CN107179361B - 用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤：(1)检测缴获美沙酮样品中美沙酮的纯度，选择美沙酮质量分数大于或等于50wt％的缴获美沙酮样品作为纯化制备美沙酮标准物质的原料；(2)利用高效液相色谱制备美沙酮标准物质。本发明制备纯化方法得到的美沙酮经核磁共振、液相色谱‑串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

Description

用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法

技术领域

本发明涉及法庭科学毒品标准品的制备。更具体地，涉及一种用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法。

背景技术

目前，日趋严重的毒品问题已成为全球性的灾难。毒品的泛滥直接危害人民的身心健康，并给经济发展和社会进步带来巨大威胁。因此，建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，提高毒品成份量测量技术，保证测量结果的可靠性和可比性，建立测量数据的共享与互认，为法庭提供准确可靠的证据，已成为世界各国毒品鉴定机构普遍关注的问题。

毒品成份量测量技术及溯源性保障是一个有机的整体，是核心测量能力在法庭科学毒品成份量测量领域的重要体现。标准物质是贯穿于这个整体的骨架，是量值的载体，是毒品成份量溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上的准确性和可比性的重要基础，是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。

欧美等国家技术先进的毒品检测实验室大多采用Sigma等公司生产的国际上公认的标准物质，但在我国只能依赖进口的标准物质，量少价高，有许多还不能向中国提供。目前国内毒品分析中使用的“对照品”不仅种类极为有限，而且普遍缺乏完善的结构鉴定、纯度测定、均匀性和稳定性等相应的技术指标。这些都给涉毒案件检测带来一定的不确定性，直接影响到定量结果的准确性。而且，国内毒品标准物质的匮乏，已经成为制约我国实现法庭科学毒品检测化学测量方法标准化、测量结果的溯源和互认的主要障碍。因此，能够制备出用于法庭科学毒品检测的毒品标准物质已经成为我国毒品研究领域亟需解决的问题。

美沙酮的理化性质，又称：阿米酮，非那酮，美散痛；英文通用名称：Methandonehydrochloride；化学名称：4,4-二苯基-6-(二甲氨基)-3-庚酮盐酸盐；英文名称：

4,4-diphenyl-6-dimethylamino-3-heptanone-hydrochloride；分子式：C21H27NO·HCl，分子量：345.91，CA登记号：1095-90-5；结构式为：

理化性质：为无色或白色结晶性粉末，无臭，味苦。熔点230～234℃。溶于水、乙醇和氯仿，几乎不溶于乙醚。溶解度(g/100mL)：水12，乙醇8，异丙醇2.4；几乎不溶于醚、甘油。储存于2-8℃。溶液pH值为4.5-6.5。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤：

(1)检测缴获美沙酮样品中美沙酮的纯度，选择美沙酮质量分数大于或等于50wt％的缴获美沙酮样品作为纯化制备美沙酮标准物质的原料；

(2)利用高效液相色谱制备美沙酮标准物质。

上述用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法，在步骤(1)中，包括如下步骤：

(1.1)样品溶液的制备：美沙酮水溶液，使用前样品溶液经过0.22μm混合膜过滤；

(1.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱，250mm×4.6mm I.D.，5μm；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝40:60；所用磷酸盐缓冲溶液配制方法如下：称取磷酸二氢钾3.4克，加水稀释至1000mL，调节pH为2.5；等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速1.0mL/min；柱温35℃；

(1.3)计算标准曲线的回归方程及确定线性范围：用色谱甲醇稀释美沙酮标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的美沙酮对照品溶液，按反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录美沙酮色谱峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程；以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝3×10⁷X-130176，R²＝0.9992

表明美沙酮在0.1--1000μg/mL的范围内线性关系良好；

(1.4)按的反相色谱方法分析测定美沙酮样品溶液，重复测定3次，记录美沙酮峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的美沙酮含量。

