CN105548402A - 高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒 - Google Patents

高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，它包括洗脱液、标准品溶液、内标物工作液、稀释液、有机溶剂和质控品。与现有技术相比，本发明高效稳定，回收率和稳定性良好(批内精密度在3.63％～6.39％之间，批间精密度在3.88％～9.35％之间，批内和批间RSD均在10％以内，平均回收率在91.90％～116.76％之间)，具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应用。

Description

高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒
技术领域
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒。
背景技术
DNA和RNA氧化损伤应激产物作为生物标记物的潜在用途和价值是生物医学研究的一个重要方面。8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷作为两种重要的氧化标记物，在组织细胞内产生，经血液运输，由肾脏随尿液排出体外。由于两种物质在体内较为稳定，且尿液样本易得，可以实现无创检测，通过对尿液中两种物质的监测可以为有效评价机体各种因素引起的氧化损伤提供帮助。此外，通过对健康人体内两种生物标记物的含量检测，可以评估性别、年龄和吸烟等潜在因子的影响作用。因此，开发一种经济、高效的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷检测方法至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，以解决现有技术存在的特异性较差和灵敏度低的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，它包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
(2)标准品溶液：含8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液；
(3)内标物工作液：含[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的甲醇溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白人工尿液基质；
稀释液2：甲醇；
(5)有机溶剂：甲醇；
(6)质控品：含有8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，分高中低三个浓度，分别为QC(H)、QC(M)、QC(L)；
其中，QC(H)、QC(M)、QC(L)中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度见表1；
表18-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度(单位ng/mL)
其中，所述的标准品溶液包括混合标准液C2和混合标准液C3；其中，所述的混合标准液C2为含浓度为96ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为97ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，所述的混合标准液C3为含浓度为9.6ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为9.7ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液。
其中，所述的内标物工作液为含浓度为0.991μg/mL的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的甲醇溶液。
其中，所述的空白人工尿液基质为含0.5586g/L二水合氯化钙、0.6099g/L六水合氯化镁、4.2077g/L氯化钠、2.0596g/L硫酸钠、0.6470g/L柠檬酸钠二水合物、0.0201g/L草酸钠、2.5449g/L磷酸二氢钾、1.4388g/L氯化钾、0.9200g/L氯化铵、2.4985g/L尿素和1.0520g/L肌酐的水溶液。
其中，所述的尿液为人或动物的尿液。
上述高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒的制备方法，
(1)洗脱液：
洗脱液A：配制0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
(2)标准品溶液：
分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配制成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20℃保存；取储备液A和B各100μL混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为4.8μg/mL，8-羟基鸟苷浓度为4.85μg/mL的混合标准液C1，-20℃保存；取100μL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混合标准液C2；取500μL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3；
(3)内标物工作液：
准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为49.55μg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL得到内标物工作液D；内标物储备液和内标物工作液D均于-20℃下保存；
(4)稀释液：
稀释液1：分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g硫酸钠、0.6470g柠檬酸钠二水合物、0.0201g草酸钠、2.5449g磷酸二氢钾、1.4388g氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用水溶解并定容至1L；
稀释液2：甲醇；
(5)有机溶剂：甲醇；
(6)质控品：分别取10μL、60μL、120μL步骤(2)中得到的混合标准品C1用空白人工尿液基质定容至10mL得到。
上述试剂盒在利用高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过预处理的尿液样品中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，先利用高效液相色谱技术将8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％v/v的甲酸水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱为UltimatePolar-RP，2.1×100mm，3μm；
流速为0.4mL/min；
柱温为30℃；
进样量为10μL；
采用梯度洗脱方式，见表1；
表1液相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾针电压为5500V；碰撞气为5psi；气帘气为50psi；离子源雾化气和加热辅助气均为65psi；脱溶剂气温度为550℃。
其中，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：
