CN115236252B - 血清中25-羟基维生素d的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血清中25‑羟基维生素D的检测方法，涉及维生素D检测的技术领域。该检测方法检测的25‑羟基维生素D包括25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3，该检测方法包括采用高效液相色谱法分析经前处理的样本，前处理包括萃取经沉淀处理的样品，高效液相色谱法中内标采用月桂基苯甲酮。该检测方法缓解了现有技术检测血清中25‑羟基维生素D的成本高和操作复杂的技术问题，具有灵敏度高，重复性好和准确性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及维生素D检测技术领域，尤其是涉及一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。
背景技术
维生素是维持机体正常生理功能，维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质，在调节物质代谢过程中发挥重要作用。维生素D属于脂溶性维生素，是调节骨代谢的重要维生素，婴幼儿缺乏维生素D会导致佝偻病，成人缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。25-羟基维生素D半衰期较长，体内存在形式稳定且浓度较高，是监测体内维生素D营养水平的标志物。25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是25-羟基维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标，因此，监测人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。
目前25-羟基维生素D的检测方法主要分为免疫法和色谱法。传统的免疫法包括酶免免疫吸附法，化学发光免疫测定法，放射免疫法等。色谱法主要包括高效液相色谱法(HPLC法)和液相色谱质谱法(LC-MS/MS)。免疫法测定25-羟基维生素D较容易受温度，基质，抗体状态等因素影响，批内，批间变异系数，精密度存在较大的偏差且设计的特异性结合25-羟基维生素D的抗体和VD的其他代谢物之间存在交叉反应。维生素羟基化合物都能与抗体存在不同程度反应，通过免疫法只能测定得到25-羟基维生素D的总量，无法满足同时测定25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2。
液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)测定25-羟基维生素D具有非常高的灵敏度，特异性和准确度。同位素稀释LC-MS/MS法更是国际上公认的“金标准”，同时能很好满足检测25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2要求。LC-MS/MS法需要一个耗时且复杂的前处理过程而且复杂的设备操作对操作人员有更高的要求，昂贵的设备及维护成本需要更大的资金投入。
因此，如何降低检测成本，简化操作，同时又能保证检测灵敏度，特异性和准确度是目前亟需解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，以缓解现有技术检测血清中25-羟基维生素D的成本高和操作复杂的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，该检测方法检测的25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；
所述检测方法包括采用高效液相色谱法分析经前处理的样本；所述高效液相色谱法中内标采用月桂基苯甲酮；
所述前处理包括萃取经沉淀处理的样品。
优选地，所述前处理包括先使用沉淀剂对样本进行沉淀，然后使用萃取剂萃取经沉淀的样本；
所述样本包括待测血清样本和对照品样本，所述对照品样本包括校准品工作液和/或质控品工作液；以牛血清白蛋白(BSA)作为人血清的替代基质配制校准品工作液和质控品工作液；
优选地，用于配制对照品样本的稀释液按照质量百分比计，为含有1～5％牛血清蛋白的PBS缓冲液；
优选地，按照质量百分比计，所述稀释液为含有1％牛血清蛋白的PBS缓冲液。
优选地，所述沉淀剂为无机盐溶液；
优选地，所述无机盐选自硫酸铵或硫酸钠；
优选地，所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液。
优选地，使用乙腈萃取经沉淀处理的样本；
优选地，所述萃取剂为月桂基苯甲酮的乙腈溶液；
优选地，月桂基苯甲酮的浓度为0.8～1.2μg/mL，优选为1μg/mL。
优选地，所述校准品工作液包括校准品S1～S6，其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
校准品S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 7ng/mL；
校准品S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 10ng/mL；
校准品S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20ng/mL；
校准品S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 50ng/mL；
校准品S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80ng/mL；
