CN101680904A - 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测 - Google Patents

使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测 Download PDF

Info

Publication number
CN101680904A
CN101680904A CN200880005968A CN200880005968A CN101680904A CN 101680904 A CN101680904 A CN 101680904A CN 200880005968 A CN200880005968 A CN 200880005968A CN 200880005968 A CN200880005968 A CN 200880005968A CN 101680904 A CN101680904 A CN 101680904A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
acid
homocysteine
succinic acid
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880005968A
Other languages
English (en)
Inventor
P·阿佩尔布拉德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Merck Sequant AB
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN101680904A publication Critical patent/CN101680904A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/364—Amphoteric or zwitterionic ion-exchanger
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Abstract

本发明提供用于在还可含有丁二酸和高半胱氨酸的临床样品中定性和定量地检测甲基丙二酸的方法，所述方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包括如下步骤：a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的样品；b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；c)将包含所述样品的所述流动相从液相色谱柱洗脱，所述色谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；d)通过质谱检测在所述样品中检测可能存在的甲基丙二酸和丁二酸以及任选的高半胱氨酸；以及e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机分子的量。

Description

使用具有两性离子固定相的HILIC与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
本发明涉及用于在大量样品中分析有机小分子的方法。具体而言，本发明提供从诸如全血、血浆、血清和尿的生物基质中大规模测定临床目标有机小分子甲基丙二酸、丁二酸并任选测定高半胱氨酸的方法。
背景技术
所有在本文中公开的参考文献均通过引用结合到本文中。
要求临床实验室所使用的分析技术具有快速、简单且稳定的性能，除此之外还需具备灵敏性和选择性。大量的不同基质(即尿、血浆、血清、全血等)中的样品需要各种各样的技术，基于这些技术可开发出简单的并且以几乎不间断或不间断的自动方式使用的方法。常用的技术为酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法因易于自动化而得于普及。然而，偶尔会由于交叉反应或缺少抗体而导致需要使用多种ELISA试剂盒来监测样品中多种可能在临床上重要的化合物。这增加了成本并降低了样品处理量。
因此，液相色谱(LC)并且尤其是高效液相色谱(HPLC)作为将混合物分离为其各组分并定量测定各化合物的优异方法而倍受瞩目。通过简单地选择流动相和固定相，HPLC能将脂溶性或水溶性物质分离为其各组分而无需对所述物质进行任何预处理。然而，仅仅使用例如紫外区吸收的常规参数，用于HPLC的传统检测器系统对特定化学结构不灵敏。例如，在测定UV吸收相对较低的化合物时，需要柱前衍生步骤以获得保留时间、增强色谱分离选择性并获得对临床相关浓缩物的足够高的灵敏度(Pastore A等，Clin.Chem.44，825-32，1998)。因此，质谱检测成为日益频繁使用的工具。US 4,298,795公开了通过质谱法进行检测的HPLC系统。对质谱的一般性介绍以及与液相色谱的联用可参见“Introduction to mass spectrometry(质谱介绍)”(Watson，J.Throck，Lippincott-Raven Publisher出版社，Philadelphia，第3版，1997)，质谱电喷雾离子化原理描述于MassSpectrometry Reviews，20，362-87，2001，Nadja B.Chech和Christie G.Enke著。
