CN104122339A - D、13c或15n标记有机化合物的同位素丰度检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，采用高效液相色谱-质谱联用仪获取目标化合物的质谱数据，通过“质量簇”的分类计算法分析质谱数据，实现对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测。检测对象是是D、¹³C或¹⁵N标记的有机化合物。检测用仪器是高效液相色谱-质谱联用仪，液相色谱部分作为自动进样设备，实现对目标化合物的高通量进样；电喷雾质谱作为检测器，获取质谱数据。计算方法采用“质量簇”的分类方法，通过分析各个“质量簇”质量分布对目标化合物质量分布(目标化合物质谱数据)的贡献，计算各个“质量簇”的摩尔分数，进而计算得到目标化合物的同位素标记丰度。

Description

D、13C或15N标记有机化合物的同位素丰度检测方法

技术领域

本发明涉及同位素丰度检测方法，尤其是涉及一种针对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法。

背景技术

D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物是一类重要的试剂，由于其具备特有的示踪特性，广泛应用于生物、医学、农业和环境领域。在生物学领域，随着人类后基因组时代的到来，蛋白质组学研究成为生物学研究的热点。在阐明特定蛋白质的生物学功用、蛋白-蛋白相互作用关系和定量蛋白质组学方面，稳定同位素标记氨基酸的示踪作用成为重要的科研手段。目前，生物学上广泛引用的同位素编码亲和标记方法(ICATTM)、细胞培养中氨基酸稳定同位素标记技术(SILAC)等都需要用到D、¹³C或¹⁵N标记的氨基酸。在医学领域，¹³C标记有机化合物已广泛的应用于多种疾病的诊断。比如尿素-¹³C呼气试验(¹³C-UBT)应用于对幽门螺旋杆菌的诊断，辛酸-¹³C呼气试验(¹³C-OBT)用于诊断胃排空异常，美沙西汀-¹³C呼气试验(¹³C-MBT)用于针对肝功能状况的诊断。在农业和环境领域，¹⁵N标记尿素在作物营养代谢、环境N元素循环等方面具有深入的应用。

作为示踪试剂，同位素标记丰度是D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的关键性指标，因此其准确、灵敏和高通量的检测至关重要。传统的同位素标记丰度分析方法是气体同位素质谱法，该方法需要将样品中的C和N元素转化为CO₂和N₂的气态形式，再引入气体同位素质谱仪进行检测。这种方法的优点在于检测数据准确，检测绝对同位素丰度值可以精确到0.01％，非常适合¹³C或¹⁵N标记无机和少量有机化合物的同位素标记丰度检测；另外，该方法可以对¹³C和¹⁵N双标记化合物的¹³C和¹⁵N同位素丰度进行分别的检测。但是气体同位素质谱法也存在着如下的不足：

1.检测样品种类有限。对于D标记化合物和很多¹³C或¹⁵N标记有机化合物，因为无法有效转化为相应的气体而无法检测；对于部分标记(官能团标记)的化合物的检测结果误差较大而不适合。

2.由于转化反应是将样品中各种物质的某一元素都转化为气体形态而进行检测，因此检测结果是样品中该元素整体平均的同位素丰度，而不是目标化合物的同位素丰度。当样品纯度不高时，同位素丰度结果就不准确。

3.转化过程操作繁琐、时耗较长、成本较高。例如采用CuO高温灼烧法，需要加入CuO、光洁的Cu丝、CaO和分子筛。采用真空封管操作，马福炉内高温反应，反应加上降温时间大于8小时。综上所述，气体同位素法非常适合¹³C或¹⁵N标记无机和少量有机化合物的同位素丰度检测，对于绝大多数D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测存在困难。

