CN103512991A

CN103512991A - 尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法

Info

Publication number: CN103512991A
Application number: CN201310430789.XA
Authority: CN
Inventors: 王冰; 王昇; 赵阁; 余晶晶; 谢复炜; 蔡君兰; 张晓兵; 刘惠民
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2013-09-22
Filing date: 2013-09-22
Publication date: 2014-01-15

Abstract

一种尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，是对N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）的HPLC-MS/MS的测定分析方法，其特征在于：尿样解冻后加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择，六通阀转换时间的确定及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测。通过本发明的在线分析方法，样品不用经任何前处理，操作简单，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。

Description

尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法

技术领域

本发明属于液相色谱-质谱分析技术的领域,具体涉及一种丙烯酰胺巯基尿酸代谢物即N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）的自动在线分析方法。

背景技术

2001年，周元陵在《生物标志物巯基尿酸的研究进展》中指出由于巯基尿酸是外源性亲电子化合物与GSH结合后代谢的终产物，所以，它能反映这些化合物的原型、中间产物以及它们与GSH 结合的机制和在生物体内的代谢状况。

，丙烯酰胺巯基尿酸代谢物N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）含量水平反映了人体对丙烯酰胺的吸收情况，是评价丙烯酰胺暴露水平特异而敏感的生物标记物。

由于GAMA含量较低,为了实现AAMA、GAMA的同时测定，文献中报道方法常需要对尿样进行复杂的富集净化。如2005年，Melanie Isabell Boettcher，2007年，Thomas Bjellaas均采用固相萃取，浓缩富集样品，然后利用LC-MS-MS对尿液中AAMA、GAMA进行测定，前处理过程较为复杂。采用柱转换在线预处理技术能实现生物样品在线富集净化，免去了其它前处理方法中繁琐的操作，已成功应用于体外DNA加合物、尿液中核苷的在线预处理。

发明内容

本发明的目的即建立简单、灵敏、准确的丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA分析方法。本发明以Agilent 6490质谱仪（美国Agilent公司）； Agilent 1200高效液相色谱系统（包括2个二元液相泵，美国Agilent公司）；六通阀；富集柱；分析柱构建了自动在线分析尿液中AAMA、GAMA系统。样品经离心后，无需经过任何净化，可直接进系统分析。实现了样品在线富集净化分析的全自动过程。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，是将尿样解冻后加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对对丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA进行检测，具体测定步骤如下：

a. 标准溶液的配制和标准曲线的制作：分别称取GAMA 1mg、AAMA 10mg于两个10ml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml,得到GAMA及AAMA母液。取GAMA、AAMA母液各1ml于同一个100ml容量瓶中，以甲醇定容，得到标准品储备液。分别称取GAMA-d₃ 1mg、AAMA-d₄10mg,于两个10ml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml,得到GAMA-d₃及AAMA-d₄母液。取GAMA-d₃、AAMA-d₄母液各200μL于同一个10ml容量瓶中，以甲醇定容，得到内标溶液。分别取储备液10、20、50、100、200、500、1000μL于七个10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入内标溶液100μL，以甲醇分别定容至10mL，得到7个系列标准溶液。利用高效液相色谱串联质谱仪分别测定上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程。

b.样品制备：取1ml解冻后的待测测尿样，加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标溶液10μL，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比及标准工作曲线的回归方程，计算出样品中GAMA及AAMA含量。

c. 液相色谱及质谱条件：采用Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈（30 mm × 2.1 mm i.d., 3.5 μm）为富集柱，Waters Xbridge-C₈（150 mm ×4.6 mm i.d., 5μm）为分析柱的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1。流动相A、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液。

表1 自动分析系统液相条件

Figure 201310430789X100002DEST_PATH_IMAGE001

液相色谱仪中六通阀转换时间：

上样0.3分钟后，尿样中AAMA、GAMA完全富集在富集柱上，富集过程完成，六通阀第一次转换（六通阀由图1中位置A转换至位置B），开始将目标物冲淋至分析柱；自上样0.75分钟后，目标物完全进入分析柱，六通阀第二次转换（六通阀由（B）切换到（A）），目标物在分析柱上进行分离，而富集柱进入净化柱子，平衡系统过程；

