CN103776928A - 一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法。包括建立(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁标准溶液工作曲线；并对尿液样品进行酶解、稀释和过滤后上HPLC-MS-MS检测，进而换算出尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的浓度，然后计算两者的比例。该方法可以为评估个体的代谢健康状况以及评价烟气中尼古丁的暴露程度提供一种科学的判定方法，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点，填补了这一技术领域的空白。
Description
技术领域
本发明属于烟草生物碱理化检验技术领域，具体涉及一种检测尿液中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的方法。
背景技术
尼古丁是烟草中的主要生物碱，在烟草中平均含量达4％，约占烟草生物碱总量的95％。吸烟者抽吸烟草主要是因为尼古丁能够带来生理和心理方面的满足感，研究证明尼古丁对人体的生理作用主要包括对中枢神经系统、心血管系统和内分泌系统等的作用。尼古丁在人体内（主要是在肝脏中，其次是在肺和肾脏中）可以很快的代谢成多种产物，主要代谢产物有3-羟基可替宁及其糖苷、可替宁及其糖苷、尼古丁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、尼古丁氮氧化物、可替宁氮氧化物，这些代谢产物约占人体吸收尼古丁总量的90%以上。在人尿样中的可替宁及其糖苷约占尼古丁吸收量的26%，3-羟基可替宁及其糖苷约占尼古丁吸收量的41%，但目前人们更习惯使用可替宁作为尼古丁暴露在尿样中的生物标志物，这主要是因为在人体中约71%以上的尼古丁首先被代谢成可替宁，然后才被进一步代谢成3-羟基可替宁及其糖苷排出体外。
1990年Peyton Jacob等的研究首次发现普通人体代谢生成3-羟基可替宁具有高度立体选择性，在普通人尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁（即反式-3-羟基可替宁）与(3S,5S)-3-羟基可替宁（即顺式-3-羟基可替宁）的比例约为95：5，但并未进行大规模统计，也未对该结果进行深入分析。随后烟草科技工作者和医疗卫生工作者进行的诸多有关3-羟基可替宁的研究主要集中于(3R,5S)-3-羟基可替宁，很少有人同时进行(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的研究。
由于人体本身就是一个动态的不对称化学反应有机系统，所以卷烟烟气中的尼古丁经过各种途径代谢成可替宁，后者再进一步被代谢成(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比例必然反映出人体相关器官的解毒能力以及健康状况。深入研究证实，对于健康人群(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比例约为50：1～40：1，变化范围很小，而吸烟的代谢异常患者尿样中的这一比例出现明显变化。如何实现同时对尿样中两种3-羟基可替宁含量的准确检测并对两者的比值进行深入分析，现有技术中尚未有很好的解决办法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱-质谱-质谱联用技术检测尿液中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁含量的方法，为评估个体的代谢健康状况以及烟气中尼古丁的暴露程度提供一种科学的判定方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法，其特征在于：首先配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的混合标准溶液，进行HPLC-MS-MS分析并建立标准溶液工作曲线;然后在尿液样品中加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液、pH6.0的磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶进行酶解，再加超纯水稀释，用水相滤膜过滤后上HPLC-MS-MS检测。
一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法，具体包括以下步骤：
（1）标准曲线建立：
以乙腈为溶剂，配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的混合标准溶液，通过保留时间确定(3R,5S)-3-羟基可替宁和(3S,5S)-3-羟基可替宁的色谱峰；以HPLC-MS-MS色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的浓度之比为横坐标，以色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的定量离子对峰面积与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(3R,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；按同样的方法建立(3S,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；
（2）尿样处理：准确移取尿样于试管中，加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液，再加入磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶，充分混匀后置于恒温振荡器中或置于微波辅助萃取仪中，37℃避光恒温酶解；向酶解后的尿样中加入超纯水稀释，用0.2μm水相滤膜过滤，待检测；
（3）HPLC-MS-MS检测条件：
液相条件：用C18色谱柱和甲酸水溶液-甲酸乙腈溶液对样品进行分离；
质谱条件：用正离子模式（ESI+）进行多反应检测（MRM）,分析物特征离子对如表1；
表1分析物特征离子对
| 化合物 | 分子量 | 定量离子对(m/z) | 辅助定性离子对(m/z) |
| (3R,5S)-3-羟基可替宁 | 192.2 | 193→80 | 193→134 |
| (3S,5S)-3-羟基可替宁 | 192.2 | 193→80 | 193→134 |
| (3R,5S)-3-羟基可替宁-d3 | 195.2 | 196→80 | 196→134 |
（4）实际检测：使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁，进而换算得到原始尿液样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁含量，再计算得到该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1、本发明使用酶解后的尿样进行(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的HPLC-MS-MS法测定，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点；
2、该方法可以为吸烟的代谢异常患者的早期检测等提供重要参考信息，本发明方法的检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
实施例1
1、化学试剂准备：(3R,5S)-3-羟基可替宁(CAS号34834-67-8)，(3S,5S)-3-羟基可替宁可替宁(CAS号37096-14-3),(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3(CAS号159956-78-2),β-葡萄糖苷酸酶（类型IX-A，来自大肠杆菌）。
2、标准曲线建立：
表2混合标准溶液配比
以乙腈为溶剂，按表2配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的混合标准溶液，通过保留时间确定(3R,5S)-3-羟基可替宁和(3S,5S)-3-羟基可替宁的色谱峰；以HPLC-MS-MS色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的浓度之比为横坐标，以色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的定量离子对峰面积与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(3R,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；按同样的方法建立(3S,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；