含有HPLC和质谱(MS)检测联用的系统还被开发用于大量临床样品的常规分析，可预期其将更多地用于临床实验室(Kinter M.，Clin.Chem.，50，1500-2，2004)。已将样品制备和校正规程以及自动化程序优化并用于HPLC-MS方法。MS技术的进步在MS仪器中产生了具有高分辨率的高效仪器。事实上，在某些情况下，预先的色谱分离已被省略并被认为不必要。
US 6,541,263描述了使用HPLC和质谱在人血浆中测定皮质类固醇。HPLC和MS的联用使得可定量和定性地分析低浓度的结构类似的化合物。然而，采用US 6,541,263的技术分析的所有化合物均为非常大且疏水的物质。还需要分析在临床上重要的小的、极性的和/或亲水的分子。
这种小的、极性的和/或亲水的分子在临床上重要的分析之典型实例是对甲基丙二酸和丁二酸的定量分析，任选还对高半胱氨酸的定量分析。甲基丙二酸(MMA)(以及高半胱氨酸)是B12缺乏的诊断标记物，而常常干扰上述化合物定量分析的丁二酸是MMA在生理学上的丰富的异构体。多年来，人们尝试了使用各种分析技术的不同方法以达成快速、准确地定量测试MMA的目标，然而这是徒劳的。在这些技术中，MMA是在色谱上与丁二酸良好地分离，而不是在同一次分析中通过光谱数据的解卷积法(deconvolution)或使用高分辨能力，即MS/MS检测系统来分离。
WO 03/079008公开了使用液相色谱和串联MS检测诸如MMA和丁二酸的小分子的方法。所述方法复杂、耗时，包括在测定前对样品的衍生化以及在获得结果前的预先计算的步骤。
WO 2006/090428提供了用于分析小分子的反相方法。从其公开的色谱图可知难以获得对MMA和丁二酸的良好分离。
因此，仍需要用于定性和/或定量地分析临床样品中的医学目标有机小分子的改进方法。理想地，这种测定方法应快速、需要最少量的样品预处理、易于自动化且结果应易于解释。
发明内容
本发明通过提供用于检测甲基丙二酸并任选同时检测高半胱氨酸和丁二酸的方法解决上述对MMA快速、准确定量的问题，所述方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包括以下步骤：
a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的样品；
b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；
c)将包含所述样品的所述流动相从液相色谱柱洗脱，所述液相色谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；
d)通过质谱检测可能存在的甲基丙二酸和/或丁二酸以及任选的高半胱氨酸；以及
e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机分子的量。
由于样品预处理规程已知，因此初始样品浓度可通过稀释因子计算并且与临床或医学评价研究中的对象(患者)的其它观察相关。
优选水混溶性有机溶剂为乙腈。所述溶剂还可选自以下水溶性溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮和THF或其混合物。优选乙腈。
此外，优选流动相由乙腈和水缓冲溶液(诸如盐、弱酸和弱碱的水溶液)构成。缓冲物质优选诸如乙酸铵和甲酸铵的盐，还可使用诸如甲酸或乙酸的弱酸。在某些HILIC/MS应用中，可在水缓冲溶液中包含氨和碳酸铵。所述水缓冲溶液具有微酸性至微碱性的pH，优选为4.0-7.5，还优选为4.0-7.0，尤其为4.0-5.0，并且流动相的总离子强度优选为5-60mM。
此外，优选流动相的乙腈/水缓冲溶液的组成为95/5-60/40，优选85/15-65/35，并最优选80/20-65/35。
此外，还优选固定相的两性离子基团为CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2-CH2-SO3 -或-O-PO- 3-CH2-CH2-N+(CH2)3，优选CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2-CH2-SO3 -。实施本发明时可使用的固定相公开于US 2005/0064192 A1和WO 00/27496。
已证明这些两性离子固定相对极性和亲水性化合物的分离的选择性和适应性与固定相载体的化学或物理形式(format)无关。例如，已显示在硅胶载体上使用两性离子固定相时，对流动相pH的改变可用于优化对肽的分离选择性(P.J.Boersema，N.Divecha，A.J.R.Heck，S.Mohammed J.Proteome Res.，(2007)，印刷中)，对于一系列聚甲基丙烯酸酯基两性离子整体柱(zwitterionic monolith)上的苯甲酸也有类似的方式(Z.Jiang，N.W.Smith，P.D.Ferguson和M.R.Taylor，Anal.Chem.79，1243-1250，2007)。在这些研究中，影响均非来自于载体材料，而是来自于同时影响容量因子和选择性的分析物的解离和相应的亲水性变化。在最近的关于HILIC的综述中讨论了固定相功能基团和载体的影响(P.K.Irgum J.Sep.Sci.，29，1784-1821，2006)。
适合于本发明的载体的实例有多孔硅胶、锆、石墨和聚合物或共聚物材料，其形状为大小-30μm、优选为3.5-10μm并且孔隙为50-300
Figure G2008800059686D00042
的球形颗粒，或者为所述材料的整体柱结构，或者任选为窄内径毛细管的内壁。
