CN114894931A - 环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用 - Google Patents

环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用。本发明提供的LC‑MS/MS的cGMP检测方法，用于人血浆中cGMP检测时，检测精密度的变异系数(％CV)在1.24％～3.70％之间，批间精密度的变异系数(％CV)在2.26％～3.70％之间；检测人血浆高、低样本回收率均在85％～115％之间；检测线性为0.5ng/mL～30ng/mL，所有点偏差均在±15％以内，线性回归：r＞0.99；对血浆样本和纯溶剂样本比对，基质效应为‑0.02％～‑9.45％，证明本发明提供的检测方法能够用于评价药物对动物分泌环磷鸟嘌呤核苷的影响。

Description

环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用。
背景技术
环磷鸟嘌呤核苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)广泛分布于各种组织中，cGMP是细胞内具有传递作用的第二信使，被G蛋白偶联受体激活后的蛋白激酶活化后，可以将胞外信号传导到细胞核。因此，检测动物血浆中cGMP浓度具有重要的生理意义，对于评价药物对动物分泌cGMP的影响也有重要作用。
目前对cGMP的检测方法主要有：薄层色谱法、放射性免疫法和酶联免疫法。由于cGMP在体内含量极低，文献报道参考区间为2.2～66.8pmol/mL，在已报道的cGMP检测方法中，缺乏对检测体系检出限、精密度、准确度和基质效应等方面的验证与评价，不能确保检测结果的实用性、准确性及可靠性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有cGMP测定方法存在的问题与不足，提供一种能准确、高效地评价人血浆中cGMP检测方法，期望通过该检测方法能够满足方法验证过程中对检出限、精密度、准确度和基质效应等方面的要求，从而用于药效评价中。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂，所述检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液；
所述标准品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述质控品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述内标标准品包括环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液；
所述样本萃取液包括三氟乙酸水溶液；
所述检测试剂还包括稳定剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在可选的实施方式中，所述稳定剂的工作液为10～500mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的甲醇溶液，优选为100mM。
在可选的实施方式中，所述样本萃取液的工作液为10～200g/L的三氯乙酸水溶液，优选为50g/L。
在可选的实施方式中，所述标准品环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液的浓度稀释梯度为6个，其中环磷鸟嘌呤核苷的浓度范围为0.5～30ng/mL。
在可选的实施方式中，所述质控品包括HQC溶液和LQC溶液，所述HQC溶液和LQC溶液中环磷鸟嘌呤核苷的浓度选自1.5～22ng/mL；
优选地，所述检测试剂还包括将所述HQC溶液和LQC溶液的甲醇溶剂替换为血浆得到的准确度工作液。
在可选的实施方式中，所述环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液为13c,15N2-cGMP的甲醇溶液，其中13c,15N2-cGMP的浓度为15～2000ng/mL，优选为500ng/mL。
第二方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的检测试剂，所述检测试剂的剂型包括液体试剂、冻干粉或微球。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述检测试剂或前述实施方式所述试剂盒在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用；
所述药物包括检测或调控血浆中环磷鸟嘌呤核苷含量的药物。
第四方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷含量检测方法，所述检测方法包括，使用前述实施方式任一项所述检测试剂，或将前述实施方式所述试剂盒中所述检测试剂，采用液相色谱串联质谱方法对待测样本中的环磷鸟嘌呤核苷含量进行检测；
优选地，所述待测样本包括血浆或血清；
