CN104764826A - 一种测定尿液中可替宁含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种测定尿液中可替宁含量的方法,包括以下步骤:移取尿液于离心管,加入氘代内标,用乙腈稀释;将离心管置于涡旋振荡仪,涡旋振荡,静置;吸取上清液经有机相滤膜过滤,滤液待测;配制储备液和工作液,采用超高效液相色谱-串联质谱测定。与传统的气相色谱-质谱法比较,本发明采用乙腈直接稀释,涡旋振荡过滤进样的方式,简化了前处理过程,提高了分析灵敏度。本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于尿液代谢物检验技术领域,涉及一种尿液中可替宁的测定方法。
背景技术
烟碱,俗称尼古丁,是烟草的重要成分,占烟草中总生物碱的98%。烟碱是吸烟成瘾或烟草依赖的主要因素。进入人体内的尼古丁约80%在肝脏中的细胞色素酶P4502A6的作用下代谢为可替宁。可替宁随血液进入到人体各个部位,在血液、尿液、唾液等体液和肝脏及脑等器官中均发现可替宁的分布。可替宁在体内的半减期为18-22h,且由于尼古丁是可替宁的唯一来源,因此是目前公认的评价卷烟烟气暴露的特异性生物标志物。
由于尿液具有易采集,非创伤性等特点,是生物暴露风险评估中应用最为广泛的生物基质。尿液中可替宁的测定方法主要有:酶联免疫法、毛细管电泳化学发光法、气相色谱质谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)。LC-MS/MS具有灵敏度高,选择性强等特点,前期建立的LC-MS/MS法需要液液萃取或固相萃取净化尿液样本。Fan等建立了一个直接稀释过滤进样分析尿液中可替宁的LC-MS/MS方法,此方法简化了前处理过程,选取了一根常规的液相色谱柱(柱径:4.6mm,粒径:5μm),但其分离的效果不如小粒径、窄内径的UPLC色谱柱。
发明内容
鉴于此,本发明目的在于提供一种操作简便、快速、准确、灵敏度高的尿液中可替宁含量的测定方法。
为解决以上技术问题,本发明提供的技术方案是,提供一种测定尿液中可替宁含量的方法,包括以下步骤:
步骤a)
移取尿液于离心管,加入氘代内标,用乙腈稀释;
步骤b)
将离心管置于涡旋振荡仪,涡旋振荡,静置;吸取上清液经有机相滤膜过滤,滤液待测;步骤c)
用甲醇配置可替宁标准储备液,低温避光保存;取一定量的储备液,用甲醇稀释定容,制得可替宁工作液;
用甲醇准确配置可替宁-d3内标储备液,用内标储备液配制内标工作液,低温避光保存,使用前将其恢复到室温;
用乙腈配制不同浓度的可替宁标准工作溶液;
步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定
吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液,注入UPLC-MS/MS系统,按内标法以峰面积计算出样品待测液中可替宁含量。
根据本发明的一个具体实施方式,步骤a)中,内标浓度为10μg/mL,加入尿液样品、内标、乙腈的体积依次为100μL,30μL和870μL。
根据本发明的一个具体实施方式,步骤b)中,涡旋振荡2min,2400转/min。
根据本发明的一个具体实施方式,步骤c)中,所述低温避光保存为:选用棕色玻璃瓶作为容器,放入-20℃保存。
根据本发明的一个具体实施方式,所述步骤d)中测定尿液中可替宁含量的具体操作为:吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液,注入UPLC-MS/MS系统,绘制可替宁的线性回归方程,对纯化稀释后的样品待测液进行测定,测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品待测液中分析物的含量。
根据本发明的一个具体实施方式,所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中:
色谱条件:选用色谱柱Atiantis UPLC BEH Shield RPC18,规格为50mm×2.1mm,1.7μm;流动相A:体积分数为0.1%的甲酸水溶液,流动相B:0.1%甲酸甲醇溶液;流速0.8mL/min,柱温35℃,进样量5μL;梯度洗脱;
根据本发明的一个优选实施方式,所述梯度洗脱条件:0~1min,98%A~98%A;1.1~3.0min,2%A~2%A;3.01~4.0min,98%A~98%A。
根据本发明的一个具体实施方式,所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中:
质谱条件:电喷雾离子源,喷雾电压(IS)2.6kV;离子化温度350℃;雾化气流量1000L/Hr;锥孔气流量50L/Hr;碰撞气流量为0.15ml/min;碰撞气为氩气,其余气体为氮气;驻留时间为30msec,正离子MRM模式采集,选取m/z 177.2/98.0作为定量离子对,m/z177.2/80.1为确认离子对,m/z 180.2/80.1为对应的氘代内标离子对。