上述用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法，在步骤(2)中，包括如下步骤：

(2.1)样品溶液的制备：318.66mg美沙酮样品溶于水，离心浓缩至出现白色沉淀，逐渐加水至溶解，配成饱和的美沙酮样品溶液用于制备型高效液相色谱分离制备美沙酮标准品；样品溶液经过0.45μm或0.22μm混合膜过滤；

(2.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱，250mm×20mmI.D.，15μm；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝35:65；所用磷酸盐缓冲溶液配制方法如下：称取磷酸二氢钾3.4克，加水稀释至1000mL，调节pH为2.5；等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速8mL/min；上样量300μL；柱温为室温；

(2.3)制备液相所获得的馏分中，美沙酮并不是以盐酸盐的形式存在的，需要经过旋转蒸发后，去除馏分中的乙腈及部分水；调节水溶液的pH为8-9，加入5倍于水溶液体积的乙醚萃取，分离出有机相，旋转蒸干后，加入0.1mol/L的盐酸溶液至白色物全部溶解，冷冻干燥后即可获得美沙酮盐酸盐晶体。

本发明的有益效果如下：

本发明制备纯化方法得到的美沙酮晶体中，按照高效液相色谱峰面积归一化法计算美沙酮纯度大于或等于99.1％。

本发明制备纯化方法得到的美沙酮经核磁共振、液相色谱-串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

本发明的制备纯化方法可为我国司法鉴定部门提供量值准确、可溯源的美沙酮标准物质，填补我国法庭科学领域毒品标准物质空白，以改进分析测量质量，提高定量结果的准确度，最大程度地保证测量结果的有效性。有助于建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，有利于实现国内法庭科学毒品检测化学测量方法标准化，实现测量结果的可靠、有效和互认。

克服了现有技术制备纯化方法得到的美沙酮样品存在的纯度低、稳定性差、均匀性差、制备过程复杂等缺陷，提供了一种利用高效液相色谱分离法获得高纯度、高稳定性、回收率高、便于规模化生产的美沙酮标准物质制备方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1盐酸美沙酮的HPLC-DAD紫外吸收光谱图；

图2美沙酮水液反相HPLC色谱图；图3美沙酮样品制备HPLC色谱图；

图4美沙酮的反相HPLC色谱图；图5盐酸美沙酮的质谱图；

图6美沙酮的气相色谱质谱图；图7盐酸美沙酮的红外谱图；

图8美沙酮的氢谱图；图9美沙酮的碳谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本实施例主要是利用缴获的美沙酮样本，对利用制备液相色谱法分离纯化制备美沙酮的实验条件进行了优化筛选。

一、仪器、试剂及材料

1.1主要仪器

分析型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-20AD高压输液泵；SIL-10A自动进样器；SPD-20A二极管阵列检测器；CTO-20A柱温箱。

制备型高效液相色谱仪(Agilent)，包括：G1361A高压输液泵；G2260A自动进样器；G1315D二极管阵列检测器；G1364B自动馏分收集器。

BUCHI旋转蒸发器(日本BUCHI公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；飞鸽牌TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XS105Dual Range电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；

1.2主要试剂及材料

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，磷酸二氢钾、三氟乙酸(色谱纯，中国百灵威公司)，超纯水(经Millipore超纯水制备系统净化，法国Millipore公司)。

美沙酮1mg/mL标准溶液(中国百灵威公司)。美沙酮样品(粉红色水液)由案件缴获并应用于本研究中。

二、缴获美沙酮样品中美沙酮的纯度测定及美沙酮标准物质的纯化制备

2.1样品溶液的制备

分析型：美沙酮水液，使用前样品溶液经过0.22μm混合膜过滤。

制备型：称取318.66mg美沙酮配制成美沙酮水溶液，离心浓缩至出现白色沉淀，逐渐加水至溶解，配成饱和的美沙酮样品溶液用于制备型高效液相色谱分离制备美沙酮标准品。样品溶液经过0.45μm或0.22μm混合膜过滤。

2.2液相色谱条件

2.2.1反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法:

色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝40:60，称取磷酸二氢钾3.4克、加水稀释至1000mL、调节pH为2.5即得磷酸缓冲溶液，等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。

