Lu提交，于2012年2月27日申請，其内容通过引用的方式并入本文整体中。
技术领域
本发明关于多个卫康醇的改良分析方法，特别是涉及高效液相色谱法(HPLC)。
背景技术
卫康醇(1,2：5,6dianhydrogalactitol或DAG)是多种己糖醇或己糖醇衍生物之一，其具有显著药理活性，包括化学治疗(chemotherapy)活性。特别是卫康醇已被建议用于化学治疗(chemotherapy)，如在美国专利第7,157,079号，Nielsen等人所著，并通过引用并入本文。
卫康醇具有抗多种肿瘤的活性。然而，如果卫康醇被成功地用作治疗剂，具有极高纯度并且去除杂质则是必需的。杂质的存在可能会导致非预期的副作用。一个发生在许多年前的例子，当时存在于一批色氨酸(tyrosine)氨基酸(其为一种蛋白质的正常组成分)的杂质引起一种嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征(eosinophilia-myalgia syndrome)的剧烈爆发，造成了大量的永久性残疾的病例及至少37人死亡。如果治疗剂(例如卫康醇)是用在免疫系统受损或肝或肾功能障碍的患者、或老年患者，这会是尤其重要。由于这类患者对污染物的敏感性，他们可能遇到更高的不良副作用发生率。
一种发现在卫康醇制备物中的杂质是半乳糖醇(dulcitol)。其他存在卫康醇制物的杂质醇取决于其制备方法。
因此，需要一种改良的分析方法以检测卫康醇制剂物中的杂质和降解产物，以提供更高的纯度，使得当卫康醇被施用于治疗目的时，有较低的机会引发副作用。
发明内容
一种用于测定卫康醇纯度并侦测在卫康醇制备物中杂质和降解产物的改良分析方法，其符合本文所述的需求。
一般而言，这种分析方法采用高效液相色谱法(HPLC)，尤指具有折射率指数(RI)侦测的HPLC。
在一取代方案中，一种用于分析在卫康醇制备物中杂质存在和量的分析方法，其特征在于：所述分析方法包括以下步骤：
(1)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用流动相梯度洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糖醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物；以及
(2)测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
所述非卫康醇本身的化合物是：(1)半乳糖醇；(2)非半乳糖醇的杂质；和(3)卫康醇的降解产物中的至少一个。
在所述方法的一取代方案中，以约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔的氢氧化钠的梯度进行洗提。优选地，以约1.5毫摩尔至约0.1毫摩尔的氢氧化钠的梯度进行洗提。更优选地，以约1毫摩尔至约0.1毫摩尔的氢氧化钠的梯度进行洗提。
在所述方法的另一取代方案中，以氢氧化铵和一挥发性铵盐的结合物的梯度进行洗提，所述挥发性胺盐选自于甲酸铵和乙酸铵和氢氧化铵所组成的一群组，并且甲酸铵和乙酸铵的总浓度为约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约1.5毫摩尔至约1.0毫摩尔。更优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约1毫摩尔至约0.1毫摩尔。通常而言，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例是从洗提开始时的约100:1变化至洗提结束时的约1:100。
通常而言，所述测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度的步骤是通过挥发性光散射侦测而执行。通常而言，所述挥发性光散射侦测与电喷雾液相色谱/质谱分析法(LC/MS)相容。通常而言，所述挥发性光散射侦测包括一挥发性溶剂的柱后添加，以提高100％水性流动相的蒸发。通常而言，所述挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈所组成的群组。
在另一取代方案中，一电喷雾串联质谱仪安装并线上连接至一具有挥发性光散射侦测的高效液相色谱系统。通常而言，收集质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。此外通常而言，收集串联质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。
所述方法还包括以下步骤：执行存在于卫康醇制备物中的至少一特定物质波峰的制备性高效液相色谱法的收集。存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一杂质。
