CN103776927B - 一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法。用Oasis MCX固相萃取小柱对尿液样品进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化，对醇羟基进行mosher酯化，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测，进而换算出尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度，然后计算两者的比例。该方法可以为评估个体对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢健康状况以及评价对烟气中这些物质的的暴露程度提供一种科学的判定方法，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点，填补了这一技术领域的空白。

Description

一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法

技术领域

本发明属于烟草生物碱理化检验技术领域，具体涉及一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法。

背景技术

近年来，随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注，国内外烟草行业以及卫生机构迫切需要建立一些准确评价不同人群对烟草中部分化学成分暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测各种人群暴露程度的方法。目前，国内外检测各种具体烟气化学成分在人体尿液中生物标志物的研究已经有一些报道，但数量还比较少，涉及的用途也比较窄。

研究结果显示烟草中有3000多种化学物质，烟气中有5000多种化学物质，其中相当一部分化学物质的化学结构比较相近，它们进入人体后又经过各种复杂的代谢途径，很可能代谢生成同一种物质从尿液中排出。例如：尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等化学结构相近，都可以经过各种代谢途径生成4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸经尿液排出体外。虽然这些物质的初始代谢途径可能差异很大，但它们经过各种代谢途径都可以生成4-羰基-4-(3-吡啶基)丁酸，后者可以再进一步被加氢还原酶还原为羟基，生成一对4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸对映异构体，分别为(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸。由于人体本身就是一个不对称化学反应的有机系统，所以普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度有明显的差异，研究结果显示，(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度大约是(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的30～160倍。由于普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比例比较稳定，而其初级前体物质尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等与吸烟的数量或烟气的可致肺癌性相关，所以尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度比值必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK和NNAL等有害成分的损害程度，因此检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量以及比值具有重要意义。如何实现同时对尿样中两种4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的准确检测并对两者的比值进行深入分析，现有技术中尚未有很好的解决办法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱-质谱-质谱联用技术准确检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的方法，通过对两者的比值进行深入分析，为评估个体对烟气暴露程度提供一种科学的判定方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;

（2）用普通健康吸烟人群尿样中(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯浓度远大于(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

（3）准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5内标溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测。

该方法具体包括以下步骤：

（1）标准曲线建立：

以无水乙腈为溶剂，配制(±)4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；按同样方式配制(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；

外消旋体4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1；以HPLC-MS-MS色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的浓度与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量离子对峰面积与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；以同样方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

（2）尿液样品处理：

准确移取尿样于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀待用；将混匀后的尿样上样到已经活化好的混合阳离子树脂固相萃取小柱上进行净化，用去离子水淋洗后抽干、稀盐酸淋洗后抽干、甲醇淋洗后抽干，最后用甲醇：25%氨水混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干，加入无水乙醚，在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，待检测；

（3）HPLC-MS-MS检测条件：

液相条件：用C18色谱柱和乙腈-乙酸水溶液对样品进行分离；

质谱条件：用正离子模式（APCI+）进行多反应检测（MRM）,分析物特征离子对如表1；

表1 分析物特征离子对

（4）实际检测：

使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸，进而换算得到原始尿液样品中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量，再计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1、本发明使用衍生化HPLC-MS-MS法测定尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点；

2、本发明使用(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5作为内标，对羧基进行甲酯化，对醇羟基进行mosher酯化，可以显著降低(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的检测限，能够实现对(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸定量，而以前只能实现对(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的定量。

3、本发明便于科学评估人体对烟气暴露程度，同时为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息。检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。

附图说明

图1为(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸、(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸、(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的化学结构式。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

实施例1

1、化学试剂准备：(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯(CAS号20445-33-4)，(S)-(+)-α--甲氧基-(三氟甲基)苯乙酸酐(CAS号85541-57-7),(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸(CAS号15569-97-8),(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5，三乙基胺，重氮甲烷,硫酸二甲酯。

2、(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的衍生化和标准曲线的建立：

以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的(±)4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表2配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制浓度为1μg／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制浓度为1μg／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,在-20℃氮气氛围中按照表3的第一步衍生化分别加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再按照表3第二步衍生化分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析。

表2 混合标准溶液配比

表3 混合标准溶液的衍生化

由于普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度有明显的差异，(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度大约是(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的30-160倍，所以(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的峰面积大约是(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的30-160倍，以此确定对应(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的和(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯色谱峰位置和保留时间。

以HPLC-MS-MS色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的浓度与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量离子对峰面积与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；以同样方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线。

