CN113063866A - 一种检测人体液中dhea的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人体液中DHEA的含量的方法，包括高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中脱氢表雄酮：S1、在试剂盒中加入以下试剂，流动相一、流动相二、标准品母液、内标液、稀释液、萃取液、质控品和复溶溶剂；S2、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的唾液中脱氢表雄酮；S3、利用高效液相色谱将脱氢表雄酮与干扰物分离；S4、利用同位素内标法定量；S5、以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴；S6、建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。本发明方法灵敏度高，特异性好，唾液样本处理较简单，方法学验证满足要求，说明该法是一种可靠的可用于人唾液中脱氢表雄酮的定量检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种检测人体液中DHEA的含量的方法。
背景技术
脱氢表雄酮(DHEA)是由肾上腺皮质分泌的一种甾体激素，是雄性激素和雌性激素合成的前体物质，具有广泛的生理和病理作用。DHEA被分泌至血液中大部分经过代谢形成结合型DHEA，这些结合型DHEA生理活性较弱，而剩余的DHEA称之为游离型DHEA，主要发挥生理活性的是这类DHEA。血液中游离型DHEA通过唾液腺上皮细胞被动扩散至唾液中，因此唾液中DHEA含量被认为可以用于评估人体中游离DHEA的水平。
传统的用于检测DHEA的方法主要有酶联免疫法和化学发光免疫分析法等，这些方法容易受到样本中DHEA结构类似物的干扰导致检测结果的偏离。近年来，高效液相色谱串联质谱技术被开发应用于检测人体液中DHEA的含量，然而由于DHEA分子结构原因，直接检测会发现DHEA的电离效率不佳，加之其在唾液中含量很低，因此直接检测的灵敏度达不到要求。
为此，我们提出一种检测人体液中DHEA的含量的方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中检测唾液中的DHEA不准确的问题，而提出的一种检测人体液中DHEA的含量的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种检测人体液中DHEA的含量的方法，包括高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中脱氢表雄酮：
S1、在试剂盒中加入以下试剂，流动相一、流动相二、标准品母液、内标液、稀释液、萃取液、质控品和复溶溶剂；
S2、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的唾液中脱氢表雄酮；
S3、利用高效液相色谱将脱氢表雄酮与干扰物分离；
S4、利用同位素内标法定量；
S5、以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴；
S6、建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。
优选的，所述流动相一为体积比为0.1％甲酸水溶液，所述流动相二为色谱纯的乙腈；
所述标准品母液为脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml标准品母液；
所述内标液为d6-脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液。
所述稀释液包括稀释液一和稀释液二，稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g氯化钠，0.4g氯化钾，0.8g二水氯化钙，0.8g二水磷酸二氢钠，1g尿素，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得，所述稀释液二为乙腈；
所述萃取液为甲基叔丁基醚；
所述质控品为脱氢表雄酮的空白唾液基质溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：20pg/ml、100pg/ml、500pg/ml，取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用稀释2定容至100ml，得100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液；
QC(L)：取2μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(M)：取10μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(H)：取50μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液1定容至10ml；
所述复溶溶剂为体积比为60％乙腈水溶液。
优选的，流动相一：体积比为0.1％的甲酸水；流动相二：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1流动相梯度洗脱参数
优选的，所述高效液相色谱串联质谱技术的质谱条件为：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi；目标物脱氢表雄酮m/z318.1→253.1，同位素内标d6-脱氢表雄酮m/z 324.1→253.1；脱氢表雄酮及内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)参数见表2。
表2脱氢表雄酮及内标的质谱参数
优选的，所述经前处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入2.5ng/ml的内标溶液20μl，加入1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
优选的，所述实验用内标溶液配制：精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液；取10μl内标母液用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml内标溶液；取1μg/ml内标溶液25μl用乙腈稀释定容至10ml得到2.5ng/ml的实验用内标溶液。
优选的，所述氮气吹干温度为50℃，所述衍生剂为浓度50mmol/l的甲氧胺盐酸盐，溶剂为80％甲醇水，避光水浴反应温度为50℃，反应时长为100min。
优选的，取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用已经稀释定容至100ml得100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液；分别取1μl，2μl，5μl，10μl，20μl，50μl，100μl的浓度为100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白基质溶液定容至刻度，得浓度为10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液；接着分别取500μl的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入2.5ng/ml的内标溶液20μl和1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、采用本发明试剂盒检测唾液中脱氢表雄酮，特异性强，灵敏度高，前处理过程较简单，精密度和加标回收率都基本符合要求，可以用于检测唾液中含量很低的脱氢表雄酮这种甾体激素，为评估人体游离脱氢表雄酮的含量提供了一种可靠的检测方法；
附图说明
图1为本发明提出的一种检测人体液中DHEA的含量的方法的脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮的标准品的总离子色谱图；
图2为唾液中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮的总离子色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-2，一种检测人体液中DHEA的含量的方法，包括高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中脱氢表雄酮：
S1、在试剂盒中加入以下试剂，流动相一、流动相二、标准品母液、内标液、稀释液、萃取液、质控品和复溶溶剂；
S2、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的唾液中脱氢表雄酮；
S3、利用高效液相色谱将脱氢表雄酮与干扰物分离；
S4、利用同位素内标法定量；
S5、以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴；