在另一取代方案中，一种用于分析在卫康醇制备物中杂质存在和量的分析方法，其特征在于：所述分析方法包括以下步骤：
(1)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用等梯度流动相洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糖醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物；以及
(2)测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
在一取代方案中，当以等梯度洗提时，所述等梯度流动相为氢氧化钠，且氢氧化钠的浓度为约5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化钠的浓度为约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。更优选地，氢氧化钠的浓度为约1毫摩尔。
在另一取代方案中，当以等梯度洗提时，所述等梯度流动相为氢氧化铵和一挥发性铵盐的结合物，所述挥发性胺盐选自于甲酸铵和乙酸铵和氢氧化铵所组成的一群组，并且氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约2.5毫摩尔至约1.0毫摩尔。更优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约1毫摩尔。通常而言，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例是约50:50。
通常而言，在一取代方案中，所述测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度的步骤是通过挥发性光散射侦测(ELSD)而执行。通常而言，所述挥发性光散射侦测与电喷雾液相色谱/质谱分析法(LC/MS)相容。通常而言，所述挥发性光散射侦测包括一挥发性溶剂的柱后添加，以提高100％水性流动相的蒸发。通常而言，所述挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈所组成的群组。
在此取代方案中，一电喷雾串联质谱仪安装并线上连接至一具有挥发性光散射侦测的高效液相色谱系统。通常而言，收集质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。此外通常而言，收集串联质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。
根据本发明的方法的取代方案还包括以下步骤：执行存在于卫康醇制备物中的至少一特定物质波峰的制备性高效液相色谱法的收集。存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一杂质。
附图说明
参照下面的描述、所附的权利要求书和附图，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好的理解，其中：
图1是卫康醇制备物的代表性HPLC/RI的色谱图，显示半乳糖醇在相对滞留时间(RRT)～0.6时，原料药和药物产物中半乳糖醇及一未知相关物质的分辨度(resolution)。
图2显示代表性HPLC的色谱图，显示在一标准剂(standard)及水空白剂(waterblank)中卫康醇及半乳糖醇的分辨度(resolution)，以进行比较。图2中，卫康醇-半乳糖醇的标准剂显示在上方图块中，与水空白剂显示在下方图块中。
具体实施方式
本发明涉及一种用于测定卫康醇纯度和测定存在于卫康醇制备物的杂质的存在及浓度的改进分析方法。
卫康醇结构如下式(I)所示。
一种显著存在于卫康醇制备物的杂质是半乳糖醇。半乳糖醇结构如下式(II)所示。而其他杂质已知存在于卫康醇制备物中。
一种分析卫康醇制备物的改良方法，是根据具有挥发性光散射侦测器(ELSD)的HPLC(高效液相色谱法)。在一可替代方案中，为了侦测和辨识所有存在于此卫康醇制备物中的显著组成物，将高效液相色谱法(HPLC)结合质谱法(MS)。
高效液相色谱的理论和实践被描述在L.R.Snyder等人所著的“现代液相色谱法介绍(Introduction to Modern Liquid Chromatography)”(第3版，约翰·威利父子，纽约，2009年,3rd ed.，John Wiley&Sons,New York,2009)。质普法(MS)的理论和实践被描述在E.de Hoffmann&V.Stroobant所著的“质谱法：原理与应用”(第3版，John Wiley&Sons出版社，纽约，2007，3rd ed.,John Wiley&Sons,New York,2007)。