分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配制成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20℃保存；取储备液A和B各100μL混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为4.8μg/mL，8-羟基鸟苷浓度为4.85μg/mL的混合标准液C1，-20℃保存；取100μL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混合标准液C2；取500μL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3；
准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为49.55μg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL得到内标物工作液D；内标物储备液和内标物工作液D均于-20℃下保存；
分别取25μl、50μL和100μL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释并定容至100μL作为标准校准点S5、S6和S7；分别取5μL、10μL、50μL和100μL混合标准液C3用空白人工尿液基质稀释并定容至100μL，得到标准校准点S1、S2、S3和S4；这7个浓度点体积均为100μL；然后向各组标准校准点中加入15μL0.991μg/mL内标物工作液D，混合均匀后用甲醇定容至0.5mL，然后涡旋20秒后振荡10min，于4℃下12000g离心5min后取10μL上清液，即得标准品溶液；
其中，
S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7作为8-羟基脱氧鸟苷的校准点，S2、S3、S4、S5、S6和S7作为8-羟基鸟苷的校准点。
其中，所述的空白人工尿液基质为实验室人工配置的模拟尿液；其中，所述的空白人工尿液基质由如下方法制备得到：
分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g硫酸钠、0.6470g柠檬酸钠二水合物、0.0201g草酸钠、2.5449g磷酸二氢钾、1.4388g氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用去离子水溶解并定容至1L。
其中，尿液样品的预处理方法为：取100μL尿液至1.5mL离心管中，加入15μL内标物工作液D后混匀，再用甲醇定容至0.5mL，漩涡振荡1min，于4℃下12000g离心5min，取10μL上清液即可。
其中，准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为49.55μg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL得到内标物工作液D；内标物储备液和内标物工作液D均于-20℃下保存。
有益效果：
与现有技术相比，本发明高效稳定，回收率和稳定性良好(批内精密度在3.63％～6.39％之间，批间精密度在3.88％～9.35％之间，批内和批间RSD均在10％以内，平均回收率在91.90％～116.76％之间)，具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应用。
附图说明
图1a为标准品中8-羟基脱氧鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
图1b为标准品中8-羟基脱氧鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
图1c为标准品中8-羟基鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
图1d为标准品中8-羟基鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
图1e为标准品中[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
图1f为标准品中[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
图2a为尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
图2b为尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
图2c为尿液样品中8-羟基鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
图2d为尿液样品中8-羟基鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
图2e为尿液样品中[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
图2f为尿液样品中[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
1、材料
方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所员工的尿液样本。
(1)仪器：LC-20AD液相色谱仪(岛津，日本)、API4000+三重四极杆质谱仪(ABSciex，美国)、优普超纯水机(超纯，成都)、多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；快速混匀器(新康，江苏)、高速冷冻离心机(白洋，北京)、色谱分离柱为UltimatePolar-RP3μm2.1×100、可调移液器(ThermoFisher，0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)和玻璃仪器、烧杯、量筒等。
(2)试剂耗材：甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国天地公司；甲酸为色谱纯，购自天津市致远化学试剂有限公司；1.5mL离心管(AXYGEN，美国)；二水合氯化钙、六水合氯化镁、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠二水合物、草酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铵、尿素、肌酐等均购自国药集团化学试剂有限公司。
(3)标准品：8-羟基脱氧鸟苷(纯度96％)、8-羟基鸟苷(纯度97％)以及同位素内标物[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷(纯度99.1％)购自加拿大TorontoResearchChemical公司。
(4)质控品：含有8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。
表18-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度(单位ng/mL)
2、方法
(1)色谱条件
流动相A：0.1％(v/v)的甲酸水溶液；流动相B：乙腈。流速为0.4mL/min色谱柱为UltimatePolar-RP，2.1×100mm，3μm，柱温30℃，进样量为10μL，采用梯度洗脱方式，具体参数见表2。