合成或天然来源的聚合物或共聚物载体可含有单乙烯基或低聚乙烯基单体单元，诸如苯乙烯及其取代衍生物、丙烯酸或甲基丙烯酸、丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸羟烷基酯和甲基丙烯酸羟烷基酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、乙烯吡啶及其取代衍生物、二乙烯基苯、二乙烯吡啶、亚烷基二丙烯酸酯、亚烷基二甲基丙烯酸酯、最多具有5个乙二醇重复单元的寡聚乙二醇二丙烯酸酯和寡聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、亚烷基双(丙烯酰胺)、哌啶双(丙烯酰胺)、三甲氧基丙烷三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯，和它们的混合物。
在优选的实施方式中，两性离子功能配体通过接枝聚合结合至所述载体、通过多步反应将两性离子单体或两性离子配体附着至所述载体表面或通过将所述单体或配体和交联单体和稀释剂共聚形成包含两性离子功能基团的整体柱载体(monolith carrier)。
尤其有利的是应用所述方法定量或定性测定临床样品中的甲基丙二酸、任选还测定高半胱氨酸和丁二酸。这种临床样品优选体液，诸如尿、血、血浆、血清和脑脊液。将所述临床样品与乙腈混合以使可包含于所述样品中的蛋白质沉淀。在去除沉淀的蛋白质后，可将残留的上清液直接注入流动相并洗脱。
附图说明
参照附图进一步描述本发明，其中：
图1显示MMA、丁二酸和高半胱氨酸的结构；
图2显示ZIC-HILIC柱的两性离子甜菜碱功能基团；
图3a-c提供说明在氘代MMA内标的存在下，从分别掺入了a)50、b)476和c)1000nM MMA的人血浆样品中分离MMA的色谱图，使用与单离子监测负离子电喷雾MS联用的HILIC；
图4提供人血浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中掺入了50-1000nM中六个彼此独立浓度的MMA；
图5提供人血浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中掺入了50-200,000nM中13个彼此独立浓度的MMA；和
图6显示高半胱氨酸、甲基丙二酸和丁二酸的完全基线HILIC分离的色谱图，分别采用UV(a)检测和MS(b)检测。这些实验所使用的实验条件与用于优化的MMA定量分析的那些不同，并且例示了获得在临床样品中定量或定性测定甲基丙二酸与高半胱氨酸和丁二酸的可能性。
发明详述
本发明提供对反相HPLC方法和公知的标准-HPLC和质谱的联用的可行替代方案，即亲水性相互作用液相色谱(HILIC)与质谱检测联用。HILIC是适用于极性和亲水化合物的分离技术，并且采用包含高含量的(40-99％ v/v)水混溶性有机溶剂(乙腈、丙醇、乙醇、甲醇、THF、丙酮)的洗脱液以提高分析物和亲水固定相间的亲水性相互作用。通常发现HILIC所使用的流动相良好地适用于ESI-MS检测(Guo Y.，Gaiki S.，J.Chromatogr.A，1074，71-80，2005)，而且与反相方法相比，常常改进检测极限，尤其是当分析亲水化合物时和当最终流动相缓冲盐浓度可保持在合理的浓度水平，通常低于50mM时更是如此(Bengtsson J.，Jansson B.，Hammarlund-Udenaes M.，RapidCommun.Mass Spectrom.，第19卷(2005)，2116-2122)。尽管有其它市售HILIC固定相，但都不能真正媲美WO00/27496 A1和US2005/0064192 A1所公开的固定相。这种固定相以注册商标ZIC
Figure G2008800059686D00061
HILIC和ZIC
Figure G2008800059686D00062
-pHILIC相出售(SeQuant AB，瑞典)。包含这些高极性两性离子固定相的色谱柱提供可显著溶剂化极性和荷电化合物的独特环境，所述色谱柱使得高效HILIC分离成为可能。所述两性离子固定相(图2)可通过弱静电相互作用与荷电分析物相互作用，在实践中，这在方法开发中选择缓冲盐和离子强度时为色谱法提供更高的自由度，因此使所述色谱柱成为用于LC-MS分析的理想选择。本专利申请显示了当将有效的分离和灵敏的检测方法联用时的优势，并通过可从临床样品中的丁二酸和高半胱氨酸中分辨出甲基丙二酸的等度HILIC分离作为例示。
ZIC-HILIC柱(SeQuant AB，瑞典)为粒度为3.5、5或10μm的硅胶基固定相，而ZIC
Figure G2008800059686D00072
-pHILIC柱(SeQuant AB，瑞典)是粒度为5μm的聚合物基固定相，但是均具有磺基甜菜碱型两性离子功能团。
实施例1
实验部分
试剂和药品
乙腈(HPLC纯)和分析纯的乙酸铵均购自默克(Darmstadt，德国)，而甲酸(％，p.a.)购自JT BAKER(Deventer，荷兰)。所有的水均经Milli-Q水纯化系统(Millipore，Bedford，MA)纯化。血浆蛋白质沉淀(PPT)溶液通过如下方法制备：加入25mL乙腈，随后加入250mL浓乙酸和43mL 196.5mmol氘代甲基丙二酸(d3-MMA)储备液至50mL容量瓶，再加入乙腈至刻度线。该PPT溶液包含99.5％体积乙腈、0.5％体积乙酸和169nM浓度的d3-MMA。
蛋白质沉淀和血浆样品净化
使用HILIC技术可实施非常有效且直接的临床样品的样品预处理。由于乙腈在HILIC中是弱溶剂，可在乙腈中沉淀干扰血浆蛋白质。首先将PPT溶液(0.80mL)移液至2mL玻璃自动进样瓶，然后加入人血浆(0.20mL)并用惰性瓶帽封盖样品瓶。然后，将所有样品置于定轨摇床上(Janke&Kunkel，Typ Vx8)(或具有类似功能的其它装置)5分钟以达到充分的混合。在血浆蛋白质沉淀步骤之后、将样品瓶转移至Hettich Zentrifugen Rotana 460R离心机(或具有类似功能的其它装置)，15℃下以6200rpm离心10分钟，随后进行分析。为测定分析回收率，在蛋白质沉淀之前和之后加入已知量的MMA和MMA-d3。