HPLC方法显示在卫康纯制备物中一合成中间体(synthetic intermediate)、半乳糖醇(dulcitol)的分辨度(resolution)，以及在相对滞留时间(RRT)为0.6时所观察到的一未知相关物质的分辨度(图1)。图1是卫康醇制备物的代表性HPLC/RI的色谱图，显示半在相对滞留时间(RRT)～0.6时，原料药和药物产物中乳糖醇及一未知相关物质的分辨度(resolution)。图2显示代表性HPLC/RI的色谱图，其显示在一标准剂(standard)及水空白剂(water blank)中卫康醇及半乳糖醇的分辨度(resolution)，以进行比较。图2中，卫康醇-半乳糖醇的标准剂显示在上方图块中，与水空白剂显示在下方图块中。
本申请描述了一种用于潜在地共洗提物质分辨率的改良HPLC色谱条件。评估一种热負荷(thermally stressed)卫康醇产品样品，以供确认所述的色谱条件适合于半乳糖醇及其他相关杂质和降解产物的分辨度。随后，执行液相色谱/质谱分析法和液相色谱/质谱分析法/质谱分析法(LC/MS和LC/MS/MS)，以描绘未知DAG相关物质在相对滞留时间约为(relative retention time,RRT)0.6时的特性，而提供此未辨识组成分的化学结构的测定和特性描述。
卫康醇及其相关物质可以通过使用50毫摩尔氢氧化钠流动相的等梯度洗提(isocratic elution)的高效液相色谱条件来进行分析。在这些条件的一改良中，采用如本文中所公开的方法的一部分，采用梯度流动相(gradient mobile phase)。一选择方案是使用在一浓度梯度下的氢氧化钠(NaOH)。如果采用再一浓度梯度下的氢氧化钠(NaOH)，则通常是以约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔的NaOH梯度进行洗提。优选地，是以约1.5毫摩尔至约0.1毫摩尔的NaOH梯度进行洗提。更优选地，是以约1毫摩尔至约0.1毫摩尔的NaOH梯度进行洗提。
在另一替代方案中，以氢氧化铵和一挥发性铵盐的结合物的梯度进行洗提，所述挥发性铵盐选自于甲酸铵和乙酸铵和氢氧化铵所组成的一群组。在此替代方案中，甲酸铵和乙酸铵的总浓度是从约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。更优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约1.5毫摩尔至约1.0毫摩尔。通常，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例是从洗提开始时的约100:1变化至洗提结束时的约1:100。
其它梯度洗提方案为公知的现有技术。
通常根据本发明的高效液相色谱分析方法，侦测是通过挥发性光散射(ELSD)的手段。一挥发性光散射侦测器(ELSD)雾化(atomize)柱洗脱液(column eluate)，将光照射在所产生的颗粒组成分(particulate components)，并侦测所产生的散射光。理论上，一ELSD可以侦测任何非挥发(nonvolatile)成分。非发色(non-chromogenic)化合物的挥发性光散射侦测是根据HPLC洗提液(eluant)的雾化(nebulization)及流动相溶剂的挥发，而产生雾化的(atomizing)溶质颗粒，以供光散射侦测。此雾化作用(nebulization)和溶剂挥发过程，用于产生雾化的(atomizing)待测物溶质颗粒(atomizing analyte soluteparticles)，且可与电喷雾液相色谱/质谱分析法(LC/MS)方法做比较。通常ELSD侦测是可与电喷雾液相色谱/质谱分析法(LC/MS)相容。
具有ELSD且与电喷雾LC/MS应用相容的HPLC实施方法，涉及一挥发性溶剂的柱后添加(post-column addition of a volatile solvent)，以提高100％水性流动相的蒸发。所述挥发性溶剂通常选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈所组成的群组。
因此，在根据本发明的方法中，一电喷雾串联质谱仪(electrospray tandem massspectrometer)安装并线上连接至一具有挥发性光散射侦测(ELSD)的高效液相色谱(HPLC)系统。可收集串联质谱数据，其提供存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。与高效液相色谱法串连的质谱分析提供各个所观察到的杂质和降解产物的分子离子信息以及具有与分子离子信息一致的分子量的可能化学结构。
在另一替代方案中，可对特定的DAG相关物质的波峰执行制备性HPLC收集，其包括杂质存在于DAG制备物中。
因此，一种用于分析在卫康醇制备物中杂质存在和量的分析方法，
包括以下步骤：
