CN113655132A - 人血清中25羟基维生素d含量检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：T1.洗脱液：洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈，HPLC‑MS级。人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D，S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；S3、计算待测样本中25羟基维生素D的含量。本发明特异性强，灵敏度高，前处理过程简单，精密度和加标回收率都基本符合要求，可以用于检测人血清中25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的含量。

Description

人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及血清检测技术领域，尤其涉及人血清中25羟基维生素D含量检测方法以及检测时使用的试剂盒。
背景技术
维生素D是一种类固醇衍生物，在人体钙磷代谢中起至关重要的作用。此外，研究表明维生素D与2型糖尿病、乳腺癌、高血压等疾病有着密切关系。维生素D在肝脏中转化为25羟基维生素D，这是维生素D在体内的主要存在形式。25羟基维生素D在肾中代谢成1，25二羟基维生素D，这是维生素D的生理活性形式。通常所说的维生素D指的是维生素D3和维生素D2，后者主要存在于植物性食物中。目前，维生素D缺乏是一个日益严重的全球性问题，全球有近10亿人维生素D不足或缺乏，这使得佝偻病、软骨病和骨质疏松等疾病的发病率居高不下。因此准确检测人体中维生素D含量对于维生素D缺乏疾病的预防和干预越来越受到重视。
常规的25羟基维生素D的检测方法主要为免疫法。然而免疫法由于存在交叉反应导致特异性差，使得检测结果准确度不佳。大规模人群数据表明，大部分免疫学方法的结果与美国国家标准与技术研究院(NIST)测定结果偏倚在-30％～40％范围波动。近年来，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)由于其特异性好，灵敏度高，准确度佳等优点被越来越多的实验室用于临床检测领域。因此，开发一套前处理简便，灵敏度高的LC-MS/MS方法用于检测人体25羟基维生素D的含量显得十分必要，为此，我们提出人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
T1.洗脱液：
洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈，HPLC-MS级；
T2.标准品母液：
配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
T3.内标液：
配制：精确称取1mg d3-25羟基维生素D3标准品和1mg d3-25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml d3-25羟基维生素D内标母液；
T4.稀释液：
稀释液1：1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得；
稀释液2：乙腈；
T5.萃取液：正己烷
T6.质控品：25羟基维生素D的空白替代血清溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：2ng/ml、40ng/ml、80ng/ml；取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液；
QC(L)：取20μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取400μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(H)：取800μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
T7.复溶溶剂：体积比为80％甲醇水溶液。
优选的，空白替代血清溶液采用1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得。
优选的，所述标准品母液配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液，分别取10μl，20μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl的浓度为1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白血清基质溶液定容至刻度，得浓度为1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml的7个25羟基维生素D校准浓度溶液，接着分别取300μl的7个25羟基维生素D校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入1.2ml内标溶液，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D：
S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；
S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；
S3、，计算待测样本中25羟基维生素D的含量。
优选的，在S1中，高效液相色谱的具体条件为：
流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；
流动相B：乙腈，HPLC-MS级；浓度为100％；
色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0003119751720000041
Figure BDA0003119751720000051
优选的，具体的质谱条件为：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；
喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为450℃；
离子源气流GS1为60psi；GS2为70psi；
目标物25羟基维生素D3 m/z 401.2→365.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3m/z 404.2→368.2；
目标物25羟基维生素D2 m/z 413.2→355.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3m/z 416.2→358.2；
25羟基维生素D3，25羟基维生素D2及其内标的去簇电压、射入电压、碰撞电压、碰撞室射出电压参数见表2。
表2 25羟基维生素D及内标的质谱参数
Figure BDA0003119751720000052
优选的，所述经前处理的人血清按照如下方法制备得到：取300ul血清于2ml离心管中，加入1.2ml乙腈(含内标d3-25羟基维生素D浓度为3ng/ml)，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、采用本发明试剂盒检测人血清中25羟基维生素D，特异性强，灵敏度高，前处理过程简单，精密度和加标回收率都基本符合要求，可以用于检测人血清中25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的含量，为评估人体维生素D代谢提供了一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为本发明提出的人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒的25羟基维生素D及内标标准品的总离子色谱图；
图2为本发明提出的人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒的人血清中25羟基维生素D及内标的总离子色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-2，高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，试剂盒包括如下试剂：
T1.洗脱液：
洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈，HPLC-MS级；
T2.标准品母液：
配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
T3.内标液：
配制：精确称取1mg d3-25羟基维生素D3标准品和1mg d3-25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml d3-25羟基维生素D内标母液；
T4.稀释液：