目前，在生物、医学、农业和环境领域，存在着对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的大量需求，因此开发针对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度分析方法势在必行。本发明利用高效液相色谱-质谱法对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物进行表征，采用“质量簇”的分类方法，通过分析各个“质量簇”质量分布对目标化合物质量分布(目标化合物质谱图数据)的贡献，计算各个“质量簇”的摩尔分数，进而得到目标化合物的同位素标记丰度。

本方法适用于D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素标记丰度分析，对同位素全部标记(分子中某元素全标记)或者部分标记(官能团中某元素标记)的都适用。通过与标准品同位素标记丰度值的对比，该方法具有良好的准确度和精确度。此外，本方法操作简单，样品消耗量为亚毫克级，单针进样5分钟1次检测，连续平行进样10分钟6次检测。本方法是本领域中迫切需要的一种简单易行、准确可靠、高通量的新型同位素丰度分析方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种准确、灵敏、高通量的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：

用乙腈溶解稳定同位素标记有机化合物，得到浓度为5.0μg/mL的储备液，-20℃冷冻保存，再利用容量瓶定容得到浓度为0.10μg/mL的分析液，4℃冷藏保存；

(2)高效液相色谱-质谱联动测试：

利用高效液相色谱及质谱联用仪测试分析液，获得稳定同位素标记有机化合物的质谱数据，通过质量簇分类计算分析质谱数据，实现对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测。

高效液相色谱在检测时，色谱柱采用不锈钢阻尼管，柱温控制为25-40℃；进样量为5-25μL，进样时的流动相为水与乙腈按重量比为9∶1-6∶4组成的混合溶剂，进样时的流速为1mL/min，并经分流器分流20％进入质谱检测器。

质谱在检测时，电喷雾电压为3.5-4.5kV；调谐滤镜电压为60-80V；干燥气流量为8-14L/min；雾化气流量为2-4L/min；加热模块温度为300-400℃；脱溶剂管温度为200-300℃；单扫描时间为0.1-0.5s；扫描范围：m/z＝[M+H]⁺±10dalton(正离子模式)或[M-H]^-±10dalton(负离子模式)。

质量簇分类计算采用以下方法：

将稳定同位素标记有机化合物分为以下类别：C_xH_yN_wO_z(^LX_n ^HX₀)，C_xH_yN_wO_z(^LX_n-1 ^HX₁)，...，C_xH_yN_wO_z(^LX₁ ^HX_n-1)，C_xH_yN_wO_z(^LX₀ ^HX_n)，每一类为一质量簇；质量簇之间互不相同，所有质量簇的集合是目标化合物，即所有质量簇的质量分布的叠加是目标化合物整体同位素丰度分布(质谱图所展现的质量分布)。括号中的原子是标记位点，它具有确切的轻重原子数目；括号外部的原子是非标记位点，它具有天然同位素丰度分布。每个质量簇都具有和非标记位点“C_xH_yN_wO_z”天然同位素丰度分布相同的同位素分布(可由同位素丰度计算器计算)，且彼此间隔1dalton。

质谱图质荷比m/z＝i的质谱峰强来自于多个质量簇的叠加，质荷比m/z＝i位置的质谱峰强为：

A_mix ¹＝∑(x_labj·A_lab ⁱ)，(j＝0，1，…，n)

其中A_mix ⁱ为目标化合物在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强，A_labj ⁱ是“质量簇”C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强贡献，x_labj为C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)的摩尔分数；

联立质谱图上每一个质荷比的峰强的方程和摩尔分数的方程1＝∑x_labj(j＝0，1，…，n)，求出各质量簇的摩尔分数；

稳定同位素标记有机化合物C_xH_yN_wO_z(X_n)的^HX同位素标记丰度公式为：

atom％^HX＝∑(x_labj·j)/(n·∑x_labj)(j＝0，1，…，n)，利用该公式及获得数据计算得到同位素丰度。

所述的稳定同位素标记有机化合物在分类时，分子式中括号内为标记位点，X为被标记的元素。

所述的X为C、H或N元素，具有轻重两种原子形态(^LX和^HX)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.采用“质量簇”的分类方法，通过分析各个“质量簇”质量分布对目标化合物质量分布(目标化合物质谱图数据)的贡献，计算各个“质量簇”的摩尔分数，进而得到目标化合物的同位素标记丰度。