3、实际尿样检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取2mL于10mL试管中，加入100μL浓度为10ng/mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入3mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH5.0,30mM），充分混匀待用。将混匀后的尿样上样到已经分别用2mL甲醇、1mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液、2mL水活化好的Oasis MCX（60mg,3ml,Waters）固相萃取小柱上进行净化，用2mL去离子水淋洗后抽干、2mL0.1N盐酸淋洗后抽干、2mL甲醇淋洗后抽干，最后用2mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干，加入1mL无水乙醚，在-20℃氮气氛围中加入0.7nmol重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入320μL浓度为1μg/mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和120μL浓度为1μg/mL的三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS检测。使用(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯，进而换算出该尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度分别为7.1ng/mL和1230ng/mL，计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值为1：173，由于健康人群(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值约为1：30–1：160，说明该尿液样本对应的吸烟者对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢机能可能出现了一定的问题，需要关注。

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：

1、(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的衍生化和标准曲线的建立

以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制浓度为1μg／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制浓度为1μg／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取2mL混合标准溶液于反应瓶中,加入10mL无水甲醇，在-10℃氮气氛围中分别加入1mL二氯亚砜硫酸，震荡拿出至室温反应过夜，真空浓缩至干，在0℃按照表2第二步衍生化分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液，在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS检测。

2、实际尿样检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取2mL于10mL试管中，加入100μL浓度为10ng/mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入3mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH5.0,30mM），充分混匀待用。将混匀后的尿样上样到已经分别用2mL甲醇、1mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液、2mL水活化好的Oasis MCX（60mg,3ml,Waters）固相萃取小柱上进行净化，用2mL去离子水淋洗后抽干、2mL0.1N盐酸淋洗后抽干、2mL甲醇淋洗后抽干，最后用2mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干,加入10mL无水甲醇，在-10℃氮气氛围中分别加入1mL二氯亚砜硫酸，震荡拿出至室温反应过夜，真空浓缩至干，在0℃分别加入320μL浓度为1μg/mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和120μL浓度为1μg/mL的三乙基胺乙腈溶液，在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS检测。使用(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯，进而换算出该尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度分别为11.2ng/mL和1160ng/mL，计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值为1：103，由于健康人群(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值约为1：30–1：160，说明该尿液样本对应的吸烟者对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢机能正常。

实施例3

重复实施例1，有以下不同点：

1、(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的衍生化和标准曲线的建立

以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制浓度为1μg／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液;配制浓度为1μg／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,在-20℃氮气氛围中分别加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析。

2、实际尿样检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取2mL于10mL试管中，加入100μL浓度为10ng/mL的(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入3mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH5.0,30mM），充分混匀待用。将混匀后的尿样上样到已经分别用2mL甲醇、1mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液、2mL水活化好的Oasis MCX（60mg,3ml,Waters）固相萃取小柱上进行净化，用2mL去离子水淋洗后抽干、2mL0.1N盐酸淋洗后抽干、2mL甲醇淋洗后抽干，最后用2mL的甲醇：25%氨水（9：1）的混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干,在-20℃氮气氛围中分别加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS检测。使用(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯，进而换算出该尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度分别为15.3ng/mL和1370ng/mL，计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值为1：89，由于健康人群(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸与(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值约为1：30–1：160，说明该尿液样本对应的吸烟者对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢机能正常。

需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；

(2)用普通健康吸烟人群尿样中(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯浓度远大于(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

(3)准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5内标溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测。

2.根据权利要求1所述的检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：

(1)标准曲线建立：

以无水乙腈为溶剂，配制(±)4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；按同样方式配制(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制(S)-(+)-α‐甲氧基‐α‐三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液；配制三乙基胺的无水乙腈溶液；分别取混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；

外消旋体4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1；以HPLC-MS-MS色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的浓度与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量离子对峰面积与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；以同样方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

(2)尿液样品处理：

准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀待用；将混匀后的尿液样品上样到已经活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，用去离子水淋洗后抽干、稀盐酸淋洗后抽干、甲醇淋洗后抽干，最后用甲醇：25％氨水混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干，加入无水乙醚，在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，待检测；

(3)HPLC-MS-MS检测条件：

液相条件：用C18色谱柱和乙腈-乙酸水溶液对样品进行分离；

质谱条件：用正离子模式进行多反应检测,分析物特征离子对如表1；

表1 分析物特征离子对

(4)实际检测：

使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸，进而换算得到原始尿液样品中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量，再计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值。