校准品S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 100ng/mL。
优选地，所述质控品工作液包括低值质控品工作液和高值质控品工作液；其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
低值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20ng/mL；
高值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80ng/mL。
优选地，高效液相色谱采用梯度洗脱，按照体积百分比计，流动相A为0.05～0.1％甲酸水溶液；流动相B为0.05～0.1％甲酸乙腈溶液；
优选地，按照体积百分比计，流动相A为0.07％甲酸水溶液；流动相B为0.07％甲酸乙腈溶液。
优选地，梯度洗脱程序为：
时间0min，流动相A 20％，流动相B 80％；
时间3min，流动相A 23％，流动相B 77％；
时间4min，流动相A 40％，流动相B 60％；
时间5min，流动相A 37％，流动相B 63％；
时间15min，流动相A 33％，流动相B 67％；
时间17min，流动相A 5％，流动相B 95％；
时间20min，流动相A 5％，流动相B 95％；
时间22min，流动相A 20％，流动相B 80％。
优选地，高效液相色谱采用色谱柱：岛津C18 5μm 4.6×150mm；
优选地，柱温为35～45℃，优选为45℃。
优选地，所述高效液相色谱法中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的吸收波长为264nm；内标吸收波长为275nm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过高效液相色谱法高通量检测血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。高效液相色谱法测定25-羟基维生素D主要原理是血清中的25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2经过简单前处理制备后，进入到HPLC系统中，高效液相色谱根据化合物的物理性质不同在经过分离系统后得到有效分离，分离后的物质根据化合物的特征吸收波长进行检测分析，根据其保留时间进行定性分析，朗伯比尔定律进行定量分析。HPLC法具有灵敏度高，特异性强，准确性好，可在单次检测中准确定量多种分析物的优点，同时具备仪器设备价格低廉，操作简单等优点。
本方法通过先对血清中的蛋白进行沉淀处理，然后萃取，经过简单的震荡，达到快速提取血清中25-羟基维生素D的效果，该前处理方法简单，快速，省去了液液萃取时需要添加大量有机溶剂并需要长时间震荡萃取的过程，省去了氮吹过程，节约前处理时间。
本发明提供的检测方法针对市场上诊断人体血清中维生素D方法的不足，研究了一种能准确、高通量同时检测人血清中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的高效液相色谱法，具有灵敏度高，重复性好，准确性高等特点。该方法25-羟基维生素D2线性范围为7～100ng/mL，25-羟基维生素D3线性范围为7～100ng/mL，相关系数r均≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤20％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；准确度的相对偏差(B)≤±15％，加标回收率为80％～120％。该方法能满足相关法规对25-羟基维生素D检测的线性、重复性、批间差、准确度、稳定性等的要求，对监测生物样本中维生素D有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同沉淀剂对血清的沉淀效果；
图2为不同萃取剂与样本混合后的分层效果；
图3为本发明实施例1提供的检测方法中高效液相色谱的色谱图；
图4为以表5所示洗脱程序洗脱的高效液相色谱的色谱图；
图5为采用酝博C18柱进行高效液相色谱得到的色谱图；
图6为血样干扰试验的高效液相色谱的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，所述血清中25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。需要说明的是，本发明提供的检测方法是非诊断和治疗目的的。所述检测方法包括对样品依次进行沉淀和萃取的前处理，然后使用高效液相色谱法对经前处理的样本进行分析。其中样本包括待测的血清样本，和用于在高效液相色谱法分析样本中构建标准曲线的校准品，以及还可选的包括用于对检测结果进行质量控制的质控品。
本发明通过对样本进行沉淀和萃取处理，可迅速提取血清中的25-羟基维生素D，该前处理方法简单，快速。本发明采用高效液相色谱法测定25-羟基维生素D，HPLC法具有灵敏度高，特异性强，准确性好，可在单次检测中准确定量多种分析物的优点，同时具备仪器设备价格低廉，操作简单等优点。
本发明高效液相色谱法对经前处理的样本进行分析的过程中，采用月桂基苯甲酮作为内标，月桂基苯甲酮的性质与目标物相似，可以排除内源性干扰，且在相同的前处理及色谱条件下具有一定的稳定性，与25-羟基维生素D保留时间接近但不重叠，在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。
在一些可选的实施方式中，所述前处理包括先使用沉淀剂对样本进行沉淀，然后使用萃取剂萃取经沉淀的样本。该步骤中使用沉淀剂直接沉淀待测血清样本，对于校准品和质控品，需要先配制成工作液，即将校准品和质控品稀释至目标浓度的工作液，再进行沉淀。
在一些可选的实施方式中，以牛血清白蛋白(BSA)作为人血清的替代基质配制校准品工作液和质控品工作液，具有易于获得、成本低、质量易于控制等优点。