表2液相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：采用电喷雾离子源(ElectrosprayIonization，ESI)和多反应监测(MultipleReactionMonitoring，MRM)模式进行质谱扫描。离子源参数：加热气(GS1)和辅助加热气(GS2)均为65psi，脱溶剂气温度为550℃；气帘气(CurtainGas，CUR)为50psi，碰撞气(CollisionGas，CAD)为5psi；喷雾针(Ionspray，IS)电压为5500V。目标物8-羟基脱氧鸟苷定量离子对和定性离子对分别为m/z284.2>168.2和m/z284.2>140.2，8-羟基鸟苷定量离子对和定性离子对分别为m/z300.1>140.1和m/z300.1>168.1，内标物监测离子对为m/z287.2>171.2和m/z287.2>143.2。为了获取较好的稳定性和灵敏度，各化合物监测离子对的去簇电压(DeclusteringPotential，DP)和碰撞电压(CollisionEnergy，CE)等参数均经过系统优化，具体参数见表3。
表38-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和内标物质谱多反应监测离子通道参数
注：a为定量离子对，b为定性离子对。
(3)空白人工尿液基质配制：分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g硫酸钠、0.6470g柠檬酸钠二水合物、0.0201g草酸钠、2.5449g磷酸二氢钾、1.4388g氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素、1.0520g肌酐用去离子水溶解并定容至1L。
(4)标准品配制：用甲醇将质量均为5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷标准品分别定容至10mL，配置成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A、B，-20℃保存。取A、B储备液各100μL经甲醇稀释后定容至10mL，配置成浓度分别为4.8μg/mL和4.85μg/mL的混合标准液C1，-20℃保存。取100μL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，得到浓度分别为96ng/mL和97ng/mL的混合标准液C2，然后取500μL混合标准液C2经空白人工尿液基质稀释定容至5mL配制成浓度分别为9.6ng/mL和9.7μg/mL的混合标准液C3。用甲醇将质量为0.5mg的内标物溶解后定容至10mL，得到浓度为49.55μg/mL的内标物储备液，储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL作为内标物工作液D，储备液和工作液均于-20℃保存。
(5)质控品配制：分别取10μL、60μL、120μL混合标准品C1用空白人工尿液基质定容至10mL。
分析试剂盒中各组分见表4。
表48-羟基脱氧鸟苷及8-羟基鸟苷分析试剂盒组分的制备
(6)样品处理
Ⅰ校准点处理：分别移取混合标准液C225μl、50μL、100μL用空白人工尿液基质定容至100μL作为标准校准点S5、S6、S7；分别取5μL、10μL、50μL、100μL混合标准液C3用空白人工尿液基质定容至100μL，得到标准校准点S1、S2、S3、S4，这7个浓度点体积均为100μL，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7作为8-羟基脱氧鸟苷的校准点，S2、S3、S4、S5、S6、S7作为8-羟基鸟苷的校准点。接着向其中各加入15μL0.991μg/mL内标物工作液D，混匀后用甲醇定容至0.5mL，然后涡旋20秒后振荡10min，于4下12000g离心5min后取10μL上清液进HPLC-MS/MS分析。
Ⅱ尿液样品前处理：取尿液100μL至1.5mL离心管中，加入15μL内标液D后混匀，再用甲醇定容至0.5mL，漩涡振荡1min，于4℃12000g离心5min，取上清10μL进HPLC-MS/MS分析。
Ⅲ质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各100μL于1.5mL离心管中，其它同尿液样品前处理方法一致，此处不再赘述。
3、方法的建立与优化
为了达到更高的稳定性和灵敏度，实验采用MRM模式同时监测8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷以及[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的离子对(Q1/Q3)，使用“Ramp”对不同离子对的去簇电压(DeclusteringPotential，DP)和碰撞电压(CollisionEnergy，CE)等参数进行了系统优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，记录优化结果见表5。此外，其它参数如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证稳定的信号强度。
表58-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷及[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷质谱参数优化结果
4、方法验证
(1)选择离子流图：标准品和尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图(XIC)见图1和图2，标准品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷浓度均为25ng/mL，而尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷浓度分别为9.33ng/mL和12.3ng/mL，无论是标准品还是尿液样品均无杂峰干扰，说明该方法条件切实可行，能够满足检测要求。
(2)校准曲线：采用同位素内标法定量，利用Analyst软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，然后根据待测尿液样品中目标物和内标物峰面积之比得到其在校准曲线上对应的待测物浓度和内标物浓度之比，结合已知的内标物浓度可计算出待测尿液中目标物的浓度。对2种分析物在各自浓度范围内进行线性拟合，得到的线性方程相关系数均在0.998以上，线性良好(表6)。同时，试剂盒也考察了2种目标分析物的最低定量限LLOQ，以信噪比不低于10且RSD小于20％的最小浓度点为最低定量限LLOQ；定量限以上RSD小于15％，回归系数R2>0.98的最低浓度值和最高浓度值作为检测方法的线性范围。各项参数均可满足人体尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的检测需求。
表68-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷线性范围、相关系数和最低定量限
(3)精密度试验：取10个以上尿液样本混合均匀，以混合尿样为添加基质做添加回收和精密度验证，按照高中低三个浓度分别添加标准品(8-羟基脱氧鸟苷：4.8ng/mL、28.8ng/mL和57.6ng/mL；8-羟基鸟苷：4.85ng/mL、29.1ng/mL、58.2ng/mL)，每个浓度样品平行处理6次，求得批内精密度和回收率，试验结果见表7。每日处理高、中、低浓度样品各一个，连续处理6天，求得批间精密度，试验结果见表8。
表7批内精密度试验结果
表8批间精密度试验结果
4、讨论
目前8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷两种生物标记物较常见的检测方法有高效液相色谱电化学法(HPLC-ECD)，气相色谱串联质谱法(GC-MS)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，酶联免疫法等。其中酶联免疫法特异性较差，HPLC-ECD法较为复杂，GC-MS法需要衍生化处理，且衍生化过程中存在的氧化作用可能引起8-羟基脱氧鸟苷含量人为增加。同以上几种检测手段相比，LC-MS/MS对样本量需求较少，样品前处理相对较为简单，且质谱法具有特异性强、灵敏度高的优点。