稀释液1：1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得；
稀释液2：乙腈；
T5.萃取液：正己烷
T6.质控品：25羟基维生素D的空白替代血清溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：2ng/ml、40ng/ml、80ng/ml；取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液；
QC(L)：取20μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取400μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(H)：取800μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
T7.复溶溶剂：体积比为80％甲醇水溶液。
空白替代血清溶液采用1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得。
标准品母液配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液，分别取10μl，20μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl的浓度为1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白血清基质溶液定容至刻度，得浓度为1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml的7个25羟基维生素D校准浓度溶液，接着分别取300μl的7个25羟基维生素D校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入1.2ml内标溶液，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D：
S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；
S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；
S3、，计算待测样本中25羟基维生素D的含量。
在S1中，高效液相色谱的具体条件为：
流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；
流动相B：乙腈，HPLC-MS级；浓度为100％；
色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0003119751720000091
具体的质谱条件为：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；
喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为450℃；
离子源气流GS1为60psi；GS2为70psi；
目标物25羟基维生素D3 m/z 401.2→365.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3m/z 404.2→368.2；
目标物25羟基维生素D2 m/z 413.2→355.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3m/z 416.2→358.2；
25羟基维生素D3，25羟基维生素D2及其内标的去簇电压、射入电压、碰撞电压、碰撞室射出电压参数见表2。
表2 25羟基维生素D及内标的质谱参数
Figure BDA0003119751720000101
经前处理的人血清按照如下方法制备得到：取300ul血清于2ml离心管中，加入1.2ml乙腈(含内标d3-25羟基维生素D浓度为3ng/ml)，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
方法学研究实验样本来源于艾可泰科生物科技(江苏)有限公司员工的血清样本。
仪器：API 5500三重四极杆质谱仪(AB SCIEX公司)；LC-20AD XR液相色谱系统(Shimadzu公司)；控温高速离心机(Eppendorf公司)；超纯水仪(Millipore公司)；多管涡旋振荡器(杭州瑞诚仪器有限公司)；氮吹仪(杭州瑞诚仪器有限公司)；涡旋振荡器(北京大龙兴创实验仪器股份公司)；水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；移液枪(Eppendorf公司，0.5～10μl，20-200μl，100～1000μl)，精密天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)等。
试剂耗材：色谱级乙腈、甲醇、正己烷(Sigma-Aldrich公司)，Waters XBridge BEHC18反相色谱柱(3.5μm,2.1mm*150mm，Waters公司)；牛血清白蛋白(纯度≥98％，Sigma-Aldrich公司)。
标准品：25羟基维生素D2、25羟基维生素D3均购自于Sigma-Aldrich公司，纯度≥99％。d3-25羟基维生素D2、d3-25羟基维生素D3均购自于Toronto Research Chemicals公司，纯度≥98％。
质控品：含有低、中、高3个浓度的25羟基维生素D的空白血清基质溶液，分别为低浓度质控品QC(L)，浓度为2ng/ml；中浓度质控品QC(M)，浓度为40ng/ml；高浓度质控品QC(H)，浓度为80ng/ml。
方法
色谱条件：
流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；流动相B：乙腈，浓度为100％。色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18(3.5μm,2.1mm*150mm)。采用梯度洗脱方式，详见表1，流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为450℃；离子源气流GS1为60psi；GS2为70psi。目标物25羟基维生素D3 m/z 401.2→365.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3m/z 404.2→368.2；目标物25羟基维生素D2 m/z 413.2→355.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3 m/z 416.2→358.2；25羟基维生素D3，25羟基维生素D2及其内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)参数见表2。
标准品配制：
精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液。取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液。
精确称取1mg d3-25羟基维生素D3标准品和1mg d3-25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml d3-25羟基维生素D内标母液。取0.1ml上述内标母液用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml d3-25羟基维生素D内标溶液。取1μg/ml d3-25羟基维生素D内标溶液30μl用乙腈稀释定容至10ml得到3ng/ml的实验用内标溶液。
质控品配制：
分别取20μl，400μl，800μl的1μg/ml的25羟基维生素D标准溶液用血清空白基质稀释定容至10ml得低、中、高3种浓度的质控品，浓度分别为2ng/ml，40ng/ml，80ng/ml。
标准品处理：
分别取10μl，20μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl的浓度为1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白血清基质溶液定容至刻度，得浓度为1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml的7个25羟基维生素D校准浓度溶液。接着分别取300μl的7个25羟基维生素D校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入1.2ml内标溶液，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
质控品处理：
分别取300μl低、中、高3种浓度的质控品于2ml离心管中，然后与标准品处理方法一致，不再赘述。
分析试剂盒组成
分析试剂盒各组分见表3
表3分析试剂盒组成
Figure BDA0003119751720000141
方法验证
1.方法特异性：用空白唾液基质作为空白样本进行处理和上机分析，发现空白样本的谱图中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3及其内标出峰时间处无明显干扰。