(1)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用流动相梯度洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糖醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物；以及
(2)测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
所述非卫康醇本身的化合物是：(1)半乳糖醇；(2)非半乳糖醇的杂质；和(3)卫康醇的降解产物中的至少一个。
通常在此方法的一替代方案中，流动相梯度为氢氧化钠的梯度。
在此方法的一替代方案中，流动相梯度为氢氧化铵和一挥发性铵盐的结合物的梯度，所述挥发性胺盐选自于甲酸铵和乙酸铵和氢氧化铵所组成的一群组。
在此方法中，侦测通常是通过挥发光散射。当使用挥发光散射的情况下，此方法进一步包括一挥发性溶剂的柱后添加步骤，以提高100％水性流动相的挥发。
本发明通常还包括分析通过电喷雾串联质谱法由高效液相色谱法洗提出的一或多个波峰的步骤。
在一替代方案中，本发明进一步包含至少一特定卫康醇(DAG)相关物质峰的制备性HPLC收集步骤。
如果杂质或降解产物(非半乳糖醇)存在，未知杂质或降解产物可以通过柱色谱法的分离而辨识，随后通过至少一纯化步骤，以产出一固态未知样品，所述的固态未知样品其特色在于通过至少一种标准的分析方法而辨识，其选自于由核磁共振(NMR)、质谱法(MS)、傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)、元素分析、通过高效液相色谱法测定纯度和卡尔费休滴定法测定水含量所组成的一群组。
在另一替代方案中，所述方法包括：
(a)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用等梯度流动相洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糖醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物；以及
(b)测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
在此利用梯度洗提的方法中，所述非卫康醇的化合物是(1)半乳糖醇；(2)非半乳糖醇的杂质；和(3)卫康醇的降解产物中的至少一个。
在此替代方案中，所述以等梯度流动相洗提可以为以氢氧化钠洗提或以氢氧化铵和一挥发性铵盐的结合物的梯度进行洗提，所述挥发性胺盐选自于甲酸铵和乙酸铵和氢氧化铵所组成的一群组。如果所述等梯度流动相为氢氧化钠，通常氢氧化钠的浓度为约5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化钠的浓度为从约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。更优选地，氢氧化钠的浓度为约1毫摩尔。如果所述等梯度流动相为氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约5毫摩尔至约0.1毫摩尔。优选地，氢氧化铵和所述挥发性胺盐的总浓度为约2.5毫摩尔至约0.1毫摩尔。更优选地，氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为约1.0毫摩尔。通常氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例为约50:50。
本发明通过以下的例子来说明。本实施例的目的是用于说明，而并非旨在限制本发明。
示例：
使用等梯度氢氧化钠洗提的卫康醇制备物的HPLC分析：
在本实施例中描述的步骤，通过具有折射率侦测(refractive index detection)的离子交换高效液相色谱法，以测定卫康醇的药物制备物中的半乳糖醇及相关杂质。
在此过程中，将样品与卫康醇以5mg/mL的目标浓度制备。使用一种阴离子交换柱(anion exchange column)(Hamilton RCX-10,250×4.1mm,7μm)，以50毫摩尔NaOH作为有折射率侦测(refractive index detection)的等梯度流动相，分离半乳糖醇、卫康醇、以及相关的杂质。以一外部参考标准(an external reference standard)测定半乳糖醇浓度，并且使用卫康醇(DAG)参考标准估算相关物质含量。