S6、建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。
流动相一为体积比为0.1％甲酸水溶液，流动相二为色谱纯的乙腈；
标准品母液为脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml标准品母液；
内标液为d6-脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液。
稀释液包括稀释液一和稀释液二，稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g氯化钠，0.4g氯化钾，0.8g二水氯化钙，0.8g二水磷酸二氢钠，1g尿素，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得，稀释液二为乙腈；
萃取液为甲基叔丁基醚；
质控品为脱氢表雄酮的空白唾液基质溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：20pg/ml、100pg/ml、500pg/ml，取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用稀释2定容至100ml，得100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液；
QC(L)：取2μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(M)：取10μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(H)：取50μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液1定容至10ml；
复溶溶剂为体积比为60％乙腈水溶液。
流动相一：体积比为0.1％的甲酸水；流动相二：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1流动相梯度洗脱参数
高效液相色谱串联质谱技术的质谱条件为：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi；目标物脱氢表雄酮m/z318.1→253.1，同位素内标d6-脱氢表雄酮m/z 324.1→253.1；脱氢表雄酮及内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)参数见表2。
表2脱氢表雄酮及内标的质谱参数
经前处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入2.5ng/ml的内标溶液20μl，加入1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
实验用内标溶液配制：精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液；取10μl内标母液用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml内标溶液；取1μg/ml内标溶液25μl用乙腈稀释定容至10ml得到2.5ng/ml的实验用内标溶液。
氮气吹干温度为50℃，衍生剂为浓度50mmol/l的甲氧胺盐酸盐，溶剂为80％甲醇水，避光水浴反应温度为50℃，反应时长为100min。
取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用已经稀释定容至100ml得100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液；分别取1μl，2μl，5μl，10μl，20μl，50μl，100μl的浓度为100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白基质溶液定容至刻度，得浓度为10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液；接着分别取500μl的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入2.5ng/ml的内标溶液20μl和1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
本发明仪器：API 5500三重四极杆质谱仪(AB SCIEX公司)；LC-20AD XR液相色谱系统(Shimadzu公司)；控温高速离心机(Eppendorf公司)；超纯水仪(Millipore公司)；多管涡旋振荡器(杭州瑞诚仪器有限公司)；氮吹仪(杭州瑞诚仪器有限公司)；涡旋振荡器(北京大龙兴创实验仪器股份公司)；水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；移液枪(Eppendorf公司，0.5～10μl，20-200μl，100～1000μl)，精密天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)等。
试剂耗材：色谱级乙腈(Sigma-Aldrich公司)，Waters XBridge BEH C18反相色谱柱(3.5μm,2.1mm*150mm，Waters公司)；色谱纯甲基叔丁基醚(Sigma-Aldrich公司)，甲氧胺盐酸盐(Sigma-Aldrich公司)；牛血清白蛋白(纯度≥98％，Sigma-Aldrich公司)；氯化钾、氯化钠、二水氯化钙、二水磷酸二氢钠、尿素均为优级纯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
标准品：脱氢表雄酮和d6-脱氢表雄酮均购自于Cambridge IsotopeLaboratories Inc.，纯度均≥98％。
质控品：含有低、中、高3个浓度的脱氢表雄酮的空白唾液基质溶液，分别为低浓度质控品QC(L)，浓度为20pg/ml；中浓度质控品QC(M)，浓度为100pg/ml；高浓度质控品QC(H)，浓度为500pg/ml。
方法
色谱条件：流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；流动相B：乙腈，浓度为100％。色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18(3.5μm,2.1mm*150mm)。采用梯度洗脱方式，详见表1，流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi。脱氢表雄酮及内标d6-脱氢表雄酮的去簇电压(DP)、射入电压(EP)，碰撞能(CE)、碰撞室出口电压(CXP)参数设置详见表2。
标准品配制：
精确称取10mg脱氢表雄酮标准品，乙腈溶解定容至10ml得1mg/ml脱氢表雄酮标准品母液。取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用乙腈稀释定容至100ml得100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液。
精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液。取10μl内标母液用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml内标溶液。取1μg/ml内标溶液25μl用乙腈稀释定容至10ml得到2.5ng/ml的实验用内标溶液。
质控品配制
分别取2μl，10μl，50μl的100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液用唾液空白基质稀释定容至10ml得低、中、高3种浓度的质控品，浓度分别为20pg/ml，100pg/ml，500pg/ml。
样本处理
标准品处理
分别取1μl，2μl，5μl，10μl，20μl，50μl，100μl的浓度为100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白基质溶液定容至刻度，得浓度为10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液。接着分别取500μl的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入2.5ng/ml的内标溶液20μl和1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
质控品处理
分别取500μl低、中、高3种浓度的质控品于2ml离心管中，然后与标准品处理方法一致，不再赘述。
分析试剂盒组成
分析试剂盒各组分见表3
表3分析试剂盒组成
方法验证
1.方法特异性：用空白唾液基质作为空白样本进行处理和上机分析，发现空白样本的谱图中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮出峰时间处无明显干扰。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。在10-1000pg/ml范围内，拟合得到的线性方程线性良好，线性相关系数大于0.999，满足定量要求。
