CN109142594A - 用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒 - Google Patents

用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，该试剂盒主要包括：校准品、内标、质控品、衍生化试剂、复溶剂和流动相；向人血浆样品中加入含有儿茶酚胺和变肾上腺素内标的甲醇溶液进行蛋白沉淀，移取上清液使用N2吹干后加入PITC进行衍生化反应，衍生化产物使用N2吹干后加入复溶剂得到待测样本，使用液相色谱串联质谱进行检测，采用内标标准曲线法进行定量。该方法可以同时检测3种儿茶酚胺和2种变肾上腺素，所需样本体积少，样本前处理简单，特异性、抗基质干扰能力强，检测时间短，通量高，检测精密度高，成本低廉。

Description

用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试 剂盒
技术领域
本发明涉及儿茶酚胺和变肾上腺素检测的技术领域，具体涉及一种用于准确测定体 液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒。
背景技术
儿茶酚胺(CAs)是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，主要包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)和多巴胺(DA)。CAs作为肾上腺髓质、肾上腺素神经元以及肾上 腺外嗜铬体合成与释放的单胺类神经递质，是生物体内具有较强生理学活性的内源性物 质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用并且与多种生理、病理现象密切相关。CAs 不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着 广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。变肾上腺素(MN)和去甲变肾上腺素(NMN 作为肾上腺素和去甲肾上腺素的代谢物对嗜铬细胞瘤具有较高的诊断价值。血浆变肾上 腺素能反映肿瘤细胞产生的游离代谢产物，检测方便，不受肾功能影响，半衰期较CA 长，而血浆CAs(E、NE)较易受情绪、药物等影响。因此血浆游离MNs的诊断性能更加 稳定且直接反映肿瘤细胞状态。血浆游离MNs的高敏感性和高特异性使其成为嗜铬细 胞瘤诊治导则中推荐的标志物。同时测定血、尿中的CAs及其代谢产物MNs，可获得 更高的诊断率。
由于CA具有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链的化学结构特点，所以CA极性大，且具有较强亲水性。CA是两性化合物，其邻苯二酚基团在酸性条件下比较稳定， 中性或碱性条件下易被氧化成醌。生物样品中儿茶酚胺含量极微(pg/mL)，生物活性极 不稳定，加上生物样品中本身存在的许多结构相似的代谢物及较多内源性化学干扰物， 造成了测定的困难。目前，CAs及其代谢物的分析方法主要有免疫法、高效液相色谱电 化学检测法(HPLC-ECD)、气相色谱串联质谱(GC-MS)、液相色谱串联二级质谱 (LC-MS/MS)等。试剂盒酶联免疫分析法的操作步骤繁琐，试剂盒价格也非常昂贵， 难以在临床上推广。荧光法选择激发波长285nm、发射波长340nm，同时检测NE、E 和DA，操作简便，但检测限较高，使得测定时的灵敏度达不到要求，也不能同时测定 儿茶酚胺的代谢物。用高效液相色谱-电化学检测的方法对体内多种内源性物质都有响 应、专属性差，尤其是测定血浆和尿液中的CA时干扰严重，因此良好的样品前处理就 成为不可缺少的步骤。近几年，随着质谱的诞生，一种新的高效、高灵敏度的分析方法 随之产生，HPLC-MS联用技术不仅克服了色谱法本身固有的定性能力差的问题，也克 服了质谱法所具有的分离效率差的问题，两种方法联用极大的提高了分析的灵敏度。同 时，质谱可以采用同位素内标法进行定量，定量准确，不失为一种很好的定量方法。采 用HPLC-MS/MS的方法检测CAs，通过CAs特征性离子对可提供有用的结构信息， 较单独的紫外检测具有更好的选择性和特异性。由于体液中CA含量低而基质复杂，样 本前处理要达到净化的目的。常用的样本前处理方法有固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)、蛋白沉淀、氧化铝提取等。目前，国外多采用同相萃取小柱进行样品前处理。 其优点是：经过固相萃取小柱的分离，可以同时测定内源性儿茶酚胺及其多种代谢产物， 重现性好，并可在线分析；但缺点是固相萃取小柱价格昂贵，且样本数目多时，需要一 系列配合萃取小柱使用的固相萃取装置和柱吹干装置，在国内不易普及于临床，故这种 样品处理方法国内仅少数研究者采用。CAs在反相液相色谱中难以保留，离子抑制严重， 造成其定量分析困难。衍生化方法是提高其离子化效率和反相色谱保留的衍生化试剂能 够特异性的衍生体液中位阻适中的伯胺和仲胺代谢物，此法大大增强了胺类物质在色谱 中的保留能力和分离能力，同时显著提升了其质谱检测的特异性和灵敏度，而且衍生方 法相对于固相萃取可大幅降低成本。目前，在临床上利用质谱法同时检测总同检测儿茶 酚胺和变肾上腺素浓度时，还没有发现采用衍生前处理方法的质谱试剂盒。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种无需进行复杂的净化提纯步骤，而且所 需样本量小，可与液相色谱仪串联质谱仪配套使用，应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测3种儿茶酚胺和2种变肾上腺素，达到单样本多指标同步检测功能，具 有检测特异性好，灵敏度高，并且整个检测流程时间短、通量高，成本低廉。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于准确测定体液样本中 儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，该试剂盒主要包括：