3、实际样品检测
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取0.5mL于10mL试管中，加入10μL浓度为10mg/mL的(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液，再加入0.2mL的磷酸纳缓冲溶液（pH6.0,0.1mol/L）和100μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置于恒温振荡器中于37℃避光恒温酶解过夜。向酶解后的尿样中加入10mL超纯水，用0.2μm水相滤膜过滤，上HPLC-MS-MS检测。液相条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm i.d.×100mm，1.7μm)，流动相（A）:0.1%的甲酸水溶液，（B）:0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序如下：0-3min：5%-50%B，3-5min：50%B，5-6min：50%-5%B，6-8min：5%B。色谱柱温度：30℃，进样量：2μL，流速为：0.25mL/min；质谱条件：电离方式：电喷雾电离；正离子模式（ESI+）；离子源温度：120℃；毛细管电压：3.5kv；气化室温度：400℃；脱溶剂气流速：700L/hr；气帘气：80L/hr；碰撞气：0.19mL/min；扫描时间：150ms；多反应检测（MRM）模式,分析物特征离子对如表2；
分别使用(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁含量，进而换算出该尿液中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度为971ng/mL，(3S,5S)-3-羟基可替宁的浓度为20.9ng/mL，该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值为46.5：1，由于健康人群(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比例约为50：1～40：1，说明该尿液样本对应的吸烟者对烟碱的代谢机能基本正常。
实施例2
重复实施例1，有以下不同点：将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取1.0mL于10mL试管中，加入20μL浓度为10mg/mL的(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液，再加入0.2mL的磷酸纳缓冲溶液（pH6.0,0.1mol/L）和100μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置于微波辅助萃取仪37℃避光恒温酶解2分钟。向酶解后的尿样中加入10mL超纯水，用0.2μm水相滤膜过滤，上HPLC-MS-MS检测。分别使用(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁可替宁的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁，进而换算出该尿液中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度为3919ng/mL，(3S,5S)-3-羟基可替宁的浓度为139.4ng/mL，该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值为28.1：1，由于健康人群(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比例约为50：1～40：1，说明该尿液样本对应的吸烟者对烟碱的代谢机能可能出现了一定的问题，需要关注。
实施例3
重复实施例1，有以下不同点：将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取0.5mL于10mL试管中，加入10μL浓度为10mg/mL的(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液，再加入0.2mL的磷酸纳缓冲溶液（pH6.0,0.1mol/L）和100μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置于恒温振荡器中于37℃避光恒温酶解过夜。向酶解后的尿样中加入10mL超纯水，用0.2μm水相滤膜过滤，上HPLC-MS-MS检测。分别使用(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁可替宁的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁，进而换算出该尿液中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度为1793.8ng/mL，(3S,5S)-3-羟基可替宁的浓度为139.5ng/mL，该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值为12.8：1，由于健康人群(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比例约为50：1～40：1，说明该尿液样本对应的吸烟者对烟碱的代谢机能出现了一定的问题，需要明显关注。
需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法，其特征在于：首先配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的混合标准溶液，进行HPLC-MS-MS分析并建立标准溶液工作曲线;然后在尿液样品中加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液、pH6.0的磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶进行酶解，再加超纯水稀释，用水相滤膜过滤后上HPLC-MS-MS检测。
2.根据权利要求1所述的检测尿液中3-羟基可替宁的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）标准曲线建立：
以乙腈为溶剂，配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的混合标准溶液，通过保留时间确定(3R,5S)-3-羟基可替宁和(3S,5S)-3-羟基可替宁的色谱峰；以HPLC-MS-MS色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的浓度之比为横坐标，以色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的定量离子对峰面积与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(3R,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；按同样的方法建立(3S,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；
（2）尿样处理：准确移取尿样于试管中，加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d3溶液，再加入磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶，充分混匀后置于恒温振荡器中或置于微波辅助萃取仪中，37℃避光恒温酶解；向酶解后的尿样中加入超纯水稀释，用0.2μm水相滤膜过滤，待检测；
（3）HPLC-MS-MS检测条件：
液相条件：用C18色谱柱和甲酸水溶液-甲酸乙腈溶液对样品进行分离；
质谱条件：用正离子模式进行多反应检测,分析物特征离子对如表1；
表1分析物特征离子对
（4）实际检测：使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁，进而换算得到原始尿液样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁含量，再计算得到该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值。
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