经优化，测定样品时质谱条件为：

离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：290℃，流量：11L/min; 雾化气压力：30 psi；鞘气温度：400℃，流量：12L/min；毛细管电压：3500 V； AAMA、GAMA及相应内标定量离子对、驻留时间、碰撞能量见表2。

表2 自动分析质谱条件

	定量离子对	驻留时间ms	碰撞能v
				GAMA	249/120	100	-19
GAMA-d3	252/120	100	-19
				AAMA	233/104	100	-18
AAMA-d4	237/108	100	-18

在本发明的上述条件中，采用Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈（30 mm × 2.1 mm i.d., 3.5 μm）为富集柱，Waters Xbridge-C₈（150 mm ×4.6 mm i.d., 5μm）为分析柱的柱子配套系统是本方法的关键。Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈柱子为富集柱，其反相颗粒内嵌极性集团，适用于高比例水溶液反相条件，可将尿液中AAMA、GAMA完全保留；Waters Xbridge-C₈为分析柱，由于其填料采用杂化颗粒技术，使其具有特别高的柱效，在5分钟内，可将AAMA、GAMA与基质干扰物完全分离；采用该柱系统，可实现GAMA与AAMA在线自动富集分离，达到令人满意的灵敏度及分离度。尿样经解冻后，不需要进行其他前处理工作，可直接进行LC-MS/MS分析，利用本发明方法对尿样中GAMA及AAMA进行测定，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。

本发明建立了自动分析尿样中AAMA、GAMA的分析方法，经方法表征，该方法有较好的准确度和精密度，可用于样品的分析。

附图说明

图1:两个双元液相泵、六通阀、富集柱、分析柱组成的自动在线分析装置原理示意图，A为上样富集过程，B为洗脱分析过程；

其中：1-1为第一液相泵；1-2为第二液相泵；2-1为富集柱；2-2为分析柱，3为六通阀。

图2：尿样中AAMA、GAMA离子对色谱图。

具体实施方式

以下对应用本发明对尿样中GAMA及AAMA进行液质分析做进一步的说明：

仪器和试剂

仪器：Agilent 6490质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（包括2个二元液相泵，内置六通阀，美国Agilent公司）；Milli-Q50超纯水仪（美国MILLIPORE公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP2245电子天平（感量0.0001g，德国Sartorius公司）。

标准品:AAMA、GAMA、AAMA–d₄、GAMA-d₃（纯度均≥98%，上海安谱公司）。

试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，美国Dikma公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia 公司）。

标准溶液的配制和标准曲线的制作：

分别称取GAMA 1mg、AAMA 10mg于两个10ml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml,得到GAMA及AAMA母液。取GAMA、AAMA母液各1ml于同一个100ml容量瓶中，以甲醇定容，得到标准品储备液。分别称取GAMA-d₃ 1mg、AAMA-d₄10mg,于两个10ml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml,得到GAMA-d₃及AAMA-d₄母液。取GAMA-d₃、AAMA-d₄母液各200μL于同一个10ml容量瓶中，以甲醇定容，得到内标溶液。分别取储备液10、20、50、100、200、500、1000μL于七个10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入内标溶液100μL，以甲醇分别定容至10mL，得到7个系列标准溶液。利用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程；AAMA标准曲线方程为y=0.00688x+0.182，r=1,GAMA标准曲线方程为y=0.0208x+0.0782,r=0.9999。

样品前处理

取1ml解冻后的待测测尿样，加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标溶液10μL，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪采用与前面标准溶液测定时相同的条件分别对样品溶液进行检测。