(1)校准品：使用50％～90％的甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品，校准品的6个浓度点为：
多巴胺、变肾上腺素和去甲变肾上腺素6个浓度点相同，为：0.05nmol/L、0.10nmol/L、 0.50nmol/L、1.00nmol/L、5.00nmol/L、10.00nmol/L；
肾上腺素：0.2nmol/L、1.0nmol/L、5.0nmol/L、10.0nmol/L、25.0nmol/L、50.0nmol/L；
去甲肾上腺素：1.0nmol/L、5.0nmol/L、10.0nmol/L、50.0nmol/L、100.0nmol/L、200.0nmol/L；
上述6个浓度点的校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；
(2)内标：内标溶液为多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素 -d3和去甲肾上腺素-d6的混合溶液，使用甲醇作为稀释液，各个成分在总的混合溶液中 的浓度范围均为1～50nmol/L；
(3)质控品：包括控品1和质控品2，其中
质控品1的浓度范围和成分包括：多巴胺：0.1～1nmol/L；肾上腺素：0.4～2nmol/L； 去甲肾上腺素：2～10nmol/LL；变肾上腺素：0.1～1nmol/L；去甲变肾上腺素：0.1～1nmol/L；
质控品2的浓度和成分范围包括：多巴胺：4～8nmol/L；肾上腺素：10～15nmol/L；去甲肾上腺素：50～100nmol/LL；变肾上腺素：4～8nmol/L；去甲变肾上腺素：4～8nmol/L；
质控品1和质控品2均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲 变肾上腺素的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度；
(4)衍生化试剂：衍生化试剂为异硫氰酸苯酯(PITC)，由乙腈配制成浓度为 0.1～5mol/L的溶液；
(5)复溶剂：复溶剂是含有乙酸铵的甲醇或乙腈与水组成的混合物，混合物中甲醇或乙腈的体积百分比含量为10～50％、乙酸铵的浓度为1～10mmol/L；
(6)流动相：流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，二者均含有质量百分比 浓度为0.05-0.20％有机酸或有机碱。
本发明上述用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，还包括：
(7)96微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成，U型底96孔板用做反应板， V型底96孔板用做进样板。
(8)封片：粘性封片用于样本处理过程，铝箔制封片用于样本检测过程。
本发明上述(1)中的使用甲醇浓度优选为80％(质量百分比)。
本发明上述(3)中的质控品1和质控品2均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、 变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合物，它们可以是冻干粉、血浆基质、血清基质、 尿液基质、脑脊液基质或者为溶液基质；若为溶液基质，所使用的溶剂可以是甲醇，也 可以是乙醇。
本发明上述(4)衍生化试剂中异硫氰酸苯酯的浓度优选为1mol/L。
本发明上述(5)复溶剂中甲醇体积百分比含量为50％，乙酸铵的浓度为5mmol/L。
本发明上述(6)流动相中的有机酸可以为甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或者一种以上；有机碱可以为甲酸铵、乙酸铵、氨水等中的一种或者一种以上；优选的在流动 相中的质量百分比浓度为0.1％的甲酸。
本发明上述(8)封片的使用能尽量减少有机溶剂的挥发，优选粘性封片用于样本处理过程，铝箔制封片用于样本检测过程。
本发明上述试剂盒中还包括操作说明书。
本发明还提供一种上述用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试 剂盒的使用方法，步骤包括：向人血浆样品中加入含有儿茶酚胺和变肾上腺素内标的甲醇溶液进行蛋白沉淀，移取上清液使用N2吹干后加入PITC进行衍生化反应，衍生化产 物使用N2吹干后加入复溶剂得到待测样本，使用液相色谱串联质谱进行检测，采用内 标标准曲线法进行定量。
具体的方法步骤为：
(1)检测样本处理
分别移取25μL的标准品、质控品和待测样本到96孔板中，加入50μL含有已知 浓度内标的甲醇溶液(内标)，700rpm振荡2min进行蛋白沉淀；4000rpm离心3min， 移取50μL上清液到96孔板中使用N2吹干；然后加入50μL衍生化试剂，用粘性封片 覆盖微孔板，室温条件下进行20min衍生化反应；衍生化产物用N2吹干后，加入100μL 复溶剂，用铝箔制微孔板封片覆盖微孔板，700rpm振荡2min，得到待测样本用于 LC/MS/MS检测分析；