根据本发明的一个具体实施方式,所述尿液为冷冻保存尿液,测定前在室温下解冻。
与现有技术相比,上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点:
1、与传统的气相色谱-质谱法比较,本发明采用乙腈直接稀释,涡旋振荡过滤进样的方式,简化了前处理过程,提高了分析灵敏度。
2、由于选取了超高效液相色谱柱,使得柱子的分离度明显提高,分析时间显著缩短,提高检测通量。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高,更有利于非吸烟者或二手烟接触者尿液中低含量可替宁的测定。
3、选取了乙腈稀释与沉淀尿液中蛋白方法,氘代内标定量,有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差。
4、本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
附图说明
图1是本发明一较佳实施例的尿液样品中可替宁的选择离子流色谱图。
图2是本发明一较佳实施例的尿液样品中氘代可替宁的选择离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合一个具体实施例进行说明。
本实施例中尿液中可替宁含量的测定方法,依次采用乙腈稀释与沉淀蛋白,氘代内标定量,涡旋振荡净化,有机相滤膜过滤,超高效液相色谱-串联质谱仪测定,可快速、准确、同时检测出、尿液中可替宁的含量。
本实施例所用仪器和试剂为:
Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司),配备电喷雾电离源(ESI);VtexMixer 230VeU振荡器(美国Labnet公司)。
甲酸为HPLC级(浓度为49-51%,德国Sigma公司);乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Thermo-Fisher公司);可替宁,可替宁-d3(纯度:98%;同位素纯度:99%,Toronto ResearchChemicals Inc.)。
1、提取尿液中的分析物
取冷冻尿液样品,于室温下解冻,混合均匀后,取100μL的尿液并加入30μL的氘代内标,加入870μL乙腈,在2400转/分钟的条件下涡旋振荡2min。上清液过0.22μm有机相滤膜,取5μL滤液用于LC-MS/MS分离分析。
2、UPLC-MS/MS测定
(1)UPLC-MS/MS条件:
色谱条件:Atiantis UPLC BEH Shield RPC18(50mm×2.1mm,1.7um,美国Waters公司);流动相A:体积分数为0.1%的甲酸水溶液,流动相B:0.1%甲酸甲醇溶液;流速0.8mL/min,柱温35℃,进样量5μL。
梯度洗脱条件:0~1min,98%A~98%A;1.1~3.0min,2%A~2%A;3.01~4.0min,98%A~98%A。
质谱条件:电喷雾离子源,喷雾电压(IS):2.6kV;离子化温度350℃;雾化气流量:1000L/Hr;锥孔气(cone)流量50L/Hr;碰撞气流量为0.15ml/min;碰撞气为氩气,其余气体为氮气;驻留时间为30msec,正离子MRM模式采集,选取m/z 177.2/98.0作为定量离子对,m/z 177.2/80.1为确认离子对,m/z 180.2/80.1为对应的氘代内标离子对(可替宁-d3)。
(2)标准储备液的配制:
称取14.3mg可替宁标准品于10mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,得到1.43mg/mL的可替宁甲醇溶液。准确移取69μL上述储备液于10mL容量瓶,用甲醇定容,得10μg/mL的可替宁甲醇溶液。量取10μg/mL的可替宁1mL,用甲醇定容到10mL,得到1μg/mL的可替宁甲醇溶液。
称取10mg可替宁-d3标准品于10mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,得到1mg/mL的可替宁-d3甲醇溶液。准确移取10μL上述储备液于10mL容量瓶,用甲醇定容,得到1μg/mL的可替宁-d3甲醇溶液。
(3)可替宁含量的测定:
吸取配制好的不同浓度的可替宁的混合标准工作溶液各5μL,注入LC-MS/MS;可替宁的线性回归方程分别为y=0.0036x-0.0002,其中y代表分析物与内标峰面积的比值,x表示尿液中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本,求得实际样本中可替宁的含量。
(4)该方法的线性范围和检出限:
本实验空白尿液基质配制标准曲线,分别移取1μg/mL标准储备液0μL,1μL,2μL,5μL,20μL,50μL,100μL和500μL于8个1.8mL旋盖色谱瓶中,每个色谱瓶移入30μL氘代内标工作液(1μg/mL),用乙腈定容至1mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL,1ng/mL,2ng/mL,5ng/mL,20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL和500ng/mL。对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(y)和其浓度(x)进行线性回归分析,得到回归方程为,化合物线性关系良好(相关系数r2≥0.99),可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限为0.209ng/mL。
(5)本发明方法的重复性和加标回收率:
采用尿液基质加标准品的方法测方的回收率。选取一个非吸烟者尿液样本,在尿液样品中添加一定量的可替宁标准溶液,然后提取、测定,计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度,计算6次结果的平均值,低中高添加水平的回收率分别为94.3%,99.9%和95.1%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价,对同一样品平行测定6次,可替宁的RSD范围为1.0%~3.2%,结果见表1。
表1空白尿液中可替宁的回收率和精密度(n=6)
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤a)
移取尿液于离心管,加入氘代内标,用乙腈稀释;
步骤b)
将离心管置于涡旋振荡仪,涡旋振荡,静置;吸取上清液经有机相滤膜过滤,滤液待测;
步骤c)
用甲醇配置可替宁标准储备液,低温避光保存;取一定量的储备液,用甲醇稀释定容,制得可替宁工作液;
用甲醇准确配置可替宁-d3内标储备液,用内标储备液配制内标工作液,低温避光保存,使用前将其恢复到室温;
用乙腈配制不同浓度的可替宁标准工作溶液;
步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定
吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液,注入UPLC-MS/MS系统,按内标法以峰面积计算出样品待测液中可替宁含量。
2.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,步骤a)中,内标浓度为10μg/mL,加入尿液样品、内标、乙腈的体积依次为100μL,30μL和870μL。
3.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,步骤b)中,涡旋振荡2min,2400转/min。
4.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,步骤c)中,所述低温避光保存为:选用棕色玻璃瓶作为容器,放入-20℃保存。
5.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,所述步骤d)中测定尿液中可替宁含量的具体操作为:吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液,注入UPLC-MS/MS系统,绘制可替宁的线性回归方程,对纯化稀释后的样品待测液进行测定,测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品待测液中分析物的含量。
6.根据权利要求1或5所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中:
色谱条件:选用色谱柱Atiantis UPLC BEH Shield RPC18,规格为50mm×2.1mm,1.7μm;流动相A:体积分数为0.1%的甲酸水溶液,流动相B:0.1%甲酸甲醇溶液;流速0.8mL/min,柱温35℃,进样量5μL;梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,所述梯度洗脱条件:0~1min,98%A~98%A;1.1~3.0min,2%A~2%A;3.01~4.0min,98%A~98%A。
8.根据权利要求1或5所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中:
质谱条件:电喷雾离子源,喷雾电压(IS)2.6kV;离子化温度350℃;雾化气流量1000L/Hr;锥孔气流量50L/Hr;碰撞气流量为0.15ml/min;碰撞气为氩气,其余气体为氮气;驻留时间为30msec,正离子MRM模式采集,选取m/z 177.2/98.0作为定量离子对,m/z 177.2/80.1为确认离子对,m/z 180.2/80.1为对应的氘代内标离子对。
9.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法,其特征在于,所述尿液为冷冻保存尿液,测定前在室温下解冻。
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