色谱系统
色谱系统包含安捷仑1100(Agilent 1100)分离模块，所述模块以0.4mL/min的流速输送包含乙腈和pH 4.7的100mM乙酸铵水缓冲液(80∶20 v/v)的流动相。使用安捷仑1100自动进样器将标准品、经掺杂的样品、对照品和人类患者样品(4μL)进样至长100mm、内径2.1mm的具有3.5μM颗粒的ZIC
Figure G2008800059686D00081
-HILIC分离柱，该柱置于设置在30℃的安捷仑1100柱箱中。如下进行定量分析：在安捷仑1100质谱上，使用负离子模式ESI的单离子监测(m/z 117.2和120.2)，并施加设置为10L/min的干燥气流，气体温度：300℃，并将毛细管电压设置为3.0KV。所有色谱图均记录于安捷仑Chemstation工作站。在以两性离子固定相上的HILIC模式分离后，使用负离子ESI MS检测定量分析人血浆样品中的甲基丙二酸(MMA)
使用标准溶液、经掺杂的血浆样品以及人类患者样品，获得针对MMA的重复性、重现性、精确、线性、LOD等分析数据，这些工作全部在它处写明。针对采用同位素标记内标的生物样品，开发了用于样品后处理，随后进行负离子ESI-MS单离子监测的的简单、耐用(rugged)且有效的定量分析方法。以当前的系统设置获得了优异的灵敏度和充分的线性(r2＞0.998)，并且其中，MMA的LOQ约为10nM且标准溶液的LOD小于5nM。由于MMA的内源性水平在140-500nM之间，我们所提出的经过稀释/蛋白质沉淀的取样步骤将稀释样品4次，以达到目标水平。
结果：
图3a-c显示了表明将MMA从分别掺入了a)50、b)476和c)1000nM MMA的人血浆样品中分离的色谱图。所有的样品中均添加了氘标记的内标(MMA-d3)，参见图3a-c中下方的色谱图。在具有3.5μM颗粒的100×2.1mm ZIC-HILIC柱上进行所有的分离，在安捷仑1100质谱仪中，使用负离子模式ESI的单离子监测(m/z 117.2和120.2)，进行检测。
图4显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所述人血浆样品中掺入了50-1000nM中6个彼此独立浓度的MMA。向所有样品添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间的面积响应比。
图5显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所述人血浆样品中掺入了50-200,000nM中13个彼此独立浓度的MMA。向所有样品添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间的面积响应比。
实施例2
实验条件
色谱柱：    ZIC
Figure G2008800059686D00091
-HILIC 50x 4.6mm，5μm
UV
柱温：      RT
流动相：    乙腈/乙酸铵(pH 6.8，最终溶液中为30
            mM)；70/30(v/v)
流速：      1.5mL/min
检测器：    波长为206nm(UFS 1.0V)的UV
进样量：    5μL流动相中的测试溶液
MS
柱温：      30℃
流动相：    乙腈/乙酸铵(pH 6.8，最终溶液中为25
            mM)；75/25(v/v)
流速：      1.0mL/min
分流：      100μL/min至MS
检测器：    Agilent 1100台式MS，正离子模式ESI
毛细管电压：3000V
碎裂电压    150V
(Fragmentor)：
质量范围：  50-200m/z
进样量：    5μL 0.1mg/mL流动相溶液中的各化合
            物
样品：      以洗脱顺序将高半胱氨酸、甲基丙二酸
            和丁二酸溶解于流动相。
方法开发通常使用UV检测器进行，因为它易于使用且耐用，但是该方法常常缺乏允许在相关生理水平进行定量分析所需的灵敏度。此处，显示出暂时的最佳分离条件可通过UV检测建立，图6(a)，然后简单地转化并轻微地修改以更好的适用于MS检测而获得灵敏度。对所有化合物的基线分离可在90秒内完成，并且化合物以介于1.4和3之间的k’流出。值得注意的是高半胱氨酸和甲基丙二酸之间的基线下降。产生该现象的主要原因是低检测波长与样品和流动相之间细微的缓冲液浓度不匹配的组合所致。通过降低流速和流动相中水的比例(从30％体积降低至25％体积)并且稍微地减小离子强度，使所述方法适应LC-MS仪器并获得充分的分离效率，如图6(b)所示。使用暂时的MS兼容条件，可测定生物样品中的甲基丙二酸以及高半胱氨酸和丁二酸，但它们不为临床相关浓度水平。因此，图6显示了对高半胱氨酸、甲基丙二酸和丁二酸分离，随后分别通过UV(a)和MS(b)检测。然而，在这些实验中所使用的实验条件与用于最佳的MMA定量的那些不同。
ZIC
Figure G2008800059686D00101
-HILIC柱的确是分离甲基丙二酸和丁二酸的合适工具。与相对便宜且简单的MS检测设备组合，可容易地以多达每小时20个样品的处理能力对生物相关浓度进行定量分析。

Claims (9)

1.用于在还可包含丁二酸和/或高半胱氨酸的临床样品中定性和/或定量检测甲基丙二酸的方法，所述方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包括如下步骤：