(2)检测样本LC/MS/MS检测分析
(2.1)色谱条件
·色谱柱：C18柱或者相当；
·流动相：流动相A和流动相B；
·流速：0.4mL/min；
·梯度洗脱：按下表1所示；
表1
上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相A和流动相B体积比例随时间不断调整变化，以流动
相A的占比变化为体现。
·柱温：40℃；
·进样量：2μL；
(2.2)质谱条件：
电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为DA： 289→137，DA-d4：293→141；E：319→135，E-d3：322→138；NE：287→107，NE-d6： 293→141；MN：315→165，MN-d3：318→168；NMN：301→121，NMN-d3：304→137；。 离子源参数包括离子源温度：650℃，气帘气：20psi，雾化气：55psi，辅助加热气： 55psi，碰撞气：medium；
(2.3)样本检测：样本类型可以是血浆、血清、尿液和脑脊液，取处理好的校准品、质控品和样本各2μL注入液质连用仪，记录色谱图；
(2.4)检测结果的计算；
(2.41)标准曲线的绘制方法：以6个校准品与内标的浓度比为横坐标(x)，以6 个对照品的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线；
(2.42)标准曲线的拟合：以6个对照品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行 线性回归，可或得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b 为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；
(2.43)回收率的计算：将质控品测定的目标分析物峰面积和内标峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算质控品的目标分析物浓度。质控品回收率的计算公式为：回收 率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在90％-110％范围内；
(2.44)样本结果的计算：将样本测定的目标分析物峰面积和内标峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算样本的目标分析物浓度。
本发明的优点和有益效果：
1.采用本发明试剂盒来处理体液样本，采用简单的蛋白沉淀-衍生化前处理方法，无 需进行复杂的净化提纯步骤，而且所需样本量小，可与液相色谱仪串联质谱仪配套使用， 应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测3种儿茶酚胺和2种变肾上腺素，达到单样本多指标同步检测功能，具有检测特异性好，灵敏度高，并且整个检测流程时间 短、通量高，成本低廉。
2.生物样品中儿茶酚胺含量极微(pg/mL)，生物活性极不稳定，加上生物样品中本身存在的许多结构相似的代谢物及较多内源性化学干扰物，造成了测定的困难。液相色 谱(HPLC)分离是通过物质在固定相与流动相间分配系数的差别而进行分离。质谱通 过物质的特征性离子对可提供有用的结构信息，具有更好的选择性和特异性。本发明使 用的HPLC-MS联用技术不仅克服了色谱法本身固有的定性能力差的问题，也克服了质 谱法所具有的分离效率差的问题，两种方法联用可极大的提高了分析的灵敏度和特异 性。同时，采用同位素内标法进行定量，定量准确。衍生化是一种利用化学变换把化合 物转化成类似化学结构的物质，本发明对样本的前处理使用衍生化法(现有技术使用的 是固相萃取方法，固相萃取采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、 净化)；儿茶酚胺在反相液相色谱中难以保留，离子抑制严重，造成其定量分析困难； 衍生化方法可提高其离子化效率和反相色谱的保留。本发明使用的衍生化试剂能够特异 性的衍生体液中位阻适中的伯胺和仲胺代谢物，此法大大增强了胺类物质在色谱中的保 留能力和分离能力，同时显著提升了其质谱检测的特异性和灵敏度，仅用25μL血清可 以做到检测限低至pg/mL，样本体积小(25μL)，可满足多种条件下的样本检测。与现 有技术比较，用低廉的衍生化试剂代替昂贵的固相萃取板(柱)，可有效降低成本，另 本发明使用C18柱即可达到分离目的，与现有技术使用的五氟苯基色谱柱、亲水作用色 谱柱、氨基色谱柱相比，成本更低。
附图说明
图1儿茶酚胺和变肾上腺素色谱洗脱出峰的绝对保留时间。
图2多巴胺标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L。
图3肾上腺素标准曲线线性范围:(0.2～50)nmol/L。
图4去甲肾上腺素标准曲线线性范围:(1～200)nmol/L。
图5变肾上腺素标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L。
图6去甲变肾上腺素标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背 离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表1：