合适的高效液相色谱系统和数据采集系统是安捷伦1200系列液相色谱系统或等效系统(Agilent Technologies 1200Series HPLC system or equivalent)，其配备有以下几点：Quat pump、Model G1311A或等效设备、自动采样机(auto sampler),Model 1329Aor equivalent、RID侦测器、Model1362A或等效设备、30±3℃柱温控制器(columntemperature controller capable of 30±3℃)及脱气机(degasser)、Model G1322或等效设备。该管柱是汉密尔顿的RCX阴离子交换柱(Hamilton RCX anion exchange column250×4.1mm,7μm,P/N)或等效系统。数据采集是通过ChemStation、ChemStore Client/Server或等效的数据系统进行。
使用以下的化学药品。水是Milli-Q水或去离子水。氢氧化钠为标准的净化等级。半乳糖醇的参考标准为99.95％的纯度。DAG的参考标准为98.72％的纯度。
将2.0克的氢氧化钠溶解在1升水中做为流动相(50毫摩尔的NaOH)。将溶液通过0.45微米的过滤器过滤。流动相可以在室温下存储长达1个月。至于半乳糖醇参考原液(reference stock solution)(标称500微克/毫升)，准确地量秤25毫克半乳糖醇参考标准而置入50毫升的容量瓶中。以去离子水将半乳糖醇稀释至一定体积并充分混合。所制备的原液(stock solution)在2-8℃下，最多可以储存3天。至于DAG参考原液(标称500微克/毫升)，准确地量秤25毫克DAG参考标准而置入50毫升的容量瓶中。以去离子水将DAG稀释至一定体积并充分混合。所制备的原液(stock solution)在2-8℃下，最多可以储存3天。至于半乳糖醇-DAG标准溶液(50微克/毫升的半乳糖醇+50微克/毫升的DAG，分别为1％的5毫克/毫升的DAG)，1.0毫升半乳糖醇原液和1.0毫升DAG原液各自定量地转移到10毫升的容量瓶中，以一定体积的水稀释，并充分混合。
至于来自于API样品(标称1毫克/毫升)的DAG样品制备物，准确地量秤25毫克DAG的API样品而置入一25毫升的干净容量瓶中。将所述DAG API样品溶解于约5毫升的去离子水，稀释至一定体积并充分混合。将测试样品的1至2毫升等份试样(aliquot)转移到HPLC小瓶中。所制备的样品在2-8℃下，最多可以储存2天。
至于用于API样品的DAG样品制备物(标称5毫克/毫升)，准确地量秤50毫克的API样品而置入一10毫升的干净容量瓶中。将所述DAG API样品溶解于约5毫升的去离子水，稀释至一定体积并混合。
至于来自于冷冻干燥(lyophilized)的样品(标称40毫克/小瓶vial)的DAG样品制备物，所述样品从储存样品的冰箱内移出，并移除密封。定量地转移5.0毫升的水，将容液混合以溶解DAG，以产出8毫克/毫升的容液。
以离子交换水，将重配溶液的1.0克等分试样稀释到8.0克并混合。将试验样品的1-2毫升等分试样(aliquot)转移到HPLC小瓶中。制备的样品可以在2-8℃最高可存放2天。
至于使用冷冻干燥粉末(40毫克/小瓶)用于药物产品的DAG样品制备物(标称5毫克/毫升)，清洗并除去所述小瓶的密封。以8.0毫升的水重构(reconstitute)冷冻干燥的小瓶，得到5毫克/毫升的溶液。将试验样品的1-2毫升等分试样(aliquot)转移到HPLC小瓶中。将样品(使用两小瓶)制备为一式两份(duplicate)。制备的样品可以在2-8°下最多储存24小时。
至于HPLC分析，打开HPLC系统，并且允许测器预热至少20分钟。如果必要，可将如上所述的制备的HPLC流动相放置于适当的溶剂入口中。将流动相灌注于溶剂管线中。系统和管柱平衡在1.5毫升/分钟的流动速率，至少30分钟。建立样本分析程序。一旦系统适用性已确定，注射水空白剂(water blank)，随后注射标准剂(standard)，然后是样品。在每注射10个样品后，插入半乳糖醇-DAG标准剂，然后在运行结束时插入最后一个包围标准剂。适合的样品分析序列显示于表1中。
表1:
样品分析序列
使用RID分析样品。如上所指，合适的管柱是一Hamilton RCX离子交换柱(anionexchange column)(250×4.1mm,7μm)、P/N79440或等效装置。所述流动相为溶于去离子水的50mM NaOH(等梯度洗提)。流速为1.5毫升/分钟。管柱温度是30℃。注射体积为50.0微升。以RID在35℃下进行侦测。运行时间为8分钟。
至于色谱图的分析和积分，是使用高效液相色谱软件。检视和比较空白剂、样品和测试标准剂的色谱图。手动积分及分配某些波峰可能是必要的。调整积分参数，例如斜率灵敏度、峰宽、用于替除的峰高阀、肩峰的积分型、基线和分裂峰，以及其他的参数，以获得适当的积分，记录这些参数的值，并且应用于所有样品和标准剂。
系统适用性评估如下。使用表2中的色谱性能要求以评估半乳糖醇-卫康醇标准溶液的六个重复注射。
表2:
色谱性能要求：
半乳糖醇的滞留时间(RT): ～2min.
卫康醇的滞留时间(RT): ～6min.