a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的样品；
b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；
c)将包含所述样品的所述流动相从液相色谱柱洗脱，所述色谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；
d)通过质谱检测在所述样品中检测可能存在的甲基丙二酸和丁二酸以及任选的高半胱氨酸；以及
e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机分子的量。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述水混溶性有机溶剂为乙腈或任选选自以下的水溶性溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮和THF或其混合物。
3.权利要求2的方法，其特征在于，所述流动相为乙腈和水缓冲溶液的混合物，所述水缓冲溶液具有微酸性至微碱性的pH，优选为4.0-7.5，更优选为4.0-7.0，尤其为4.0-5.0，并且所述流动相的总离子强度为5-60mM。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述水缓冲溶液是选自乙酸铵、甲酸铵、甲酸、乙酸、氨水和碳酸铵的水溶液。
5.权利要求3或4的方法，其特征在于，所述流动相的组成为95/5-60/40，优选85/15-65/35，最优选80/20-65/35的乙腈/盐的水溶液。
6.权利要求1的方法，其特征在于，所述固定相的两性离子基团为CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2-CH2-SO3 -或-O-PO- 3-CH2-CH2-N+(CH2)3，优选CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2-CH2-SO3 -。
7.权利要求6的方法，其特征在于，所述两性离子基团键合至硅胶颗粒、或聚合物颗粒、或硅胶或聚合物的整体柱结构(monolithicstructure)。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所述颗粒的粒度为1-30μm，优选3.5-10μm。
9.权利要求1的方法，其特征在于，所述样品为诸如血浆、全血、血清、尿和脑脊液的临床样品，并且将所述样品与乙腈混合从而沉淀所述样品中的蛋白质，将所述沉淀的蛋白质从所述样品除去，不经任何进一步的预处理而将除去所述沉淀的蛋白质后剩下的上清液直接注射进样至流动相。
CN200880005968A 2007-02-23 2008-02-25 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测 Pending CN101680904A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07003771.8 2007-02-23
EP07003771A EP1962097A1 (en) 2007-02-23 2007-02-23 Mass spectrometric quantitative detection of methyl malonic acid and succinic acid using hilic on a zwitterionic stationary phase
PCT/EP2008/001484 WO2008101736A1 (en) 2007-02-23 2008-02-25 Mass spectrometric quantitative detection of methyl malonic acid and succinic acid using hilic on a zwitterionic stationary phase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101680904A true CN101680904A (zh) 2010-03-24

Family

ID=38069225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880005968A Pending CN101680904A (zh) 2007-02-23 2008-02-25 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100320373A1 (zh)
EP (1) EP1962097A1 (zh)
JP (1) JP2010519532A (zh)
CN (1) CN101680904A (zh)
WO (1) WO2008101736A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539595A (zh) * 2010-12-09 2012-07-04 北京国立柏林医学科技发展有限公司 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
CN104380098A (zh) * 2012-05-18 2015-02-25 Dh科技发展私人贸易有限公司 用于选择性检测生物学相关酸的方法
CN106568880A (zh) * 2016-10-11 2017-04-19 郭嘉亮 一种高效液相色谱‑串联质谱检测血浆甲基丙二酸的方法及试剂盒