优选地，所述质谱采用电喷雾离子源，离子源参数为气帘气流速30～50psi，优选为40psi，喷撞气流速6～8psi，优选为7psi，离子化电压5000～6000V，优选为5500V，温度为450～600℃，优选为550℃，喷雾气和辅助加热气流速为40～60psi，优选为45psi；
所述液相色谱参数为流动相流速为0.4～0.8mL/min，优选为0.6mL/min，水相含有体积分数为0.1％的甲酸，有机相为乙腈；
液相检测时间1～1.8min期间，所述有机相占流动相总体积的90％，其余检测时间内，所述水相占流动相总体积的95％。
在可选的实施方式中，所述检测方法在检测前还包括LOD工作液的配制步骤，所述LOD工作液为环磷鸟嘌呤核苷的浓度为0.4～0.6ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液，所述环磷鸟嘌呤核苷的浓度梯度不少于5。
应用本发明提供的cGMP检测试剂，配合本发明提供的LC-MS/MS的cGMP检测方法，用于人血浆中cGMP检测，检测精密度的变异系数(％CV)在1.24％～3.70％之间，批间精密度的变异系数(％CV)在2.26％～3.70％之间；检测人血浆高、低样本回收率均在85％～115％之间；检测线性为0.5ng/mL～30ng/mL，所有点偏差均在±15％以内，线性回归：r＞0.99；对血浆样本和纯溶剂样本比对，基质效应为-0.02％～-9.45％。以上验证结果均证实了，本发明提供的检测方法能够推广用于评价药物对动物分泌环磷鸟嘌呤核苷的影响，具有重大的商业和科研价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为空白血浆中加入标准品前环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 346.0～m/z152.0)；
图2为空白血浆中加入内标标准品前13C,15N2-环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z349.0-m/z 137.3)；
图3为空白血浆中加入标准品后环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 346.0～m/z152.0)；
图4为空白血浆中加入内标标准品后13C,15N2-环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z349.0-m/z 137.3)；
图5为空白血浆中加入标准品和内标标准品后的色谱图；
图6为本发明具体实施方式中得到的标准曲线(0.5～30ng/mL)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂，所述检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液；
所述标准品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述质控品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述内标标准品包括环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液；
所述样本萃取液包括三氟乙酸水溶液；
所述检测试剂还包括稳定剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在可选的实施方式中，所述稳定剂的工作液为10～500mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的甲醇溶液，优选为100mM。
所述稳定剂用于抑制待测样本中的磷酸二酯酶(PDEs)，在常规血浆或血清样本的检测过程中均需要提前加入，而对于明确不含有磷酸二酯酶的待测样本，本领域技术人员则可根据待测样本的实际需求决定是否添加稳定剂。
在可选的实施方式中，所述样本萃取液的工作液为10～200g/L的三氯乙酸水溶液，优选为50g/L。
本发明采用三氯乙酸作为样本萃取液对待测样本进行沉淀处理，特别是人血浆样本经沉淀处理后，检测结果的精密度等效果均得到显著提高。
在可选的实施方式中，所述标准品环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液的浓度稀释梯度为6个，其中环磷鸟嘌呤核苷的浓度范围为0.5～30ng/mL，包括但不限于0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL或30ng/mL。
在可选的实施方式中，所述质控品包括HQC溶液和LQC溶液，所述HQC溶液和LQC溶液中环磷鸟嘌呤核苷的浓度选自1.5～22ng/mL；
优选地，所述检测试剂还包括将所述HQC溶液和LQC溶液的甲醇溶剂替换为血浆得到的准确度工作液。
在可选的实施方式中，所述环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液为13c,15N2-cGMP的甲醇溶液，其中13c,15N2-cGMP的浓度为15～2000ng/mL，优选为500ng/mL。