在一些可选的实施方式中，用于配制对照品样本的稀释液按照质量百分比计，为含有1～5％牛血清蛋白的PBS缓冲液，浓度例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％，优选地，按照质量百分比计，所述稀释液为含有1％牛血清蛋白的PBS缓冲液。
在一些可选的实施方式中，所述沉淀剂为无机盐溶液，无机盐选自但不限于硫酸铵或硫酸钠。所述沉淀剂优选使用饱和硫酸铵溶液。
在一些可选的实施方式中，使用乙腈萃取经沉淀处理的样本。
在一些实施例中通过实验发现，使用硫酸铵作为蛋白沉淀剂，与乙腈结合后，能很好的进行液液分层。硫酸铵在水中的溶解度不易随着温度变化而变化，对运输，储存带来极大的方便。
在一些可选的实施方式中，所述萃取剂为月桂基苯甲酮的乙腈溶液，该萃取剂能快速提取经沉淀处理的样本中的25-羟基维生素D，同时萃取剂中的月桂基苯甲酮作为高效液相色谱分析中的内标物质使用。月桂基苯甲酮的浓度为0.8～1.2μg/mL，例如可以为但不限于为0.8、0.9、1.0、1.1或1.2μg/mL，优选为1μg/mL。
使用高效液相色谱分析样本时首先需要建立标准曲线，标准曲线是已知浓度的校准品中待测物质的含量与其色谱图特征值之间的函数关系，例如与峰面积或峰高之间的函数关系。然后将待测样本色谱图的特征值带入构建的标准曲线中，便可以得到待测样本中待测物质的含量。
在一些可选的实施方式中，以校准品浓度为x，相应校准品和对应内标的峰面积的比值为y绘制校准曲线；将待测样品和对应内标的峰面积的比值带入校准曲线，得到待测样品中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。
或者，以校准品浓度与对应内标的浓度比为x，相应校准品和对应内标的峰面积的比值为y绘制校准曲线；将待测样品和对应内标的峰面积的比值带入校准曲线，得到待测样品与对应内标的浓度比，然后计算出待测样品中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度。
在一些可选的实施方式中，所述校准品工作液包括校准品S1～S6，其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
校准品S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 7ng/mL；
校准品S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 10ng/mL；
校准品S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20ng/mL；
校准品S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 50ng/mL；
校准品S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80ng/mL；
校准品S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 100ng/mL。
在一些可选的实施方式中，当使用质控品对检测结果进行质量控制时，质控品工作液包括低值质控品工作液和高值质控品工作液；其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
低值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20ng/mL；
高值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80ng/mL。
本发明中“目标浓度”指的是，在配制校准品或质控品时对其目标浓度的期望值，而非实际浓度。在实际操作中，试剂的配制由于操作、仪器以及容器等因素会产生误差，使实际浓度与预配制的理论浓度，即目标浓度产生偏差。在实际操作中通常会使用更高一级的校准品对用于建立标准曲线的校准品或质控品进行校正与赋值，经更高一级的校准品赋值后的校准品或质控品的标示浓度可能会与目标浓度的值产生偏差，这种偏差是本领域可接受的。因此，当根据上述目标浓度配制校准品或质控品后，得到的试剂即使并非严格符合上述目标浓度，但是只要在本领域可接受的误差内，也属于本发明的保护范围。
在一些可选的实施方式中，本发明还优化了高效液相色谱的色谱条件，具体如下：
高效液相色谱采用梯度洗脱，按照体积百分比计，流动相A为0.05～0.1％甲酸水溶液；流动相B为0.05～0.1％甲酸乙腈溶液；流动相A和流动相B中甲酸的浓度分别独立的例如可以为但不限于为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。优选地，按照体积百分比计，流动相A为0.07％甲酸水溶液；流动相B为0.07％甲酸乙腈溶液。
梯度洗脱程序优选如下：
时间0min，流动相A 20％，流动相B 80％；
时间3min，流动相A 23％，流动相B 77％；
时间4min，流动相A 40％，流动相B 60％；
时间5min，流动相A 37％，流动相B 63％；
时间15min，流动相A 33％，流动相B 67％；
时间17min，流动相A 5％，流动相B 95％；
时间20min，流动相A 5％，流动相B 95％；
时间22min，流动相A 20％，流动相B 80％。
色谱柱优选使用岛津C18 5μm 4.6×150mm，柱温优选为35～45℃，优选为45℃。
高效液相色谱法中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的吸收波长优选为264nm；内标吸收波长优选为275nm。