CN112834682A (zh) * 2021-01-05 2021-05-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 检测血液中甲基丙二酸含量的方法
CN112955239A (zh) * 2018-07-27 2021-06-11 沃特世科技公司 用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法
CN113917018A (zh) * 2021-09-30 2022-01-11 上海中科新生命生物科技有限公司 一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂和方法
CN114749221A (zh) * 2022-03-25 2022-07-15 南方科技大学 一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010078455A (ja) * 2008-09-26 2010-04-08 Japan Science & Technology Agency プロテオミクス解析におけるペプチド分離・同定方法
JP2011017678A (ja) * 2009-07-10 2011-01-27 Japan Atomic Energy Agency 極性化合物分離用双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム及びその製造方法
JP5807229B2 (ja) * 2011-04-12 2015-11-10 学校法人中部大学 マイコトキシンのスクリーニング法
US20120318971A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Baylor Research Institute Analysis of total homocysteine and methylmalonic acid in plasma by lc-ms/ms from a plasma separator device (psd)
US9302203B2 (en) * 2012-07-20 2016-04-05 Mitsubishi Chemical Corporation Chromatographic separation material
EP2944955A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Benchmark for LC-MS systems
GB201417341D0 (en) * 2014-10-01 2014-11-12 Isis Innovation Chromatography
US10618920B2 (en) 2016-06-03 2020-04-14 Agilent Technologies, Inc. Functionalized particles having modified phases
BR112019027361A2 (pt) 2017-06-22 2020-07-07 Archer Daniels Midland Company método de separação de um ácido dicarboxílico de interesse de uma mistura que contém esse ácido dicarboxílico dentre outros ácidos carboxílicos
CN115436536B (zh) * 2022-09-02 2023-09-19 北京豪思生物科技股份有限公司 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9803838D0 (sv) * 1998-11-09 1998-11-09 Knut Irgum A chromatography method and a column material useful in said method
CA2343985C (en) * 2000-04-17 2011-01-11 Mark Kushnir Method of analyzing dicarboxylic acids
US6541263B2 (en) * 2001-02-21 2003-04-01 Euro-Celtique, S.A. Luxembourg Determination of corticosteroids in human plasma using micromass LC/MS/MS
WO2003079008A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 University Of Utah Methods for quantitative analysis by tandem mass spectrometry
ITRM20050085A1 (it) * 2005-02-28 2006-09-01 Angela Maria Amorini Metodo per la determinazione simultanea di derivati delle purine e pirimidine, degli amminoacidi n-acetilati e degli acidi dicarbossilici in un campione biologico mediante cromatografia liquida ad elevate prestazioni (hplc) e relativo kit.