2.2.2反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备方法:

色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱(250mm×20mm I.D.，15μm)；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝35:65，等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速8mL/min；上样量300μL；柱温为室温。

2.3高效液相色谱分析条件的优化

2.3.1色谱柱的选择

采用Shim-pack VP-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)色谱柱对美沙酮样品进行分析。

2.3.2检测波长的选择

美沙酮样品中的主要组分有美沙酮及一个未知杂质成分。经过HPLC-DAD分析，在190-500nm范围内，该杂质成分均有较强紫外吸收，综合考虑美沙酮HPLC-DAD分析结果，所以选择检测波长为206nm，如图1所示。

2.3.3流动相体系的选择

关于反相色谱流动相体系的选择，分别考察了甲醇-水、甲醇-三氟乙酸(TFA)/水、乙腈-水、乙腈-磷酸缓冲液体系对美沙酮及其杂质的分离效果。试验结果表明，在改变有机相配比的情况下，甲醇-水、甲醇-三氟乙酸(TFA)/水、乙腈-水均不适用于美沙酮的液相色谱分析，而乙腈-磷酸缓冲液能达到较好的分离效果。最终，V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝40:60的流动相体系被用来分析美沙酮样品中的各组分，色谱图如图2所示。

2.3.4标准曲线和线性关系

用色谱甲醇稀释美沙酮标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的美沙酮对照品溶液，按反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录美沙酮色谱峰面积，以对照品的进样浓度(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程。

表1美沙酮的浓度与峰面积

以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝3×10⁷X-130176，R²＝0.9992

表明美沙酮在0.1--1000μg/mL的范围内线性关系良好。

2.3.5样品中美沙酮含量的测定

按反相色谱方法分析测定美沙酮样品溶液，重复测定3次，记录美沙酮峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的美沙酮含量。

表2样品中美沙酮含量的测定结果

由表2可知，通过峰面积外标法由标准曲线方程计算得到样品溶液中美沙酮的含量为0.59mg/mL，样品中美沙酮含量大于50wt％。

2.4高效液相色谱制备条件的优化

最初，考虑到标物制备要尽量避免使用磷酸盐及价格昂贵的乙腈，为有利于保护色谱柱的使用寿命，节约试验经费，首先采用甲醇-水体系对美沙酮的分离效果进行了考察，试验证明，甲醇-水体系条件下，美沙酮不能与其中的主要杂质分开。因此，又选用分析型高效液相色谱方法中采用的乙腈-磷酸盐缓冲液体系，通过改变乙腈的比例，最终美沙酮与其水液中的杂质成分得到了很好的分离，经过高效液相色谱峰面积归一化法计算美沙酮纯度为99.56wt％，如图3。

2.5美沙酮组分的进一步纯化

制备液相所获得的馏分中，美沙酮并不是以盐酸盐的形式存在的，需要经过旋转蒸发后，去除馏分中的乙腈及部分水。美沙酮化合物本身为叔胺结构，碱性较弱，适宜在弱碱条件下萃取，通过调节水溶液的pH至8-9，加入5倍于水溶液体积的乙醚萃取，合并有机相，旋转蒸干后，加入0.1mol/L的盐酸溶液至白色物全部溶解，冷冻干燥后即可获得美沙酮盐酸盐晶体。其HPLC色谱图如图所示。经HPLC分析，峰面积归一化法测定百分含量，美沙酮含量99.68wt％，如图4所示。

2.6美沙酮标准物质的结构确证

2.6.1液相色谱-串联质谱联用法

在Agilent LC-MS/MS 6410仪上测定了盐酸美沙酮的质谱。在ESI正离子模式下，破碎电压135V，碰撞能10eV，样品的质谱图如图5所示。

从质谱图中可以得到下列信息：

(1)准分子离子峰[M+H]+的m/z310.30，与美沙酮的相对分子质量309.3g/mol相差1，因而检测样品的分子量与美沙酮的相符。

(2)准分子离子峰[M+H]+的m/z310.30与相邻峰m/z265.20相差45，丢失的碎片可能是C2H6NH。

(3)碎片离子峰m/z57.1，碎片离子可能是CH3CH2CO。

2.6.2气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱法得到的谱图(如图6)与盐酸美沙酮的标准谱图是一致的。