本发明提供的血清中25-羟基维生素D的检测方法能够同时测定人体血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，具有灵敏度高，重复性好，准确性高等特点。该方法25-羟基维生素D2线性范围为7～100ng/mL，25-羟基维生素D3线性范围为7～100ng/mL，相关系数r均≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤20％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；准确度的相对偏差(B)≤±15％，加标回收率为80％～120％。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
表1试剂
表2仪器与设备
| 仪器名称 | 型号 | 品牌 |
| 液相色谱分析仪 | LC 2300 | 睦仪 |
| 旋涡混匀仪 | G560E | VORT |
| 高速冷冻离心机 | D3024R | 大龙兴创 |
| 96孔板振荡器 | MB100-4A | 杭州奥盛 |
| 96孔板振荡器 | MB100-4A | 杭州奥盛 |
| 100μL移液器 | 10-100μL | eppendorf |
| 200μL移液器 | 20-200μL | eppendorf |
| 1000μL移液器 | 100-1000μL | eppendorf |
| 万分之一天平 | XSR104/A | 梅特勒-托利多 |
| 超声波提取仪 | KQ-400E | 昆山超声波 |
1.维生素D标准品及质控品配制：
1.1储备液配制：
25-羟基维生素D3储备液配制：购置的25-羟基维生素D3(BePure)具有准确的质量，无需称量，准确移取1mL甲醇，超声至25-羟基维生素D3完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D3储备液，转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存。
25-羟基维生素D2储备液配制：购置的25-羟基维生素D2(BePure)具有准确的质量，无需称量，准确移取1mL甲醇，超声至25-羟基维生素D2完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D2储备液，转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存。
25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2次级储备液配制：移取25-羟基维生素D3储备液配制及25-羟基维生素D2储备液各1mL，置于同一个10mL棕色容量瓶，加甲醇至刻度线，配制成100μg/mL浓度的次级储备液，贴标签，-20℃保存。
1.2校准品S1至S6储备液的配制
校准品S6储备液配制：校准品用100μL移液枪准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各100μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成1000ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S5储备液配制：校准品用100μL移液枪准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各80μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成800ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S4储备液配制：校准品用100μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各50μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成500ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S3储备液配制：校准品用100μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3和20μL 25-羟基维生素D2储备液各20μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成200ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S2储备液配制：校准品用10μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各10μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成100ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S1储备液配制：校准品用10μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各7μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成70ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
校准品S1～S6储备液在使用时使用含有1％牛血清蛋白的PBS缓冲液稀释10倍至工作浓度。
1.3质控品配制
低浓度质控品QCL储备液配制：校准品用100μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各20μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成200ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