面积反应变化％RSD: ≤10.0％
滞留时间变化％RSD: ≤2.0％
在包围(bracketing)标准溶液注射的半乳糖醇及DAG波峰面积应为各个先前SST注射的平均波峰面积的80％至120％。如果包围标准容液不符合所述准则，在最后一个经过包围标准容液后的分析样品应当重新进行分析。
在数据的分析中，相对的波峰面积＝(峰面积/总峰面积)×100，其中，“波峰面积”是各个波峰面积，“总波峰面积”是所有波峰的波峰面积的总和。
依指示计算半乳糖醇浓度：半乳糖醇(Cu，微克/毫升)＝Cs×样品波峰面积平均值/半乳糖醇-卫康醇(Dul-DAG)标准注射的半乳糖醇波峰面积平均值，其中Cs为半乳糖醇浓度(微克/毫升)。
依指示计算卫康醇(DAG)的药物物质或药物产物中半乳糖醇含量(重量百分比，wt％)：
半乳糖醇重量百分比＝Cu(微克/毫升)/1000/SC(毫克/毫升)×100％，其中Cu是半乳糖醇浓度(微克/毫升)，其计算如上所述，而SC是样品浓度(毫克/毫升)，其被制备为药物物质或药物产物。如果半乳糖醇存在时，若半乳糖醇重量百分比等于或大于0.05％时，回报半乳糖醇重量百分比，其被回报至幾近0.01％。
如果一个非半乳糖醇的未知或之前尚未辨识的杂质存在于卫康醇(DAG)制备物，其浓度的计算方法如下：未知杂质浓度(微克/毫升)＝Cs×样品波峰面积平均值/半乳糖醇-卫康醇(Dul-DAG)标准注射的卫康醇(DAG)波峰面积平均值。如果存在未知杂质，其重量百分比的计算方法如下：Cu(微克/毫升)/1000/SC(毫克/毫升)×100％，其中Cu＝未知浓度(微克/毫升))，其计算如上所述，如上述计算出的，与SC＝样品浓度(微克/毫升)，在8.2.2中制备做为药物物质或在8.2.3中做为药物产物。如果存在未知杂质，若等于或大于0.05％时，回报各个未知杂质，其被回报至幾近0.01％。
以各样品及样品重复品(duplicate)的平均值计算所述分析结果的重量百分比。
本发明的优点：
本发明提供一种改良的分析方法用于侦测和定量存在于卫康醇制备物的杂质，包括半乳糖醇的和未知杂质定，以及分离和辨识存在于卫康醇制备物的未知杂质的方法。本发明的方法允许大规模制备高纯度卫康醇，以适于药物用途，并减少存在于卫康醇制备物中的杂质所引起的显著副作用的可能性，以用于药物用途。根据本发明的方法具有工业适用性，用于分析卫康醇制备物，及分析测定和定量在卫康醇制剂的杂质。
当考虑价值范围时，本发明包含每个范围上限与下限之间的介入价值，至少为下限单位的十分之一，除非内容中明确指出。另外，本发明包含任何其他状态的介入价值与范围，包括范围的上限与下限两者，除非从该状态的范围特别排除。
除非有其他定义，本文中所有技术与科学术语的意义，为在本发明所属领域具通常知识者所普遍了解。在此领域具通常知识者也会判断本文中所述的任何类似或相等方法及材料，以用于实行或测试本发明。
在此所讨论的文献与专利，主要在提供其在本案申请日期前的揭露内容。不能以先前发明的优点，为解释本发明不能拥有优先权的原因。所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，需要进一步个别确认。
所有的参考文献均加注在本文中，用于全面的参考，包括所有公开的专利、专利申请案、参考文献，也包含这些文件中加注的文献。然而，任何本文中用于参考所加注的文献的范围，是用作公开信息，申请人不准许任何此公开信息在此申请日期后被用作先前技术。
在此说明中及附加权利要求所使用的单数形式包括复数形式。举例来说该术语「一」，「一个」以及「该」包括关联复数，除非有其他内容清楚指出。另外，该术语「至少」在一系列元素之前，应被解释为提及在此系列中的每个元素。
本发明在此举例式的叙述，可在缺少任何本文中非特定揭露的元素，限制下合适地实行。因此，举例来说，该术语「包含」、「包括」、「含有」等，应被广义地与不带限制地解读。另外，本文中使用的术语及表达方式，是用于描述而非限制，此术语及表达方式的使用目的不在于排除其他未来显示及描述的相等物质，或其他相关部分，应认知在此发明所请求的范围中，不同的改变是有可能的。因此，应了解虽然本发明已在最佳实施例及选择性特征揭露，本发明在此揭露的改变及变异，可借助在此领域具通常知识者，且此改变及变异考虑本发明在此所揭露的范围。本发明已在此作广义地及一般性的解释。每个落入属名揭露范围的窄义的物种及亚属族群，也形成发明的一部分。这些包括每个发明所描述的属名，该属名以但书或否定限制排除任何属名中的内容，不论所排除的内容是否特定存在于本文中。另外，发明中的特色及方向，以马库西形式(Markush group)的术语叙述，在此领域受教育者，会判断本发明也以马库西形式中任何单独成员或子群体成员的术语来叙述。也应了解以上叙述的目的在于举例而非限制。回顾以上叙述时，许多实施例对在此领域具通常知识者来说是显而易见的。因此本发明的范围不应该参考以上叙述决定，而是参考附加的权利请求，以及此权利请求所给予同等物质的全部范围而决定。在此领域具通常知识者，会判断或可确定本发明中特定实施例所叙述的许多同等物质，而不需例行实验以外的试验。这些同等物质被包含于以下权利要求中。

Claims (36)

1.一种用于分析在卫康醇制备物中杂质存在和量的分析方法，其特征在于：所述分析方法包括以下步骤：