2.6.3红外光谱法

在AVATAR 330FT-IR红外光谱仪(Thermo Nicolet公司)上测定了美沙酮的红外光谱，如图7所示，结果与标准谱图完全一致。

2.6.4核磁法

利用600M核磁对盐酸美沙酮进行了结构确证。结果如图8、图9所示。

溶剂：CDCl₃

位置	化学位移<sup>13</sup>C	化学位移<sup>1</sup>H	氢谱裂分
				1	64.455
2	210.549
				3	32.513	2.43；2.18	m；m
4	8.820	0.85	t
				5	37.915	3.03；2.23	d；d
6	59.044	3.07	m
				7	16.415	0.73	d
8	36.772	2.67	d
				9	40.332	2.78	d
10\16	139.202
				11\15\17\21	128.707	7.39	m
12\14\18\20	128.485	7.22；7.40	m
				13\19	127.669	7.37	m

由氢谱和碳谱可确证美沙酮的化学结构及其氢谱中共振峰氢的归属。

2.7美沙酮标准物质的定值结果

经HPLC以及GC方法定值分析，盐酸美沙酮标准物质纯度为99.72wt％，扩展不确定度为0.10％(k＝2)。均匀性良好，稳定性至少1年以上。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (1)

1.用于法庭科学毒品检测的美沙酮标准物质的纯化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)检测缴获美沙酮样品中美沙酮的纯度，选择美沙酮质量分数大于或等于50wt％的缴获美沙酮样品作为纯化制备美沙酮标准物质的原料；

(2)利用高效液相色谱制备美沙酮标准物质；

在步骤(1)中，包括如下步骤：

(1.1)样品溶液的制备：美沙酮水溶液，使用前样品溶液经过0.22μm混合膜过滤；

(1.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱，250mm×4.6mm I.D.，5μm；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝40:60；所用磷酸盐缓冲溶液配制方法如下：称取磷酸二氢钾3.4克，加水稀释至1000mL，调节pH为2.5；等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速1.0mL/min；柱温35℃；

(1.3)计算标准曲线的回归方程及确定线性范围：用色谱甲醇稀释美沙酮标准储备液，精密配制成浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500、1000μg/mL的美沙酮对照品溶液，按反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录美沙酮色谱峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程；以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝3×10⁷X-130176，R²＝0.9992

表明美沙酮在0.1--1000μg/mL的范围内线性关系良好；

(1.4)按的反相色谱方法分析测定美沙酮样品溶液，重复测定3次，记录美沙酮峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的美沙酮含量；

在步骤(2)中，包括如下步骤：

(2.1)样品溶液的制备：318.66mg美沙酮样品溶于水，离心浓缩至出现白色沉淀，逐渐加水至溶解，配成饱和的美沙酮样品溶液用于制备型高效液相色谱分离制备美沙酮标准品；样品溶液经过0.45μm或0.22μm混合膜过滤；

(2.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱，250mm×20mm I.D.，15μm；流动相为V_乙腈：V_{磷酸盐缓冲液}＝35:65；所用磷酸盐缓冲溶液配制方法如下：称取磷酸二氢钾3.4克，加水稀释至1000mL，调节pH为2.5；等度洗脱；紫外检测波长206nm；流速8mL/min；上样量300μL；柱温为室温；

(2.3)制备液相所获得的馏分中，美沙酮并不是以盐酸盐的形式存在的，需要经过旋转蒸发后，去除馏分中的乙腈及部分水；调节水溶液的pH为8-9，加入5倍于水溶液体积的乙醚萃取，分离出有机相，旋转蒸干后，加入0.1mol/L的盐酸溶液至白色物全部溶解，冷冻干燥后即可获得美沙酮盐酸盐晶体。