液相色谱和质谱条件

采用Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈（30 mm × 2.1 mm i.d., 3.5 μm）为富集柱，Waters Xbridge-C₈（150 mm ×4.6 mm i.d., 5μm）为分析柱的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1。流动相A、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液。

上样0.3分钟后，六通阀由图1中位置A转换至位置B，此时尿样中AAMA、GAMA完全富集在富集柱上，富集过程完成，开始将其冲淋至分析柱；当目标物进入分析柱后，六通阀由（B）切换到（A），进入净化柱子，平衡系统过程，实验中选0.75min时进行切换。

经优化，测定样品时质谱条件为：

方法的精密度和准确度

选取吸烟者尿样，平行测定5次，并在高、中、低3个水平上进行加标回收率测定。AAMA含量相对标准偏差为2.74%，GAMA为5.41%，AAMA加标回收率范围在100.6%~105.1%，GAMA为99.6%~105.3%。实验数据表明，该方法重复性好，准确度高，可以进行尿液中AAMA、GAMA的定量分析检测。

表3：方法精密度

表4：方法准确度

实施示例

采用具体实施方式中进一步说明的方法对10个尿样进行检测。检测的条件和具体实施方式中相同。检测得到的色谱-质谱图如图2所示,具体检测结果见表5。

表5：10个尿样中AAMA及GAMA含量检测结果

Claims

1.一种尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，是对N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）的HPLC-MS/MS的测定分析方法，其特征在于：尿样解冻后加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA进行检测，具体测定步骤如下：

a. 标准溶液的配制和标准曲线的制作：分别称取GAMA、AAMA标准品，配制含有内标的7个系列标准溶液；利用高效液相色谱串联质谱仪分别测定上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程；

b.样品制备：取1ml解冻后的待测测尿样，加入GAMA-d₃、AAMA-d₄内标溶液10μL，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比及标准工作曲线的回归方程，计算出样品中GAMA及AAMA含量；

c. 液相色谱及质谱条件：采用富集柱、分析柱组成的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1：流动相A、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液，

表1 自动分析系统液相条件

Figure 201310430789X100001DEST_PATH_IMAGE001

液相色谱仪中六通阀转换时间：

上样0.3分钟后，尿样中AAMA、GAMA完全富集在富集柱上，富集过程完成，六通阀第一次转换，开始将目标物冲淋至分析柱；自上样0.75分钟后，目标物完全进入分析柱，六通阀第二次转换，目标物在分析柱上进行分离，而富集柱进入净化柱子，平衡系统过程；

测定样品时质谱条件为：

离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：290℃，流量：11L/min; 雾化气压力：30 psi；鞘气温度：400℃，流量：12L/min；毛细管电压：3500 V； AAMA、GAMA及相应内标定量离子对、驻留时间、碰撞能量见表2：

表2 自动分析质谱条件

定量离子对驻留时间ms 碰撞能v GAMA 249/120 100 -19 GAMA-d3 252/120 100 -19 AAMA 233/104 100 -18 AAMA-d4 237/108 100 -18

。

2.根据权利要求1所述的尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，其特征在于：标准溶液的具体配制方法如下：分别称取GAMA、AAMA一定量于两个10ml容量瓶中，得到GAMA及AAMA母液；取GAMA、AAMA母液各一定量于同一个100ml容量瓶中，以甲醇定容，得到标准品储备液；分别称取GAMA-d₃、AAMA-d₄一定量于两个10ml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml,得到GAMA-d₃及AAMA-d₄母液；取GAMA-d₃、AAMA-d₄母液各一定量于同一个10ml容量瓶中，以甲醇定容，得到内标溶液；分别取标准品储备液10、20、50、100、200、500、1000μL于七个10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入内标溶液100μL，以甲醇分别定容至10mL，得到7个系列标准溶液。

3.根据权利要求1所述的尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，其特征在于：所述富集柱为Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈规格30 mm × 2.1 mm i.d., 3.5 μm，分析柱为Waters Xbridge-C₈规格150 mm ×4.6 mm i.d., 5μm。