CN105424832A - 一种lc-ms/ms检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，所述的代谢物为可替宁和3-羟基可替宁；利用LC-MS/MS分别检测标准品溶液和经过预处理的唾液样品，利用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出唾液中尼古丁及其代谢物的浓度。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内可完成分离和检测，精密度和稳定性满足要求，而且唾液样本采集方便且无创伤性，可用于评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴露程度研究。

Description

一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法
技术领域
本发明涉及一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
尼古丁是烟草中的重要成分，主动吸烟和被动吸烟都会对身体产生不利影响，如心血管疾病、慢性阻塞性肺病甚至癌症，吸烟上瘾已成为当今社会危害公众健康的一大突出现状。尼古丁在人体内的主要代谢物有可替宁和3-羟基可替宁等多种物质，其中可替宁就占所有代谢物的70％-80％。据报道，尼古丁及其代谢物在不同体液(血液、尿液和唾液)中的浓度水平与烟气暴露量密切相关，其含量水平可评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴露程度。因此，建立一种快速准确的方法同时检测尼古丁及其代谢物至关重要。
同样，标本的选择也很关键。目前已有方法用于血浆、尿液、唾液等样本的尼古丁代谢物的分析。尿液的采集较血液无创伤性，且尿液中的可替宁比血液中的含量高，但是尿样会受尿量的影响造成测定误差。研究数据显示，唾液可替宁和血液可替宁的相关性很高。因此，选择唾液标本作为尼古丁代谢物的测定是最简单可行的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其中，所述的代谢物为可替宁和3-羟基可替宁；
利用LC-MS/MS分别检测标准品溶液和经过预处理的唾液样品，利用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出唾液中尼古丁及其代谢物的浓度，具体色谱条件为：
(1)色谱条件：
流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；
流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；
色谱柱型号：UltimateSiO2，2.1×100mm，3μm；
流速为0.2mL/min；
柱温为35℃；
进样体积为10μL；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为Medium；气帘气为40kPa；离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa；去溶剂温度为550℃。
其中，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：
分别准确称取10.0mg尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁，分别加入1mL甲醇溶解，配制成浓度均为10.0mg/mL标准品母液；分别从以上标准品母液中移取100μL用甲醇定容至1mL，稀释到浓度为1.0mg/mL，然后再用甲醇将这3种标准品的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至10μg/mL；接着分别取1mL浓度为10μg/mL的尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，得到尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为1.0μg/mL的混合标准液A；
准确称取10.0mg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液；然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，得到内标液B；
移取100μL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100μL空白唾液基质作为第一个高值浓度点；移取20μL混合标准液A用空白唾液基质定容至200μL得到第二个浓度点；接着，移取10μL混合标准液A用空白唾液基质定容至500μL，取200μL作为第三个浓度点；分别取50、25、5μL的第三个浓度点分别定容至200μL，得到其它3个校准浓度点，这六个浓度点体积均为200μL；接着向其中各加入10μL1μg/mL同位素内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后即得标准品溶液。
其中，所述的空白唾液基质为非吸烟者(指非主动吸烟者且非被动吸烟者)的唾液基质。
其中，所述的唾液样品按如下方法预处理得到：取200μL唾液于1.5mL离心管中，向其中加入10μL1μg/mL内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后即得唾液样品。
其中，所述的内标液B按如下方法制备得到：准确称取10.0mg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液；然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，得到内标液B。
有益效果：本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内可完成分离和检测，精密度和稳定性满足要求，而且唾液样本采集方便且无创伤性，可用于评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴露程度研究。
附图说明
图1.尼古丁及其代谢物标准品的选择离子流图。
图2.非吸烟者空白唾液中尼古丁及其代谢物的选择离子流图。
图3.吸烟者唾液中尼古丁及其代谢物的选择离子流图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1.材料
方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所员工的唾液样本。