表1实施例1的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L。
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；
质控品2包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺 素:60.0nmol/L；变肾上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控 品2为血浆基质；质控品1和质控品2均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上 腺素、和去甲变肾上腺素的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度。
4.衍生化试剂：1mol/L的PITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵；
6.流动相：流动相A(0.1％甲酸水溶液)，流动相B(0.1％甲酸乙腈溶液)。
实施例2：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表2：
表2实施例2的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L；
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；
质控品2包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺 素:60.0nmol/L；变肾上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控 品2为血浆基质；
4.衍生化试剂：0.5mol/LPITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵；
6.流动相：流动相A(0.15％甲酸水溶液)，流动相B(0.15％甲酸乙腈溶液)。
实施例3：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表3：
表3实施例3的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L。
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；
质控品2包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺 素:60.0nmol/L；变肾上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控 品2为血清基质。
4.衍生化试剂：0.1mol/L的PITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵；
6.流动相：流动相A(0.2％甲酸水溶液)，流动相B(0.2％甲酸乙腈溶液)。
实施例4：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表4：
表4实施例1的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L。
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；质控品2 包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺素:60.0nmol/L；变肾 上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控品2为尿液基质。
4.衍生化试剂：0.1mol/LPITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵；
6.流动相：流动相A(0.2％甲酸水溶液)，流动相B(0.2％甲酸乙腈溶液)；
实施例5：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表5：
表5实施例5的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L。
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；
质控品2包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺 素:60.0nmol/L；变肾上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控 品2为脑脊液基质。
4.衍生化试剂：0.1mol/LPITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵
6.流动相：流动相A(0.05％甲酸水溶液)，流动相B(0.05％甲酸乙腈溶液)
实施例6：
1.校准品：6个浓度点的校准品如下表6：
表6实施例6的6个浓度点的校准品
上述1～6校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；溶剂为80％甲醇。
2.内标溶液：多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾 上腺素-d6的混合溶液，溶剂为甲醇，浓度均为20nmol/L。