2.检测限和定量限：检测限为信噪比的3倍，定量限为信噪比的10倍。该方法的25OHVD2和25OHVD3的检测限为0.2ng/mL，定量限为0.5ng/mL。
3.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算待测样本中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的含量。在1-100ng/ml范围内，拟合得到的线性方程线性良好，线性相关系数大于0.999，满足定量要求。
精密度试验：取低、中、高3个浓度的标准溶液重复处理3批，每个浓度溶液每批3个平行。在同一天处理并检测1批低、中、高3个浓度标准溶液中25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的含量，计算得到批内精密度为1.69-2.70％(25羟基维生素D2)和0.71％-1.98％(25羟基维生素D3)，结果见表4。连续3日处理并检测3批低、中、高3个浓度的标准溶液的含量，计算得到批间精密度为0.78-1.33％(25羟基维生素D2)和1.34-3.07％(25羟基维生素D3)。结果见表5。
表4批内精密度
Figure BDA0003119751720000151
表5批间精密度
Figure BDA0003119751720000152
1.回收率试验：选取一血清样本分成4份，每份300μl，其中一份不加标，其它3份分别加入低、中、高浓度的标准品，4份血清经处理后上机测定3次。计算加标回收率为93.0％-104.2％(25羟基维生素D2)和98.3％-103.1％(25羟基维生素D3)，结果见表6。
表6加标回收率
Figure BDA0003119751720000161
本发明研究采用液相色谱串联质谱结束结合同位素稀释法测定了人血清中25羟基维生素D(25羟基维生素D2和25羟基维生素D3)的含量。相比于传统的免疫法灵敏度低，特异性差的缺点，该法通过采用反应检测模式(MRM)保证了检测方法的特异性，质谱作为检测器大大提高了检测灵敏度，加之在线的色谱分离和同位素内标物的应用，使得潜在的干扰和基体效应得到很好的排除和修正。此外，该方法前处理简便，可用于大批量样本的检测分析。
对该方法进行了方法学验证，用空白基质溶液处理后分析表明，该方法特异性很高在目标物以及内标物位置无明显干扰。精密度试验结果：批内精密度为1.69-2.70％(25羟基维生素D2)和0.71％-1.98％(25羟基维生素D3)；批间精密度为0.78-1.33％(25羟基维生素D2)和1.34-3.07％(25羟基维生素D3)，满足可接受标准(CV≤15％)，说明该方法稳定性良好。通过低、中、高3个浓度的标准物质的添加进行加标回收率试验，结果显示加标回收率：93.0％-104.2％(25羟基维生素D2)和98.3％-103.1％(25羟基维生素D3)，满足可接受标准(80％～120％)。
综上，该方法灵敏度高，特异性好，血清样本处理简单，方法学验证满足要求，说明该法是一种可靠的可用于人血清中25羟基维生素D的定量检测方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：
T1.洗脱液：
洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈，HPLC-MS级；
T2.标准品母液：
配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
T3.内标液：
配制：精确称取1mg d3-25羟基维生素D3标准品和1mg d3-25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml d3-25羟基维生素D内标母液；
T4.稀释液：
稀释液1：1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得；
稀释液2：乙腈；
T5.萃取液：正己烷
T6.质控品：25羟基维生素D的空白替代血清溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：2ng/ml、40ng/ml、80ng/ml；取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液；
QC(L)：取20μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取400μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
QC(H)：取800μl 1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；
T7.复溶溶剂：体积比为80％甲醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，空白替代血清溶液采用1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，所述标准品母液配制：精确称取1mg 25羟基维生素D3标准品和1mg 25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml得到100ug/ml 25羟基维生素D标准品母液；
取0.1ml 25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml 25羟基维生素D标准品溶液，分别取10μl，20μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl的浓度为1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白血清基质溶液定容至刻度，得浓度为1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml的7个25羟基维生素D校准浓度溶液，接着分别取300μl的7个25羟基维生素D校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入1.2ml内标溶液，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
4.人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D，其特征在于：
S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；
S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；
S3、，计算待测样本中25羟基维生素D的含量。
5.根据权利要求4所述的人血清中25羟基维生素D含量检测方法，其特征在于，在S1中，高效液相色谱的具体条件为：
流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；
流动相B：乙腈，HPLC-MS级；浓度为100％；
色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；
采用梯度洗脱方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。
表1 流动相梯度洗脱参数
Figure FDA0003119751710000031
6.根据权利要求4所述的人血清中25羟基维生素D含量检测方法，其特征在于，具体的质谱条件为：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；
喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为450℃；
离子源气流GS1为60psi；GS2为70psi；
目标物25羟基维生素D3 m/z 401.2→365.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3 m/z404.2→368.2；
目标物25羟基维生素D2 m/z 413.2→355.2，其同位素内标d3-25羟基维生素D3 m/z416.2→358.2；
25羟基维生素D3，25羟基维生素D2及其内标的去簇电压、射入电压、碰撞电压、碰撞室射出电压参数见表2。
表2 25羟基维生素D及内标的质谱参数
Figure FDA0003119751710000041
7.根据权利要求6所述的人血清中25羟基维生素D含量检测方法，其特征在于，所述经前处理的人血清按照如下方法制备得到：取300ul血清于2ml离心管中，加入1.2ml乙腈(含内标d3-25羟基维生素D浓度为3ng/ml)，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul 80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。
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