第二方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的检测试剂，所述检测试剂的剂型包括液体试剂、冻干粉或微球。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述检测试剂或前述实施方式所述试剂盒在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用；
所述药物包括检测或调控血浆中环磷鸟嘌呤核苷含量的药物。
第四方面，本发明提供环磷鸟嘌呤核苷含量检测方法，所述检测方法包括，使用前述实施方式任一项所述检测试剂，或将前述实施方式所述试剂盒中所述检测试剂，采用液相色谱串联质谱方法对待测样本中的环磷鸟嘌呤核苷含量进行检测；
优选地，所述待测样本包括血浆或血清；
优选地，所述质谱采用电喷雾离子源，离子源参数为气帘气流速30～50psi，优选为40psi，喷撞气流速6～8psi，优选为7psi，离子化电压5000～6000V，优选为5500V，温度为450～600℃，优选为550℃，喷雾气和辅助加热气流速为40～60psi，优选为45psi；
所述液相色谱参数为流动相流速为0.4～0.8mL/min，优选为0.6mL/min，水相含有体积分数为0.1％的甲酸，有机相为乙腈；
液相检测时间1～1.8min期间，所述有机相占流动相总体积的90％，其余检测时间内，所述水相占流动相总体积的95％。
在可选的实施方式中，所述检测方法在检测前还包括LOD工作液的配制步骤，所述LOD工作液为环磷鸟嘌呤核苷的浓度为0.4～0.6ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液，所述环磷鸟嘌呤核苷的浓度梯度不少于5，例如0.4ng/mL、0.45ng/mL、0.5ng/mL、0.55ng/mL或0.6ng/mL。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
以下具体实施方式使用到的试剂、标准品、质控品、重要耗材和主要仪器信息如下：
表1试剂、标准品、质控品和重要耗材
Figure BDA0003625551720000071
表2仪器设备
Figure BDA0003625551720000072
Figure BDA0003625551720000081
首先，对空白血浆中加入标准品环磷鸟嘌呤核苷前后、加入内标标准品13C,15N2-环磷鸟嘌呤核苷前后、以及同时加入标准品和内标标准品后的质谱图进行了考察，如图1～5所示，而后绘制标曲线，以校准样品的浓度为自变量xi，以相应外标和内标的峰面积比值均值为因变量yi，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r，如图6所示，以上结果作为后续实施例的参考标准。
实施例1
本实施例提供了一组环磷鸟嘌呤核苷检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液，具体组成如下所示：
Figure BDA0003625551720000082
Figure BDA0003625551720000091
实施例2
本实施例提供了一组环磷鸟嘌呤核苷检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液，与实施例1相比，还额外包括准确度工作液，所述准确度工作液包括HQC准确度溶液(浓度为1.5ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的血浆溶液)和LQC准确度溶液(浓度为22ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的血浆溶液)。
实施例3和4
实施例3和实施例4分别提供了一组环磷鸟嘌呤核苷检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液，与实施例1相比，区别在于，样本萃取液的工作液分别为10g/L和200g/L的三氯乙酸水溶液。
实施例5和6
实施例5和6分别提供了一组环磷鸟嘌呤核苷检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液，与实施例1相比，区别在于，稳定剂的工作液分别为10mM和500mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的甲醇溶液。
实施例7
本实施例提供了人血浆中环磷鸟嘌呤核苷的检测方法，具体包括：
7.1化合物及内标储备液配制
Figure BDA0003625551720000092
Figure BDA0003625551720000101
7.2化合物工作液和质控品工作液配制
Figure BDA0003625551720000102
7.3准确度工作液配制
Figure BDA0003625551720000103
7.4LOD工作液的配制
Figure BDA0003625551720000104
Figure BDA0003625551720000111