2.适用于D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素标记丰度分析，对同位素全部标记(分子中某元素全标记)或者部分标记(官能团中某元素标记)的都适用。

3.样品消耗量为亚毫克级，高通量分析(单针进样：5分钟/1次检测，连续平行进样：10分钟/6次检测)。

附图说明

图1为沙丁胺醇-D₃的结构式和质谱图；

图2为辛酸-1-¹³C的结构式和质谱图；

图3为L-丙氨酸-¹⁵N的结构式和质谱图。

具体实施方式

D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：

用乙腈溶解稳定同位素标记有机化合物，得到浓度为5.0μg/mL的储备液，-20℃冷冻保存，再利用容量瓶定容得到浓度为0.10μg/mL的分析液，4℃冷藏保存；

(2)高效液相色谱-质谱联动测试：

利用高效液相色谱及质谱联用仪测试分析液，获得稳定同位素标记有机化合物的质谱数据，通过质量簇分类计算分析质谱数据，实现对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测。

其中，样品检测条件如下：

1)色谱条件：

色谱柱：不锈钢阻尼管

柱温：25-40℃；

进样量5-25μL；

流动相：水∶乙腈＝9∶1-6∶4；

流速：1mL/min，经分流器分流20％进入质谱检测器；

平行进样次数：6次。

2)质谱条件：

电喷雾电压：3.5-4.5kV；

调谐滤镜电压：60-80V；

干燥气流量：8-14L/min；

雾化气流量：2-4L/min；

加热模块温度：300-400℃；

脱溶剂管温度：200-300℃；

单扫描时间时间：0.1-0.5s；

扫描范围：m/z＝[M+H]⁺±10dalton(正离子模式)或[M-H]^-±10dalton(负离子模式)

谱图叠加：＞30。

对于检测的目标化合物C_xH_yN_wO_z(X_n)，括号内为标记位点。X为被标记的元素，可以为C、H、N等元素，具有轻重两种原子形态(^LX和^HX)。由于合成工艺条件或者同位素稀释效应的影响，目标化合物可能会产生不完全标记的情况。按照标记位点被标记轻重原子的实际情况，可将目标化合物划分为以下几类：C_xH_yN_wO_z(^LX_n ^HX₀)，C_xH_yN_wO_z(^LX_n-1 ^HX₁)，...，C_xH_yN_wO_z(^LX₁ ^HX_n-1)，C_xH_yN_wO_z(^LX₀ ^HX_n)，每一类定义为一个“质量簇”，如表1所示。其中，“质量簇”之间互不相同，而所有“质量簇”的集合是目标化合物，即所有“质量簇”的质量分布的叠加是目标化合物整体同位素丰度分布(质谱图所展现的质量分布)。括号中的原子是标记位点，它具有确切的轻重原子数目；括号外部的原子是非标记位点，它具有天然同位素丰度分布。因此，每个“质量簇”都具有和非标记位点“C_xH_yN_wO_z”天然同位素丰度分布相同的同位素分布(可由同位素丰度计算器计算)，且彼此间隔1dalton。

表1按照“质量簇”对目标化合物C_xH_vN_wO_z(X_n)的分类

由于所有“质量簇”的质量分布的叠加是目标化合物的质谱图所展现的质量分布，因此质谱图质荷比m/z＝i的质谱峰强可能来自于多个“质量簇”的贡献，可表述为：

A_mix ⁱ＝∑(x_labj·A_labj ⁱ)，(j＝0，1，...，n)    (公式1)

其中A_mix ⁱ为目标化合物在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强，A_labj ⁱ是“质量簇”C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强贡献，x_labj为C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)的摩尔分数。