(1)仪器：API4000+三重四级杆质谱仪(ABSCIEX公司)；ekspert’ultraLC100液相色谱系统(配自动进样器)；医用高速冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；超纯水仪(成都优普超纯科技有限公司)；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；快速混匀器(姜堰市康泰医疗器材厂)；可调移液器(ThermoScientific0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
(2)试剂耗材：色谱纯甲醇、乙腈(TediaHighPuritySolventCompany.Inc)；上海月旭科技色谱柱UltimateSiO2(2.1×100mm，3μm)；1.5mL离心管(AXYGEN，美国)。
(3)标准品：尼古丁、可替宁、3-羟基可替宁和稳定同位素内标可替宁-d3购自于加拿大TorontoResearchChemicalInc.公司，纯度均≥98％。
(4)质控品：含有尼古丁、可替宁、3-羟基可替宁的空白唾液基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表2所示。
表2尼古丁及其代谢物质控品对应浓度(单位ng/mL)
2.方法
(1)色谱条件：流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液。色谱柱型号：UltimateSiO2(2.1×100mm，3μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.2mL/min，柱温为35℃，进样体积为10μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)的质谱扫描模式。喷雾电压(ionspray,IS)为5500V；碰撞气(collisiongas,CAD)为Medium；气帘气(curtaingas,CUR)为40kPa；离子源雾化气(ionsourceGS1,GS1)和加热辅助气(GS2)均为60kPa；去溶剂温度为550℃。
(3)标准品配制：
分别准确称取10.0mg尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁，分别加入1mL甲醇溶解，配制成浓度均为10.0mg/mL标准品母液；分别从以上标准品母液中移取100μL用甲醇定容至1mL，稀释到浓度为1.0mg/mL，然后再用甲醇将这3种标准品的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至10μg/mL；接着分别取1mL浓度为10μg/mL的尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，得到尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为1.0μg/mL，配制成混合标准液A。
准确称取10.0mg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液。然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，得到内标液B。
(4)质控品的配制：取混合标准液A20μL、100μL、500μL分别用非吸烟志愿者的空白唾液定容至10mL得到。
(5)样品处理
1)标准品的制备及前处理：移取100μL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100μL空白唾液基质作为第一个高值浓度点；移取20μL混合标准液A用空白唾液基质定容至200μL得到第二个浓度点；接着，移取10μL混合标准液A用空白唾液基质定容至500μL，取200μL作为第三个浓度点；分别取50、25、5μL的第三个浓度点分别定容至200μL，得到其它3个校准浓度点，这六个浓度点体积均为200μL。接着向其中各加入10μL1μg/mL同位素内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。
2)唾液样品前处理：取200μL唾液于1.5mL离心管中，向其中加入10μL1μg/mL内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各200μL于1.5mL离心管中，然后跟唾液样品前处理方法一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表3。
表3尼古丁及其代谢物分析试剂盒组分的制备
注：本发明所述的非吸烟者唾液是非主动吸烟者且非被动吸烟者的唾液，该非吸烟者唾液未经前处理，购买试剂盒后可自行按照说明与待测唾液样本同步进行前处理。
3、方法的建立与优化
为了达到更高的稳定性和灵敏度，实验采用MRM模式同时监测尼古丁、可替宁、3-羟基可替宁以及d3-可替宁的离子对(Q1/Q3)，使用“Ramp”对不同离子对的去簇电压(declusteringpotential,DP)、碰撞电压(collisionenergy,CE)和碰撞池出口电压(collisioncellexitpotential,CXP)等条件进行了系统优化，从优化色谱图中即可得到离子最高信号强度所对应的最佳结果，记录优化结果见表4。此外，其它一些参数如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证稳定的信号强度。
表4尼古丁及其代谢物质谱参数优化结果
4、方法验证
a.选择离子流图：尼古丁及其代谢物的标准品和吸烟者唾液样品的选择离子流色谱图(XIC)如下图所示，图1中尼古丁、可替宁和3-OH可替宁的浓度均为5.0ng/mL，完全无杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。图2和图3分别为非吸烟者和吸烟者唾液中尼古丁、可替宁和3-OH可替宁的XIC谱图，由于吸烟者唾液复杂基质的干扰，使得谱图中的峰型对称性不佳，但不会影响LC-MS/MS的检测。
b.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出唾液中待测物的浓度。3种分析物在各自浓度范围内线性良好，相关系数在0.998以上，满足定量要求，见表5。同时，试剂盒也考察了这3种分析物在信噪比S/N≥10时的最低定量限(LLOQ)，可低至0.5ng/mL，完全可以满足吸烟者唾液样本中尼古丁及其代谢物的检测需求。