高浓度质控品QCH储备液配制：校准品用100μL移液枪分别准确移取25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2次级储备液各80μL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成800ng/mL标准品，贴标签，-20℃保存。
低浓度质控品QCL储备液和高浓度质控品QCH储备液在使用时使用含有1％牛血清蛋白的PBS缓冲液稀释10倍至工作浓度。
2.沉淀剂配制
室温条件下，用万分之一天平精密称取硫酸铵75.4g，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，加入屈臣氏水，溶解后继续加水至刻度线，配制成饱和硫酸铵溶液。
3.样本萃取剂配制
3.1样本萃取剂储备液配制：用十万分之一天平精确称取20mg月桂基苯甲酮，精确至0.01mg，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至50.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至月桂基苯甲酮完全溶解后，加甲醇定容至刻度线，得400μg/mL的月桂基苯甲酮储备液，转移至60mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。
3.2样本萃取剂配制：精确移取0.25mL月桂苯甲酮储备液，加入100mL容量瓶中，加入乙腈至刻度线，配制成1μg/mL样本萃取剂。
4.流动相配制
流动性A液配制：用量筒准确移取1000mL水，加入700μL甲酸溶液，混匀超声脱气，待用。
流动相B液配制：用量筒准确移取1000mL色谱级乙腈，加入700μL甲酸溶液，混匀超声脱气，待用。
5.稀释液配制
5.1 PBS稀释液配制：量取10mL 10×PBS于100mL的容量瓶中，再加入纯水至刻度线，混合均匀，得到1×PBS，转移至玻璃容器瓶待用。
5.2 1％BSA配制：称取1g BSA，精确至0.0001g放入玻璃容器瓶中，加入100mLPBS稀释液，盖上瓶盖，上下震荡至BSA完全溶解。
实施例1
本实施例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，包括对样品进行前处理，然后对经前处理的样品进行高效液相色谱分析。
前处理过程如下，其中沉淀剂为饱和硫酸铵溶液，萃取剂为1μg/mL的月桂基苯甲酮乙腈溶液。
1)加校准品、质控品溶液：精密移取40μL校准品、质控品溶液，分别加入到2mL离心管中；
2)加稀释液：精密移取360μL稀释液，分别加入到以上对应的离心管中；
3)加血清样本：精密移取400μL的血清样本，分别加入到2mL离心管中；
4)加沉淀剂：精密移取500μL沉淀剂，分别加入到以上对应的2mL离心管中；
5)加样本萃取剂：精密移取400μL样本萃取剂，分别加入到以上对应的2mL离心管中。
6)震荡：盖上离心管盖，置于2mL涡旋混匀仪上，3000rpm充分震荡1min；
7)离心并转移：于4℃、10000rpm离心10min。离心后用移液枪移取200μL的上清液置于96孔U型板中；
8)检测：将96孔板置于LC中，进行检测。
高效液相色谱条件如下：
表3
洗脱程序：
表4
| 时间(min) | 流速mL/min | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 1 | 20 | 80 |
| 3 | 1 | 23 | 77 |
| 4 | 1 | 40 | 60 |
| 5 | 1 | 37 | 63 |
| 15 | 1 | 33 | 67 |
| 17 | 1 | 5 | 95 |
| 20 | 1 | 5 | 95 |
| 22 | 1 | 20 | 80 |
效果例1
1.前处理方法选择：
1.1沉淀剂的选择：
分别选用饱和硫酸钠，氯化钠，硫酸铵作为蛋白沉淀剂，与乙腈结合对血清中维生素D进行盐析辅助萃取，其余实验步骤和实验条件同实施例1。结果如图1所示，图1中1号表示使用硫酸铵作为沉淀剂对血清进行处理，2号表示使用氯化钠作为盐析剂对血清进行处理，3号表示使用硫酸钠作为盐析剂对血清进行处理，从图1中看出，使用硫酸铵或者硫酸钠作为盐析剂，可以与乙腈分层，但是氯化钠无法实现分层。
对分别使用硫酸铵和硫酸钠沉淀的样本进行色谱分析，同时添加S1作为参考，结果如表5所示。使用硫酸钠和硫酸铵作为蛋白沉淀剂，与乙腈结合后，能很好的进行液液分层，用氯化钠无法起到分层作用。硫酸铵在水中的溶解度不易随着温度变化而变化，对运输，储存带来极大的方便。
表5
1.2.萃取剂的选择：
使用饱和硫酸铵作为蛋白沉淀剂，分别采用甲醇，乙腈，及乙醇作为萃取剂，对血清中的维生素D进行萃取，其余实验步骤和实验条件同实施例1。结果如图2所示，其中A代表的是用硫酸铵沉淀蛋白后加入甲醇作为萃取剂，B表示的是用硫酸铵沉淀蛋白后加入乙腈作为萃取剂，C表示用硫酸铵沉淀蛋白后加入乙醇作为萃取剂，从图中可看出甲醇与乙醇的加入，并不能有很好的分层效果。
2.色谱条件选择：
2.1.流动相选择：
按照实施例1提供的检测方法检测样本，结果如图3所示，实施例1采用的洗脱程序能将杂质与目标物分开。
按实施例1提供的样品前处理方式处理样本，分别选用乙腈和纯水作为流动相A与流动相B，按下表所示梯度方式进行洗脱，其余实验步骤和实验条件同实施例1，进行检测。结果如图4所示，以表6方式进行洗脱，在VD2附近有杂峰出现。
表6洗脱梯度
| 时间(min) | 流速mL/min | 流动相A | 流动相B |
| 0.0 | 1 | 45.0 | 55.0 |
| 5.0 | 1 | 30.0 | 70.0 |