由于8-羟基脱氧鸟苷(lgP＝-1.7，pKa＝10.09，水溶性为14.8mg/mL)同8-羟基鸟苷两种物质均为极性较强的碱性化合物。要将这些极性较强的化合物从尿液样本基质中分离出来比较困难。常规的液液萃取法萃取效率过低，不能满足检测要求。且常规的C18色谱柱对两种物质保留性弱，不能有效的分离目标物，导致基质干扰效应较强，而且有研究表明2-脱氧鸟苷(2-deoxyguanosine，2-dG)在电喷雾离子源(ESI)离子化的过程中会被氧化成8-羟基脱氧鸟苷，因此要准确定量尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量，需要将2-脱氧鸟苷同8-羟基脱氧鸟苷用色谱分离开来。
迄今为止，文献中有关LC-MS/MS法检测两种物质的报道多采用SPE固相萃取法对尿液样本进行净化和富集。但固相萃取法步骤繁琐，对操作人员的操作技能要求高，费时费力，检测通量低，且回收率和稳定性均有较大局限性。此外，固相萃取法对试剂和耗材消耗量大，成本较高，不利于广泛的推广和应用。且现有的方法多采用常规的C18色谱柱对目标物进行色谱分离，由于两种物质的反相保留效果差，因此往往需要通过采用高比例的水相或增加色谱柱长度来增强保留作用，但持续的高比例水相会导致常规C18色谱柱填料塌陷现象，影响分离效果。
本发明正是基于以上所述现有技术的不足和缺陷之处开发了一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷快速前处理法和优异的色谱分离法，并结合串联四极杆质谱法对两种物质进行定量分析。
本发明采用直接稀释法同时检测8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，只需要100μl尿液样本，无须复杂的样品前处理过程，样品稀释后经极性内嵌的Polar-RP色谱柱分离，有效的排除了基质干扰和离子化过程中的干扰，且不会产生柱塌陷现象，只需5min即可完成一次分离和检测任务，较现有的方法通量提高较多，且回收率和稳定性良好(批内精密度在3.63％～6.39％之间，批间精密度在3.88％～9.35％之间，批内和批间RSD均在10％以内，平均回收率在91.90％～116.76％之间)，具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应用。虽然采用直接稀释法方法的检出限会有所升高，但根据现有文献以及本试剂盒批量抽检的101例人尿液检测结果显示8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量范围分别为0～20.37ng/mL和0～24.99ng/mL，而本发明的的检出限分别为0.24ng/mL和0.485ng/mL，能够满足人体尿液中两种物质的检测要求。

Claims (7)

1.高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
(2)标准品溶液：含8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液；
(3)内标物工作液：含[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的甲醇溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白人工尿液基质；
稀释液2：甲醇；
(5)有机溶剂：甲醇；
(6)质控品：含有8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，分高中低三个浓度，分别为QC(H)、QC(M)、QC(L)；
其中，QC(H)、QC(M)、QC(L)中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度见表1；
表18-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度(单位ng/mL)
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，其特征在于，所述的标准品溶液包括混合标准液C2和混合标准液C3；其中，所述的混合标准液C2为含浓度为96ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为97ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，所述的混合标准液C3为含浓度为9.6ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为9.7ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，其特征在于，所述的内标物工作液为含浓度为0.991μg/mL的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，其特征在于，所述的空白人工尿液基质为含0.5586g/L二水合氯化钙、0.6099g/L六水合氯化镁、4.2077g/L氯化钠、2.0596g/L硫酸钠、0.6470g/L柠檬酸钠二水合物、0.0201g/L草酸钠、2.5449g/L磷酸二氢钾、1.4388g/L氯化钾、0.9200g/L氯化铵、2.4985g/L尿素和1.0520g/L肌酐的水溶液。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，其特征在于，所述的尿液为人或动物的尿液。
6.权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒的制备方法，其特征在于，
(1)洗脱液：
洗脱液A：配制0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
(2)标准品溶液：
分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配制成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20℃保存；取储备液A和B各100μL混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为4.8μg/mL，8-羟基鸟苷浓度为4.85μg/mL的混合标准液C1，-20℃保存；取100μL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混合标准液C2；取500μL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3；
(3)内标物工作液：
准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为49.55μg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL得到内标物工作液D；内标物储备液和内标物工作液D均于-20℃下保存；
(4)稀释液：
稀释液1：分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g硫酸钠、0.6470g柠檬酸钠二水合物、0.0201g草酸钠、2.5449g磷酸二氢钾、1.4388g氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用水溶解并定容至1L；
稀释液2：甲醇；
(5)有机溶剂：甲醇；
(6)质控品：分别取10μL、60μL、120μL步骤(2)中得到的混合标准品C1用空白人工尿液基质定容至10mL得到。
7.权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒在利用高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷中的应用。
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