(a)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用流动相梯度洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糠醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物，其中所述流动相梯度选自于由以下组成的组：
(i)选自于由2.5毫摩尔氢氧化钠开始至0.1毫摩尔氢氧化钠结束的梯度，由1.5毫摩尔氢氧化钠开始至0.1毫摩尔氢氧化钠结束的梯度和由1毫摩尔氢氧化钠开始至0.1亳摩尔氢氧化钠结束的梯度组成的组的氢氧化钠的梯度；或
(ii)氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的一挥发性铵盐的组合的梯度，其中氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性铵盐的总浓度为选自于由以下组成的组的梯度：由2.5毫摩尔开始至0.1毫摩尔结束的氢氧化铵以及选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的挥发性铵盐的梯度，由1.5毫摩尔开始至0.1毫摩尔结束的氢氧化铵以及选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的挥发性铵盐的梯度，和由1毫摩尔开始至0.1毫尔结束的氢氧化铵以及选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的挥发性铵盐的梯度；以及
(b)通过挥发性光散射侦测测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述非卫康醇本身的化合物是：(1)半乳糖醇；(2)非半乳糖醇的杂质；和(3)卫康醇的降解产物中的至少一个。
3.如权利要求1所述的分析方法，其中利用阴离子交换柱，使卫康醇与所述制备物的半乳糠醇及其他杂质分离，所述阴离子交换柱是Hamilton RCX-10柱，250×4.lmm，7μm。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于；氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例是从洗提开始时的100:1变化至洗提结束时的1:100。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度的步骤是通过挥发性光散射侦测而执行。
6.如权利要求5所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性光散射侦测与电喷雾液相色谱/质谱分析法相容。
7.如权利要求5所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性光散射侦测包括一挥发性溶剂的柱后添加，以提高100％水性流动相的蒸发。
8.如权利要求7所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈所组成的群组。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱采用安装并线上连接至一具有挥发性光散射侦测的高效液相色谱系统的电喷雾串联质谱仪。
10.如权利要求9所述的分析方法，其特征在于：收集串联质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。
11.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于：与高液相色谱法串联的质谱分析提供各个所观察到的杂质和降解产物的分子离子信息以及具有与分子离子信息一致的分子量的可能化学结构。
12.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于：至少一种杂质或降解产物通过柱色谱法的分离而鉴定，随后通过至少一纯化步骤，以产出一固态未知样品。
13.如权利要求12所述的分析方法，其特征在于：所述的固态未知样品通过至少一种标准的分析方法而辨识，其选自于由核磁共振(NMR)、质谱法(MS)、傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)、元素分析、通过高效液相色谱法测定纯度和卡尔费休滴定法测定水含量所组成的一群组。
14.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：还包括以下步骤：执行存在于卫康醇制备物中的至少一特定物质波峰的制备性高效液相色谱法的收集。
15.如权利要求14所述的分析方法，其特征在于：存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一杂质。
16.如权利要求14所述的分析方法，其特征在于：存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一降解产物。
17.一种用于分析在卫康醇制备物中杂质存在和量的分析方法，其特征在于：所述分析方法包括以下步骤：