3.精密度试验：取同一唾液样本重复处理7批，以同位素内标法定量测定这7批样本中脱氢表雄酮的含量，计算得到批内精密度为6.88％，结果见表4。连续3日分7批处理同一唾液样本，以同位素内标法定量测定这7批样本中脱氢表雄酮的含量，计算得到批间精密度为8.92％。结果见表5。
表4批内精密度(单位：pg/ml)
表5批间精密度(单位：pg/ml)
4.回收率试验：选取一唾液样本分成4份，每份500μl，其中一份不加标，其它3份分别加入低、中、高浓度的标准品，4份唾液经处理后上机测定3次。计算加标回收率在84.9％-105.5％之间，结果见表6。
表6加标回收率(单位：pg/ml)
本研究采用液相色谱串联质谱结束结合同位素稀释法测定了唾液中脱氢表雄酮的含量。相比于传统的免疫法灵敏度低，特异性差的缺点，该法通过让脱氢表雄酮与甲氧胺反应生成肟酯，显著提高了检测灵敏度，通过采用反应检测模式(MRM)保证了检测方法的特异性，加之在线的色谱分离和同位素内标物的应用，使得潜在的干扰和基体效应得到很好的排除和修正。
对该方法进行了方法学验证，用空白基质溶液处理后分析表明，该方法特异性很高在目标物以及内标物位置无明显干扰。精密度试验结果：批内精密度和批间精密度分别为6.88％和8.92％，满足可接受标准(CV≤15％)，说明该方法稳定性良好。通过低、中、高3个浓度的标准物质的添加进行加标回收率试验，结果显示加标回收率为84.9％～105.5％，满足可接受标准(80％～120％)。
综上，该方法灵敏度高，特异性好，唾液样本处理较简单，方法学验证满足要求，说明该法是一种可靠的可用于人唾液中脱氢表雄酮的定量检测方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测人体液中DHEA的含量的方法，包括高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中脱氢表雄酮，其特征在于：
S1、在试剂盒中加入以下试剂，流动相一、流动相二、标准品母液、内标液、稀释液、萃取液、质控品和复溶溶剂；
S2、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的唾液中脱氢表雄酮；
S3、利用高效液相色谱将脱氢表雄酮与干扰物分离；
S4、利用同位素内标法定量；
S5、以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴；
S6、建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述流动相一为体积比为0.1％甲酸水溶液，所述流动相二为色谱纯的乙腈；
所述标准品母液为脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml标准品母液；
所述内标液为d6-脱氢表雄酮的乙腈溶液，精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液。
所述稀释液包括稀释液一和稀释液二，稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g氯化钠，0.4g氯化钾，0.8g二水氯化钙，0.8g二水磷酸二氢钠，1g尿素，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得，所述稀释液二为乙腈；
所述萃取液为甲基叔丁基醚；
所述质控品为脱氢表雄酮的空白唾液基质溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：20pg/ml、100pg/ml、500pg/ml，取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用稀释2定容至100ml，得100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液；
QC(L)：取2μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(M)：取10μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；
QC(H)：取50μl 100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用稀释液1定容至10ml；
所述复溶溶剂为体积比为60％乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，流动相一：体积比为0.1％的甲酸水；流动相二：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1流动相梯度洗脱参数。
4.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱技术的质谱条件为：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi；目标物脱氢表雄酮m/z 318.1→253.1，同位素内标d6-脱氢表雄酮m/z 324.1→253.1；脱氢表雄酮及内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)参数见表2。
表2脱氢表雄酮及内标的质谱参数。
5.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述经前处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入2.5ng/ml的内标溶液20μl，加入1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
6.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述实验用内标溶液配制：精确称取10mg d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液；取10μl内标母液用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml内标溶液；取1μg/ml内标溶液25μl用乙腈稀释定容至10ml得到2.5ng/ml的实验用内标溶液。
7.根据权利要求5所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述氮气吹干温度为50℃，所述衍生剂为浓度50mmol/l的甲氧胺盐酸盐，溶剂为80％甲醇水，避光水浴反应温度为50℃，反应时长为100min。
8.根据权利要求1所述的一种检测人体液中DHEA的含量的方法，其特征在于，取10μl脱氢表雄酮标准品母液，用已经稀释定容至100ml得100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液；分别取1μl，2μl，5μl，10μl，20μl，50μl，100μl的浓度为100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白基质溶液定容至刻度，得浓度为10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液；接着分别取500μl的7个脱氢表雄酮校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入2.5ng/ml的内标溶液20μl和1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机相至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干，以100μl 60％乙腈水复溶，涡旋1min；13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。
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| CN114544836A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-05-27 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 检测痕量雌激素、17-羟孕烯醇酮、醛固酮、硫酸脱氢表雄酮的前处理方法及检测方法 |
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2021
- 2021-03-19 CN CN202110298486.1A patent/CN113063866A/zh not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113960205A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-21 | 西安市食品药品检验所(西安市药品不良反应监测中心) | 一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法 |
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