通过联立质谱图上每一个质荷比的峰强方程(公式1)和摩尔分数方程1＝∑x_labj(j＝0，1，...，n)，可以求出各个“质量簇”的摩尔分数。由于同位素标记化合物的同位素丰度通常按照标记位点的标记原子百分比表示，因此目标化合物C_xH_yN_wO_z(X_n)的^HX同位素标记丰度公式为：

atom％^HX＝∑(x_labj·j)/(n·∑x_labj)(j＝0，1，...，n)。    (公式2)

本方法中液相色谱作为进样器引入样品，将质量色谱图中目标化合物最大峰高对应的质谱图(大于30次扫描)作为该化合物的质谱图进行同位素标记丰度计算。相同实验条件下平行六次分析。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

沙丁胺醇-D₃的D同位素标记丰度分析

样品前处理、色谱条件和质谱参数如发明内容所叙。沙丁胺醇-D₃的结构式和质谱图如图1所示。

目标化合物沙丁胺醇-D₃的分子式为C₁₃H₁₈NO₃D₃，电喷雾离子化后会形成[M+H]⁺的分子离子。通过“质量簇”分类法，可以将目标化合物离子分成[C₁₃H₁₉NO₃(H₃D₀)]⁺，[C₁₃H₁₉NO₃(H₂D₁)]⁺，[C₁₃H₁₉NO₃(H₁D₂)]⁺和[C₁₃H₁₉NO₃(H₀D₃)]⁺四个“质量簇”，如表2所示。它们的质量分布与非标记位点“C₁₃H₁₉NO₃”的天然同位素分布相同，根据同位素丰度计算器的计算结果，同位素分布比为0.858∶0.127∶0.014∶0.001。

表2按照“质量簇”对目标化合物沙丁胺醇-D₃的分类

如表2所示，目标化合物沙丁胺醇-D₃的质荷比分布在m/z＝240～246的范围。由发明所述的公式1，可以得到如下方程组：

A_mix ²⁴⁰＝x_lab0·A_lab0 ²⁴⁰＝x_lab0·0.858

A_mix ²⁴¹＝x_lab0·A_lab0 ²⁴¹+x_lab1·A_lab1 ²⁴¹＝x_lab0·0.127+x_lab1·0.858

A_mix ²⁴²＝x_lab0·A_lab0 ²⁴²+x_lab1·A_lab1 ²⁴²+x_lab2·A_lab2 ²⁴²＝x_lab0·0.014+x_lab1·0.127+x_lab2·0.858

A_mix ²⁴³＝x_lab0·A_lab0 ²⁴³+x_lab1·A_lab1 ²⁴³+x_lab2·A_lab2 ²⁴³+x_lab3·A_lab3 ²⁴³

＝x_lab0·0.001+x_lab1·0.014+x_lab2·0.127+x_lab3·0.858

A_mix ²⁴⁴＝x_lab1·A_lab1 ²⁴⁴+x_lab2·A_lab2 ²⁴⁴+x_lab3·A_lab3 ²⁴⁴＝x_lab1·0.001+x_lab2·0.014+x_lab3·0.127

A_mix ²⁴⁵＝x_1ab2·A_lab2 ²⁴⁵+x_lab2·A_lab2 ²⁴⁵＝x_lab2·0.001+x_lab3·0.014

A_mix ²⁴⁶＝x_lab3·A_lab3 ²⁴⁶＝x_lab3·0.001

此外，各类离子摩尔分数之和应该为1，因此x_lab0+x_lab1+x_lab2+x_lab3＝1。联立解方程组，可得到各个“质量簇”的摩尔分数。通过发明所述的公式2，计算可得到沙丁胺醇-D₃的D同位素标记丰度为99.3％±0.1％，如表3所示。实施例1中使用的是加拿大CDN Isotopes公司生产的沙丁胺醇-D₃标准品(D atom％＞99％)。本发明方法实测的数据与产品标识指标良好符合，说明本方法具有良好的准确度。