7.5内标工作液配制
Figure BDA0003625551720000112
7.6稳定剂配制
所有待测样本预处理采集前需要加入磷酸二酯酶(PDEs)抑制剂为稳定剂，本方法采用IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤作为磷酸二酯酶抑制剂。配制100mM IBMX作为稳定剂，称取22.224mg IBMX溶解于1mL甲醇中，样本处理前需加入1％的100mM IBMX。
7.7样本萃取液配制
称取5g三氯乙酸(TCA)溶于100mL超纯水中，作为萃取液。
7.8样品处理方法
(1)移取100μL标准品溶液/质控品溶液/待测样本溶液，分别加至新的96孔板中，加入10μL内标溶液，加入150μL萃取液，1500rpm混匀10分钟。
(2)将混匀后的样本放置离心机4000rpm离心10分钟。
(3)移取上清液180μL于新的96孔板中，4000rpm离心5分钟。
(4)10μL溶液进行LC-MS/MS分析。
7.9LC-MS/MS分析
7.9.1液相方法
1)流动相组成
Figure BDA0003625551720000121
Figure BDA0003625551720000131
2)梯度
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 0.6 95 5
0.30 0.6 95 5
1.00 0.6 10 90
1.80 0.6 10 90
1.81 0.6 95 5
3.00 0.6 95 5
7.9.2质谱方法
1)离子信息
Figure BDA0003625551720000132
*定量离子对
2)离子源参数：
Figure BDA0003625551720000133
Figure BDA0003625551720000141
实验例1人血浆cGMP检测精密度
1.1批内精密度
验证方法：分别取100μL低、高浓度的精密度工作液样品(浓度分别为：1.5ng/mL，22ng/mL)进行前处理；每个浓度水平5个样本平行。
接受标准：精密度用变异系数(％CV)来评估，CV应该在15.0％以内。
1.2批间精密度：
验证方法：分别取100μL低、高浓度的精密度工作液样品(浓度分别为：1.5ng/mL，22ng/mL)进行前处理；每个浓度水平5个样本平行，验证周期为5天，每天一个批次。
接受标准：精密度用变异系数(％CV)来评估，CV应该在15.0％以内。
1.3实验结果
Figure BDA0003625551720000142
Figure BDA0003625551720000151
1.4结论：低，高浓度的批内和批间精密度的变异系数(％CV)均在15％以内，满足接受标准。
实验例2人血浆cGMP检测准确度
1)验证方法：
将已知浓度的高水平待测物(A)加入到低浓度的血浆B中,所加待测物A与血浆B之间的体积比例为不大于1：9，各重复检测3次，取平均值。可参考公式计算回收率，各样本平均回收率应在[85％,115％]范围间。
Figure BDA0003625551720000152
式中：
R—回收率；
C—向B液中加入A液后的检测浓度的平均值；
V0—B液体积；
Vs—A液体积；
C0—B液浓度的平均值；
Cs—A液浓度。
2)接受标准：回收率在15.0％范围内。
3)实验结果：
Figure BDA0003625551720000161
结论：最低浓度点的偏差均在±20.0％以内，其余浓度点的偏差均在±15.0％以内，满足接受标准；线性回归：r＞0.99，满足接受标准。
实验例3人血浆cGMP检测分析灵敏度
3.1 LOB
验证方法：每天重复4个空白样本和4个C1的样本，持续5天，计算空白样本和C1样本的峰面积均值，LOB Area定义为20个空白样本峰面积均值+3SD，浓度计算公式为：LOBArea/C1 Area*C1，单位同C1。
3.2 LLMI
验证方法：对5份检测限附近的低值样本进行检测，每个样本重复测定3次，连续5天；
接受标准：CV≤20％，偏倚≤20％的最低浓度样本值。
3.3 LOB
数据计算结果：
Figure BDA0003625551720000162
Figure BDA0003625551720000171
结论：LOB的浓度为0.027ng/mL。
3.4 LLMI
数据计算结果：
Figure BDA0003625551720000172
结论：分析性能LOD的验证结果中，满足CV≤20％，偏倚≤20％标准的最低浓度样本的浓度值即为LLMI。LLMI的浓度为0.4ng/mL。
实验例4人血浆cGMP检测线性
验证方法：分别取一定量的化合物工作液(浓度分别为：C1，C2，C3，C4，C5，C6)进行前处理，连续5天。
接受标准：
最低浓度点的偏差应在±20.0％以内，其余浓度点的偏差应在±15.0％以内，CV应该在20.0％以内。线性回归：r≥0.99。
数据计算结果：
Figure BDA0003625551720000181
结论：最低浓度点的偏差均在±20.0％以内，其余浓度点的偏差均在±15.0％以内，满足接受标准；线性回归：r＞0.99，满足接受标准。
实验例5人血浆cGMP检测基质效应