(a)通过运用高效液相色谱法于卫康醇的一制备物，利用等梯度流动相洗提，使卫康醇与所述制备物的半乳糖醇及其他杂质分离，从而分析卫康醇的所述制备物，其中所述等梯度流动相选自由以下构成的组：
(i)氢氧化钠，其中氢氧化钠在所述等梯度流动相中的浓度恒定且为5毫摩尔至0.1毫摩尔；或
(ii)氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的一挥发性铵盐的组合，其中氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性铵盐的总浓度为在所述等梯度流动相中5毫摩尔至0.1毫摩尔，并且总浓度恒定；以及
(b)通过挥发性光散射侦测测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度。
18.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于：所述非卫康醇本身的化合物是：(1)半乳糖醇；(2)非半乳糖醇的杂质；和(3)卫康醇的降解产物中的至少一个。
19.如权利要求17所述的分析方法，其中利用阴离子交换柱，使卫康醇与所述制备物的半乳糠醇及其他杂质分离，所述阴离子交换柱是Hamilton RCX-10柱，250×4.lmm，7μm。
20.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于：所述等梯度流动相中氢氧化钠的浓度为选自于2.5毫摩尔至0.1毫摩尔的浓度的氢氧化钠的浓度。
21.如权利要求20所述的分析方法，其特征在于：所述等梯度流动相中氢氧化钠的浓度为1毫摩尔。
22.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于：所述等梯度流动相中氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的一挥发性铵盐的总浓度为2.5毫摩尔至0.1毫摩尔。
23.如权利要求22所述的分析方法，其特征在于：所述等梯度流动相中氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的总浓度为1毫摩尔。
24.如权利要求22所述的分析方法，其特征在于：氢氧化铵和选自于甲酸铵和乙酸铵所组成的一群组的所述挥发性胺盐的比例为50:50。
25.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于：所述测定由高效液相色谱法解析而得的且代表非卫康醇本身的化合物的一或多个波峰的相对浓度的步骤是通过挥发性光散射侦测而执行。
26.如权利要求25所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性光散射侦测与电喷雾液相色谱/质谱分析法相容。
27.如权利要求26所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性光散射侦测包括一挥发性溶剂的柱后添加，以提高100％水性流动相的蒸发。
28.如权利要求27所述的分析方法，其特征在于：所述挥发性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈所组成的群组。
29.如权利要求24所述的分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱法采用安装并线上连接至一具有挥发性光散射侦测的高效液相色谱系统的电喷雾串联质谱仪。
30.如权利要求29所述的分析方法，其特征在于：收集串联质谱数据，其提供可能存在于卫康醇的制备物中的各个杂质和降解产物的化学物质信息。
31.如权利要求30所述的分析方法，其特征在于：与高效液相色谱法串联的质谱分析提供各个所观察的杂质和降解产物的分子离子信息以及具有与分子离子信息一致的分子量的可能化学结构。
32.如权利要求30所述的分析方法，其特征在于：至少一种杂质或降解产物通过柱色谱法的分离而鉴定，随后通过至少一纯化步骤，以产出一固态未知样品。
33.如权利要求32所述的分析方法，其特征在于：所述的固态未知样品通过至少一种标准的分析方法而辨识，其选自于由核磁共振(NMR)、质谱法(MS)、傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)、元素分析、通过高效液相色谱法测定纯度和卡尔费休滴定法测定水含量所组成的一群组。
34.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于：还包括以下步骤：执行存在于卫康醇制备物中的至少一特定物质波峰的制备性高效液相色谱法的收集。
35.如权利要求34所述的分析方法，其特征在于：存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一杂质。
36.如权利要求34所述的分析方法，其特征在于：存在于卫康醇制备物中的至少一物质波峰为一降解产物。
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