表3沙丁胺醇-D₃的D同位素标记丰度计算结果

实施例2

辛酸-1-¹³C的同位素丰度分析

样品前处理、色谱条件和质谱参数如发明内容所叙。对于辛酸-1-¹³C，由于其负离子信号响应较好，因此采用负离子扫描模式。辛酸-1-¹³C的结构式和质谱图如图2所示。

目标化合物辛酸-1-¹³C的分子式为C₇H₁₆O₂ ¹³C，电喷雾离子化后会形成[M-H]^-的分子离子。通过“质量簇”分类法，可以将目标化合物离子分成[C₇H_15O2(¹²C₁ ¹³C₀)]^-和[C₇H₁₅O₂(¹²C₀ ¹³C₁)]^-两个“质量簇”，如表4所示。它们的质量分布与非标记位点“C₇H₁₅O₂”的天然同位素分布相同，根据同位素丰度计算器的计算结果，同位素分布比为0.919∶0.074∶0.006。

表4按照“质量簇”对目标化合物辛酸-1-¹³C的分类

如表4所示，目标化合物辛酸-1-¹³C的质荷比分布在m/z＝143～146的范围。由发明所述的公式1，可以得到如下方程组：

A_mix ¹⁴³＝x_lab0·A_lab0 ¹⁴³＝x_lab0·0.919

A_mix ¹⁴⁴＝x_lab0·A_lab0 ¹⁴⁴+x_lab1·A_lab1 ¹⁴⁴＝x_lab0·0.074+x_lab1·0.919

A_mix ¹⁴⁵＝x_lab0·A_lab0 ¹⁴⁵+x_lab1·A_lab1 ¹⁴⁵＝x_lab0·0.006+x_lab1·0.074

A_mix ¹⁴⁶＝x_lab1·A_lab1 ¹⁴⁶＝x_lab1·0.006

此外，各类离子摩尔分数之和应该为1，因此x_lab0+x_lab1＝1。联立解方程组，可得到各个“质量簇”的摩尔分数。通过发明所述的公式2，计算可得到辛酸-1-¹³C的¹³C同位素标记丰度为98.4％±0.2％，如表5所示。

表5辛酸-1-¹³C的¹³C同位素标记丰度计算结果

实施例3

L-丙氨酸-¹⁵N的同位素丰度分析

样品前处理、色谱条件和质谱参数如发明内容所叙。L-丙氨酸-¹⁵N的结构式和质谱图如图3所示。

目标化合物L-丙氨酸-¹⁵N的分子式为C₃H₇O₂ ¹⁵N，电喷雾离子化后会形成[M+H]⁺的分子离子。通过“质量簇”分类法，可以将目标化合物离子分成[C₃H₈O₂(¹⁴N₁ ¹⁵N₀)]+和[C₃H₈O₂(¹⁴N₀ ¹⁵N₁)]⁺两个“质量簇”，如表6所示。它们的质量分布与非标记位点“C₃H₈O₂”的天然同位素分布相同，根据同位素丰度计算器的计算结果，同位素分布比为0.963∶0.033∶0.004。