验证方法：采用血浆分别配制高、低浓度样本(浓度分别为：1.5ng/mL，22ng/mL)，并配置同浓度的纯溶剂样本，每个浓度重复测定3次，分别计算样本浓度均值。
可接受标准：相对基质偏差(％)＝(血浆样本均值-血浆本底均值-纯溶剂样本均值)/纯溶剂样本均值(％)，基质偏差＜±20％。
结果如下：
Figure BDA0003625551720000191
结论：基质效应＜±20％，满足接受标准。
实验例6人血浆cGMP检测残留
分别取一定量残留工作液样品(C6)和空白溶液，进行前处理；通过先注射残留工作液样品，再连续注射3个空白溶液，并通过5个分析批的重复实验来评价残留。
接受标准：空白溶液的化合物峰面积＜20.0％C1化合物峰面积，空白溶液的内标峰面积＜C1内标物峰面积5％。
数据计算结果
Figure BDA0003625551720000201
结论：空白溶液的峰面积均＜20.0％C1峰面积,满足接受标准。内标不超过5％，满足接受标准。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.环磷鸟嘌呤核苷检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液；
所述标准品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述质控品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
所述内标标准品包括环磷鸟嘌呤核苷同位素的甲醇溶液；
所述样本萃取液包括三氟乙酸水溶液；
所述检测试剂还包括稳定剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述稳定剂的工作液为10～500mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的甲醇溶液，优选为100mM。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述样本萃取液的工作液为10～200g/L的三氯乙酸水溶液，优选为50g/L。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述标准品环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液的浓度稀释梯度为6个，其中环磷鸟嘌呤核苷的浓度范围为0.5～30ng/mL。
5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述质控品包括HQC溶液和LQC溶液，所述HQC溶液和LQC溶液中环磷鸟嘌呤核苷的浓度选自1.5～22ng/mL；
优选地，所述检测试剂还包括将所述HQC溶液和LQC溶液的甲醇溶剂替换为血浆得到的准确度工作液。
6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液为13c,15N2-cGMP的甲醇溶液，其中13c,15N2-cGMP的浓度为15～2000ng/mL，优选为500ng/mL。
7.环磷鸟嘌呤核苷检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～6任一项所述的检测试剂，所述检测试剂的剂型包括液体试剂、冻干粉或微球。
8.权利要求1～6任一项所述检测试剂或权利要求7所述试剂盒在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用；
所述药物包括检测或调控血浆中环磷鸟嘌呤核苷含量的药物。
9.环磷鸟嘌呤核苷含量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括，使用权利要求1～6任一项所述检测试剂，或将权利要求7所述试剂盒中所述检测试剂，采用液相色谱串联质谱方法对待测样本中的环磷鸟嘌呤核苷含量进行检测；
优选地，所述待测样本包括血浆或血清；
优选地，所述质谱采用电喷雾离子源，离子源参数为气帘气流速30～50psi，优选为40psi，喷撞气流速6～8psi，优选为7psi，离子化电压5000～6000V，优选为5500V，温度为450～600℃，优选为550℃，喷雾气和辅助加热气流速为40～60psi，优选为45psi；
所述液相色谱参数为流动相流速为0.4～0.8mL/min，优选为0.6mL/min，水相含有体积分数为0.1％的甲酸，有机相为乙腈；
液相检测时间1～1.8min期间，所述有机相占流动相总体积的90％，其余检测时间内，所述水相占流动相总体积的95％。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，检测前还包括LOD工作液的配制步骤，所述LOD工作液为环磷鸟嘌呤核苷的浓度为0.4～0.6ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液，所述环磷鸟嘌呤核苷的浓度梯度不少于5。
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