| 16.0 | 1 | 30.0 | 70.0 |
| 16.1 | 1 | 0.0 | 100.0 |
| 19.0 | 1 | 0.0 | 100.0 |
| 19.1 | 1 | 45.0 | 55.0 |
| 20.0 | 1 | 45.0 | 55.0 |
2.2色谱柱选择：
分别选用岛津C18 5μm 4.6×150mm和其他类型C18 5μm 4.6×100mm(酝博C18柱)，对血清中维生素D2及维生素D3进行检测。结果显示，用酝博C18柱在梯度条件下，25-羟基维生素D2附近出现干扰峰。结果如图5所示。
2.3波长选择：
参考不同文献，并使用HPLC-DAD法对25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，及内标进行检测，通过波长扫描，确认最佳吸收波长，25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的最佳吸收波长为264nm，内标最佳吸收波长为275nm。
效果例2
线性范围
1.验证方法：按照实施例1提供的高通量检测人体血清中维生素D含量描述的样品处理方法处理待测产品校准品S1～S6溶液，每个浓度重复测试3次。参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数R^2应≥0.990。
r：线性回归相关系数；
xi：S1～S6的浓度；
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值。
2.接受标准：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数r均≥0.990。
3.实验结果：
线性范围：维生素D2/D3:7ng/mL～100ng/mL。
表7
4.结论：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数R^2均≥0.990，满足接受标准。
效果例3重复性测试数据
1.验证方法：使用已配制好的质控品，按照实施例1提供的高通量检测人体血清中维生素D含量的高效液相色谱法，每个样本重复测定10次。可参考公式计算重复性的变异系数(CV)，低值质控品CV≤20％，高值质控品CV≤15％。
CV：重复性的变异系数；
10次测量结果的平均值；
S：10次测量结果的标准差。
2.接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％。
3.实验结果
表8
4.结论：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
效果例4 HPLC血样精密度结果评价
1.实验流程
混合低、中、高三个不同浓度的血样，低浓度样本25-羟基维生素D3含量小于15ng/mL；中浓度样本25-羟基维生素D3含量大于15ng/mL并且小于30ng/mL；高浓度样本25-羟基维生素D3含量大于30ng/mL或25-羟基维生素D2含量大于7ng/mL。在其中分别加入25羟基维生素D2标准品，使得低、中、高浓度混合血样的25-羟基维生素D2含量为分别为10ng/mL，20ng/mL，30ng/mL。连续测试5天，每天每个浓度平行处理5份，分别计算5天测试含量的平均值、批内差和批间差。
2.实验结果：
表9 25-羟基维生素D3批内和批间精密度评价结果
表10 25羟基维生素D2批内和批间精密度评价结果
3.实验小结：表9和表10的结果显示，HPLC测试相同血样的25-羟基维生素D2/D3的批间批内精密度RSD均≤15％，批内批间精密度评价满足方法学要求。
效果例5HPLC基质效应结果评价
1.实验流程
处理混合血样和BSA基质样本，前处理后，在BSA基质样本和3份混合血样中分别加入相同浓度的标准品，在1份混合血样中加入甲醇溶液，并计算出25-羟基维生素D2/D3的含量，计算出基质效应。
2.实验结果：
表11 VD3基质效应结果
表12 VD2基质效应结果
3.实验小结
表11和表12的结果显示，HPLC测试相同血样的25-羟基维生素D2/D3的基质效应均≤±15％，基质效应评价满足方法学要求。
效果例6血样干扰评价
1.实验流程
利用25-羟基维生素D2/D3和干扰样本进行实验，观察干扰物在目标峰的保留时间是否出峰，其中干扰物种类和浓度如表13所示。
表13干扰物名称及其浓度
| 干扰物中文名称 | 干扰物浓度 |
| 维生素D2 | 750ng/mL |
| 维生素D3 | 750ng/mL |
| 去氢胆酸 | 150μg/mL |
| 甘油三酯 | 24mg/mL(37mmol/L) |
| 胆红素 | 0.2mg/mL(342mmol/L) |
| 牛血红蛋白 | 2mg/mL |
| 胆固醇 | 5mg/mL(13mmol/L) |
2.实验结果：
图6中蓝色为标准品，红色为维生素D2/D3干扰物；绿色为去氢胆酸、甘油三酯干扰物；紫色为牛血红蛋白、胆固醇干扰物；深绿色为胆红素干扰物。
3.实验小结
结果显示HPLC上测试相25羟基维生素D2/D3，上述干扰均在目标峰保留时间没有出峰(以谱图显示测试结果)，满足方法学要求。
效果例7加标回收率
1.验证方法：
1.1血清样本本底测试：取两种不同的混血，分别取400μL血清各4个，按照实施例1提供的高通量检测人体血清中维生素D含量的高效液相色谱法使用已配制好的校准品测试血清中25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2本底含量。
1.2加标样本配制：取360μL的混合血清样本，分别加入浓度为10ng/mL，20ng/mL，30ng/mL的低、中、高三种水平的25-羟基维生素D2/D3的标准品40μL，待用。
1.3按照实施例1提供的高通量检测人体血清中维生素D含量的高效液相色谱法使用已配制好的校准品测试血清加标后的样本。