3.质控品:质控品1包括：多巴胺：0.8nmol/L；肾上腺素：1.5nmol/L；去甲肾上 腺素：5.0nmol/LL；变肾上腺素：0.8nmol/L；去甲变肾上腺素：0.8nmol/L；质控品2 包括：多巴胺：4.0nmol/L；肾上腺素：15.0nmol/L；去甲肾上腺素:60.0nmol/L；变肾 上腺素:4.0nmol/L；去甲变肾上腺素：4.0nmol/L；质控品1和质控品2为冻干粉基质。
4.衍生化试剂：0.1mol/L PITC乙腈溶液；
5.复溶剂：50％甲醇含有5mmol/L乙酸铵；
6.流动相：流动相A(0.2％甲酸水溶液)，流动相B(0.2％甲酸乙腈溶液)；
对实施例1～6得到的前处理后体液样本分别进行LC/MS/MS检测，具体的步骤包括：
(1)检测样本处理
分别移取25μL的标准品、质控品和待测样本到96孔板中，加入50μL含有已知 浓度内标的甲醇溶液(内标)，700rpm振荡2min进行蛋白沉淀；4000rpm离心3min， 移取50μL上清液到96孔板中使用N2吹干；然后加入50μL衍生化试剂，用粘性封片 覆盖微孔板，室温条件下进行20min衍生化反应；衍生化产物用N2吹干后，加入100μL 复溶剂，用铝箔制微孔板封片覆盖微孔板，700rpm振荡2min，得到待测样本用于 LC/MS/MS检测分析；
(2)检测样本LC/MS/MS检测分析
(2.1)色谱条件
·色谱柱：C18柱或者相当；
·流动相：流动相A和流动相B；
·流速：0.4mL/min；
·梯度洗脱：按下表7所示；
表7
上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相A和流动相B体积比例随时间不断调整变化，以流动
相A的占比变化为体现。
·柱温：40℃；
·进样量：2μL；
(2.2)质谱条件：
电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为DA： 289→137，DA-d4：293→141；E：301→107，E-d3：304→110；NE：287→152，NE-d6： 293→158；MN：315→180，MN-d3：318→183；NMN：301→121，NMN-d3：304→137；。 离子源参数包括离子源温度：650℃，气帘气：20psi，雾化气：55psi，辅助加热气： 55psi，碰撞气：medium；
(2.3)样本检测：样本类型可以是血浆、血清、尿液和脑脊液，取处理好的校准品、质控品和样本各2μL注入液质连用仪，记录色谱图；
(2.4)检测结果的计算
(2.41)标准曲线的绘制方法：以6个校准品与内标的浓度比为横坐标(x)，以6 个对照品的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线；
(2.42)标准曲线的拟合：以6个对照品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行 线性回归，可或得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b 为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；
(2.43)回收率的计算：将质控品测定的目标分析物峰面积和内标峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算质控品的目标分析物浓度。质控品回收率的计算公式为：回收 率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在90％-110％范围内；
(2.44)样本结果的计算：将样本测定的目标分析物峰面积和内标峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算样本的目标分析物浓度。
图1为儿茶酚胺和变肾上腺素色谱洗脱出峰的绝对保留时间。
实施例1-6的检测结果基本一致，下面结合相关附图对实施例1试剂盒分析性能进行说明：
1.标准曲线与线性：图2多巴胺标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L，图3肾上腺素标准曲线线性范围:(0.2～50)nmol/L，图4去甲肾上腺素标准曲线线性范 围:(1～200)nmol/L，图5变肾上腺素标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L，图6去甲变肾 上腺素标准曲线线性范围:(0.05～10)nmol/L，由图可知，多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺 素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素的相关系数r都大于0.99，线性良好。
2.准确度和精密度
分别对质控品1和质控品2进行测定，结果如下表8所示：
表8质控品1和质控品2测定结果
3.检测限与定量限
采用向空白血清样本加标制作接近定量限的样本，来确定试剂盒方法的定量限(n＝12)，根据定量限结果以S/N等于3计算出试剂盒方法的检测限，结果如下表9：
表9 试剂盒方法的检测限