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539595A (zh) * 2010-12-09 2012-07-04 北京国立柏林医学科技发展有限公司 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
CN102539595B (zh) * 2010-12-09 2014-09-03 北京国立柏林医学科技发展有限公司 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
CN104380098A (zh) * 2012-05-18 2015-02-25 Dh科技发展私人贸易有限公司 用于选择性检测生物学相关酸的方法
CN104380098B (zh) * 2012-05-18 2018-03-27 Dh科技发展私人贸易有限公司 用于选择性检测生物学相关酸的方法
CN106568880A (zh) * 2016-10-11 2017-04-19 郭嘉亮 一种高效液相色谱‑串联质谱检测血浆甲基丙二酸的方法及试剂盒
CN112955239A (zh) * 2018-07-27 2021-06-11 沃特世科技公司 用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法
CN112955239B (zh) * 2018-07-27 2022-11-29 沃特世科技公司 用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法
CN112834682A (zh) * 2021-01-05 2021-05-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 检测血液中甲基丙二酸含量的方法
CN112834682B (zh) * 2021-01-05 2023-09-22 北京和合医学诊断技术股份有限公司 检测血液中甲基丙二酸含量的方法
CN113917018A (zh) * 2021-09-30 2022-01-11 上海中科新生命生物科技有限公司 一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂和方法
CN113917018B (zh) * 2021-09-30 2023-07-25 上海中科新生命生物科技有限公司 一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂和方法
CN114749221A (zh) * 2022-03-25 2022-07-15 南方科技大学 一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20100320373A1 (en) 2010-12-23
EP1962097A1 (en) 2008-08-27
WO2008101736A1 (en) 2008-08-28
JP2010519532A (ja) 2010-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101680904A (zh) 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
Chang et al. Historical review of sample preparation for chromatographic bioanalysis: pros and cons
Chocholouš et al. An overview of sequential injection chromatography
Hansen et al. Bioanalysis of pharmaceuticals: sample preparation, separation techniques and mass spectrometry
US20130102478A1 (en) Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample
Liu et al. Global characterization of neutral saccharides in crude and processed Radix Rehmanniae by hydrophilic interaction liquid chromatography tandem electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry
Liu et al. Development of a UHPLC–MS/MS method for the determination of plasma histamine in various mammalian species
Kondeti et al. Advancements in column chromatography: A review
Zhang et al. Bioanalytical methods for the determination of antipsychotic drugs
Projean et al. Rapid and simple method to determine morphine and its metabolites in rat plasma by liquid chromatography–mass spectrometry
Theodoridis et al. Automated sample treatment by flow techniques prior to liquid-phase separations
Pittertschatscher et al. Quantification of histamine in blood plasma and cell culture supernatants: a validated one-step gas chromatography–mass spectrometry method
Wang et al. Development of sampling, pretreatment and detection methods for ephedrine and related substances in complex samples
Taleuzzaman et al. Particle size role, Importance and Strategy of HPLC Analysis-An update
Goswami Different separation or experimental techniques for clinical chromatography: Small review
Desai et al. High Performance Liquid Chromatography-A Validation View
Tiwari et al. HPLC: a modern approach of development and validation
John Liquid chromatography–mass spectrometry in peptide drug discovery and development
de Gaitani et al. Capillary electromigration techniques for the analysis of drugs and metabolites in biological matrices: a critical appraisal
EP1048950A1 (en) Identification of ligands for orphan receptors using on-line coupling of mass spectrometry to continuous-flow separation techniques
CN103512991A (zh) 尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法
Mujewar et al. A Review on Bioanalytical Method Development and Various Validation Stages Involved In Method Development Using RP-HPLC
Yandamuri et al. Advanced Study of Nano Liquid Chromatography and Its Application-A Review
Shah et al. A REVIEW ON LCMS TECHNIQUE AND IT'S APPLICATION
Chan et al. Frontal affinity chromatography–mass spectrometry for ligand discovery and characterization

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100324