表5尼古丁及其代谢物线性系数和最低定量限
c.精密度试验：取正常人唾液样品一天内重复处理6次，以同位素内标法定量测定3种物质的浓度，得出批内精密度为5.0％～8.41％(见表6)；6个标本分3日按照相同的方法处理并测定，计算得到批间精密度为6.16％～10.65％(见表7)。
表6批内精密度试验结果
表7批间精密度试验结果
本试剂盒采用高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)可同时测定人体唾液尼古丁及其代谢物可替宁和3-羟基可替宁。目前，用于测定尼古丁及其代谢物的方法较多，如免疫法、比色法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法，大多用于研究尿液或血液中的尼古丁及其代谢物，而唾液检测相对较少，而且免疫法可能存在交叉反应的干扰。其中GC-MS准确性较高，但该方法基本都需要对样品进行衍生化处理，操作过于繁琐，而且灵敏度较低。而LC-MS/MS是同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，极大的避免了交叉反应的干扰。本试剂盒采用同位素内标法定量，选择氘代可替宁作为3种物质共用的内标，不但节省了成本，而且可减少基体的干扰，不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。而且灵敏度高，最低定量限可达到0.5ng/mL，完全可以满足吸烟者唾液样本中尼古丁及其代谢物的检测需求。
本试剂盒还考察了方法的精密度，日内精密度为5.0％～8.41％，日间精密度为6.16％～10.65％(可接受标准为CV≤15％)，因此该试剂盒稳定性良好。
总之，该试剂盒灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内可完成分离和检测，精密度和稳定性满足要求，而且唾液样本采集方便且无创伤性，可用于评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴露程度研究。

Claims (5)

1.一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其特征在于，
所述的代谢物为可替宁和3-羟基可替宁；
利用LC-MS/MS分别检测标准品溶液和经过预处理的唾液样品，利用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出唾液中尼古丁及其代谢物的浓度，具体色谱条件为：
(1)色谱条件：
流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；
流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；
色谱柱型号：UltimateSiO2，2.1×100mm，3μm；
流速为0.2mL/min；
柱温为35℃；
进样体积为10μL；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为Medium；气帘气为40kPa；离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa；去溶剂温度为550℃。
2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其特征在于，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：
分别准确称取10.0mg尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁，分别加入1mL甲醇溶解，配制成浓度均为10.0mg/mL标准品母液；分别从以上标准品母液中移取100μL用甲醇定容至1mL，稀释到浓度为1.0mg/mL，然后再用甲醇将这3种标准品的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至10μg/mL；接着分别取1mL浓度为10μg/mL的尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，得到尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为1.0μg/mL的混合标准液A；
准确称取10.0mg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液；然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，得到内标液B；
移取100μL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100μL空白唾液基质作为第一个高值浓度点；移取20μL混合标准液A用空白唾液基质定容至200μL得到第二个浓度点；接着，移取10μL混合标准液A用空白唾液基质定容至500μL，取200μL作为第三个浓度点；分别取50、25、5μL的第三个浓度点分别定容至200μL，得到其它3个校准浓度点，这六个浓度点体积均为200μL；接着向其中各加入10μL1μg/mL同位素内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后即得标准品溶液。
3.根据权利要求2所述的LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其特征在于，所述的空白唾液基质为非吸烟者的唾液基质。
4.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其特征在于，所述的唾液样品按如下方法预处理得到：取200μL唾液于1.5mL离心管中，向其中加入10μL1μg/mL内标液B，再加入400μL乙腈，然后涡旋数秒后振荡10min，14000r/min离心5min后取50μL上清液，再加入50μL去离子水，混匀后即得唾液样品。
5.根据权利要求4所述的LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其特征在于，所述的内标液B按如下方法制备得到：准确称取10.0mg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液；然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，得到内标液B。
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