采用本发明试剂盒来处理体液样本，采用简单的蛋白沉淀-衍生化前处理方法，无需进行复杂的净化提纯步骤，而且所需样本量小(仅为25μL，现有技术100μL以上)， 可与液相色谱仪串联质谱仪配套使用，应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检 测3种儿茶酚胺和2种变肾上腺素，达到单样本多指标同步检测功能，具有检测特异性 好，灵敏度高，并且整个检测流程时间短、通量高，成本低廉。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医学检验技术领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰 也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改 变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一种用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，主要包括：
(1)校准品：使用50％～90％的甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品，校准品的6个浓度点为：
多巴胺、变肾上腺素和去甲变肾上腺素的浓度一致，6个浓度依次为：0.05nmol/L、0.10nmol/L、0.50nmol/L、1.00nmol/L、5.00nmol/L、10.00nmol/L；
肾上腺素的6个浓度依次：0.2nmol/L、1.0nmol/L、5.0nmol/L、10.0nmol/L、25.0nmol/L、50.0nmol/L；
去甲肾上腺素的6个浓度依次：1.0nmol/L、5.0nmol/L、10.0nmol/L、50.0nmol/L、100.0nmol/L、200.0nmol/L；
上述校准品均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；
(2)内标：内标溶液为多巴胺-d4、肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3和去甲肾上腺素-d6的混合溶液，使用甲醇作为稀释液，各个成分在总的混合溶液中的浓度范围为1～50nmol/L；
(3)质控品：包括控品1和质控品2，其中
质控品1的浓度范围和成分包括：多巴胺：0.1～1nmol/L；肾上腺素：0.4～2nmol/L；去甲肾上腺素：2～10nmol/LL；变肾上腺素：0.1～1nmol/L；去甲变肾上腺素：0.1～1nmol/L；
质控品2的浓度和成分范围包括：多巴胺：4～8nmol/L；肾上腺素：10～15nmol/L；去甲肾上腺素：50～100nmol/LL；变肾上腺素：4～8nmol/L；去甲变肾上腺素：4～8nmol/L；
质控品1和质控品2均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合物；各个成分的浓度为在混合物中各自浓度；
(4)衍生化试剂：衍生化试剂为异硫氰酸苯酯(PITC)，由乙腈配制成浓度为0.1～5mol/L的溶液；
(5)复溶剂：复溶剂是含有乙酸铵的甲醇或乙腈与水组成的混合物，混合物中甲醇或乙腈的质量百分比含量为10～50％、乙酸铵的浓度为1～10mmol/L；
(6)流动相：流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，二者均含有质量百分比浓度为0.05-0.20％有机酸或有机碱。
2.根据权利要求1所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，还包括
(7)96微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成，U型底96孔板用做反应板，用V型底96孔板做进样板：
(8)封片：粘性封片用于样本处理过程，铝箔制封片用于样本检测过程。
3.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，所述(1)中作为稀释液的甲醇浓度为80％。
4.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，
所述(3)中的质控品1和质控品2均为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合物，形式为冻干粉、血浆基质、血清基质、尿液基质、脑脊液基质或者为溶液基质；若为溶液基质，所使用的溶剂为甲醇或乙醇。
5.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，所述(4)衍生化试剂中异硫氰酸苯酯的浓度为1mol/L。
6.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，所述(5)复溶剂中甲醇质量百分比含量为50％，乙酸铵的浓度为5mmol/L。
7.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，所述(6)流动相中的有机酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或者一种以上；有机碱为甲酸铵、乙酸铵、氨水等中的一种或者一种以上；优选的在流动相中的质量百分比浓度为0.1％的甲酸。
8.根据权利要求2所述的用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒，其特征在于，所述(8)封片的使用能尽量减少有机溶剂的挥发，优选粘性封片用于样本处理过程，铝箔制封片用于样本检测过程。
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