表6按照“质量簇”对目标化合物L-丙氨酸-¹⁵N的分类

如表6所示，目标化合物L-丙氨酸-¹⁵N的质荷比分布在m/z＝90～93的范围。由发明所述的公式1，可以得到如下方程组：

A_mix ⁹⁰＝x_lab0·A_lab0 ⁹⁰＝x_lab0·0.963

A_mix ⁹¹＝x_lab0·A_lab0 ⁹¹+x_lab1·A_lab1 ⁹¹＝x_lab0·0.033+x_lab1·0.963

A_mix ⁹²＝x_lab0·A_lab0 ⁹²+x_lab1·A_lab1 ⁹²＝x_lab0·0.004+x_lab1·0.033

A_mix ⁹³＝x_lab1·A_lab1 ⁹³＝x_lab1·0.004

此外，各类离子摩尔分数之和应该为1，因此x_lab0+x_lab1＝1。联立解方程组，可得到各个“质量簇”的摩尔分数。通过发明所述的公式2，计算可得到L-丙氨酸-¹⁵N同位素标记丰度为99.1％±0.1％，如表7所示。实施例3中使用的是美国CambridgeIsotope Laboratories公司生产的L-丙氨酸-¹⁵N标准品(¹⁵Natom％＝99.1％)。本发明方法实测的数据与产品标识指标良好符合，说明本方法具有良好的准确度。

表7L-丙氨酸-¹⁵N的¹⁵N同位素标记丰度计算结果

Claims (6)

1.D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品前处理：

用乙腈溶解稳定同位素标记有机化合物，得到浓度为5.0μg/mL的储备液，-20℃冷冻保存，再利用容量瓶定容得到浓度为0.10μg/mL的分析液，4℃冷藏保存；

(2)高效液相色谱-质谱联动测试：

利用高效液相色谱及质谱联用仪测试分析液，获得稳定同位素标记有机化合物的质谱数据，通过质量簇分类计算分析质谱数据，实现对D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测。

2.根据权利要求1所述的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱在检测时，色谱柱采用不锈钢阻尼管，柱温控制为25-40℃；进样量为5-25μL，进样时的流动相为水与乙腈按重量比为9∶1-6∶4组成的混合溶剂，进样时的流速为1mL/min，并经分流器分流20％进入质谱检测器。

3.根据权利要求1所述的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，所述的质谱在检测时，电喷雾电压为3.5-4.5kV；调谐滤镜电压为60-80V；干燥气流量为8-14L/min；雾化气流量为2-4L/min；加热模块温度为300-400℃；脱溶剂管温度为200-300℃；单扫描时间为0.1-0.5s；扫描范围：m/z＝[M+H]⁺±10dalton(正离子模式)或[M-H]^-±10dalton(负离子模式)。

4.根据权利要求1所述的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，所述的质量簇分类计算采用以下方法：

将稳定同位素标记有机化合物分为以下类别：C_xH_yN_wO_z(^LX_n ^HX₀)，C_xH_yN_wO_z(^LX_n-1 ^HX₁)，...，C_xH_yN_wO_z(^LX₁ ^HX_n-1)，C_xH_yN_wO_z(^LX₀ ^HX_n)，每一类为一质量簇；

质谱图质荷比m/z＝i的质谱峰强来自于多个质量簇的叠加，质荷比m/z＝i位置的质谱峰强为：

A_mix ⁱ＝∑(x_1abj·A_labj ⁱ)，(j＝0，1，…，n)

其中A_mix ⁱ为目标化合物在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强，A_labj ⁱ是“质量簇”C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)在质荷比m/z＝i位置的质谱峰强贡献，x_labj为C_xH_yN_wO_z(^LX_n-j ^HX_j)的摩尔分数；

联立质谱图上每一个质荷比的峰强的方程和摩尔分数的方程1＝∑x_labj(j＝0，1，…，n)，求出各质量簇的摩尔分数；

稳定同位素标记有机化合物C_xH_yN_wO_z(X_n)的^HX同位素标记丰度公式为：

atom％^HX＝∑(x_labj·j)/(n·∑x_labj)(j＝0，1，…，n)，利用该公式及获得数据计算得到同位素丰度。

5.根据权利要求4所述的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，所述的稳定同位素标记有机化合物在分类时，分子式中括号内为标记位点，X为被标记的元素。

6.根据权利要求5所述的D、¹³C或¹⁵N标记有机化合物的同位素丰度检测方法，其特征在于，所述的X为C、H或N元素，具有轻重两种原子形态(^LX和^HX)。