2.接受标准：加标回收率80％～120％。
3.测试结果如表14所示，25-羟基维生素D3的加标回收率为100％～118％，25-羟基维生素D2的回收率为100％～118％均在范围内，满足要求。
表14
4.结论：25-羟基维生素D3/D2的加标回收率均在范围内，满足要求。
效果例8实际样本检测数据
按照实施例1提供的高通量检测人体血清中维生素D含量的高效液相色谱法使用已配制好的校准品测试实际人血样本50例，数据如下。
表15
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (14)
1.血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；
所述检测方法包括采用高效液相色谱法分析经前处理的样本；所述高效液相色谱法中内标采用月桂基苯甲酮；
所述前处理包括先向样本中加入沉淀剂，然后加入萃取剂，震荡后离心，转移上清液进行高效液相色谱法分析；
所述沉淀剂为无机盐的水溶液，所述无机盐选自硫酸铵或硫酸钠；所述萃取剂为月桂基苯甲酮的乙腈溶液；
高效液相色谱采用梯度洗脱，按照体积百分比计，流动相A为0.05~0.1%甲酸水溶液；流动相B为0.05~0.1%甲酸乙腈溶液；
梯度洗脱程序为：
时间0 min，流动相A 20%，流动相B 80%；
时间3 min，流动相A 23%，流动相B 77%；
时间4 min，流动相A 40%，流动相B 60%；
时间5 min，流动相A 37%，流动相B 63%；
时间15 min，流动相A 33%，流动相B 67%；
时间17 min，流动相A 5%，流动相B 95%；
时间20 min，流动相A 5%，流动相B 95%；
时间22 min，流动相A 20%，流动相B 80%；
高效液相色谱采用色谱柱：C18 5μm 4.6×150mm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本包括待测血清样本和对照品样本，所述对照品样本包括校准品工作液和/或质控品工作液；以BSA作为人血清的替代基质配制校准品工作液和质控品工作液。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，用于配制对照品样本的稀释液按照质量百分比计，为含有1~5%牛血清蛋白的PBS缓冲液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，按照质量百分比计，所述稀释液为含有1%牛血清蛋白的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述沉淀剂为饱和硫酸铵水溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，月桂基苯甲酮的浓度为0.8~1.2μg/mL。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，月桂基苯甲酮的浓度为1μg/mL。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述校准品工作液包括校准品S1~S6，其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
校准品S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 7 ng/mL；
校准品S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 10 ng/mL；
校准品S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20 ng/mL；
校准品S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 50 ng/mL；
校准品S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80 ng/mL；
校准品S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 100 ng/mL。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质控品工作液包括低值质控品工作液和高值质控品工作液；其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的目标浓度如下：
低值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 20ng/mL；
高值质控品工作液：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 80ng/mL。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，按照体积百分比计，流动相A为0.07%甲酸水溶液；流动相B为0.07%甲酸乙腈溶液。
11. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱采用色谱柱：岛津C185μm 4.6×150mm。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，柱温为35~45℃。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，柱温为45℃。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的吸收波长为264nm；内标吸收波长为275nm。
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