CN110763788A - 一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法。本发明试剂盒包括脂溶性维生素校准品、同位素混合标准品、脂溶性维生素质控品、仪器质控品、流动相添加剂。本发明采用固相支撑液液萃取法并适配自动移液站，极大的简化了样本前处理方法，结合液相色谱串联质谱法实现了高通量、快速的同时精准检测5种脂溶性维生素的目标。本发明在检测外周血血浆样本时，大约仅需250微升血浆样本就可一次性定量5种脂溶性维生素，且由于前处理方法简单快捷，节省操作时间，根据这些指标能有效诊断和检测人体中脂溶性维生素的含量，及时预防和诊断脂溶性维生素缺乏或过量带来的疾病。因此，本发明在临床、健康检查和科研中具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法。
背景技术
脂溶性维生素是食品中天然存在的微量营养素，为人体提供和维持必需的和广泛的生理生化功能。为满足人体健康和代谢需求，脂溶性维生素必须从日常饮食中获取。脂溶性维生素溶于有机溶剂而不溶于水的一类维生素，包括维生素A、维生素D、维生素E及维生素K1。
维生素D又称钙化醇、抗佝偻病维生素，是类固醇衍生物，在人体内主要以25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的形式存在，是维持正常的钙、磷代谢，因而对骨骼的正常发育有极重要的作用；维生素A又称视黄醇，可促进细胞的增殖和生长，保护各器官上皮组织结构的完整和健康，维持正常视力；维生素E又称生育酚、抗不育维生素，参与脂肪的代谢，维持内分泌的正常机能，使性细胞正常发育，提高繁殖性能；维生素K1即叶绿基甲萘醌，简称叶绿醌，是凝血维生素。在人体内维持血液正常凝固所必须的物质，参与蛋白质谷氨酸残基的γ-羧化。
通过生物样本(如血浆)的分析以评估一个人的营养状况，从而确定其自身的生理或病理状况。然而，对于脂溶性维生素来说，由于其本身的特点，摄入不足时会导致营养缺乏症，而摄入过量又会引起中毒。另外，脂溶性维生素的每一个种类都拥有不同的构型和活性，以及在生物样本中浓度的不同。这一系列的限制和困难以及对疾病诊断的需求，就促使针对单一或者多个脂溶性维生素检测方法的开发和发展。
目前，脂溶性维生素检测的主要方法为酶联免疫分析法、化学免疫发光法、液相色谱法(HPLC)、液相串联质谱法(LC-MS/MS)等。在免疫法测定分析物的过程中，所使用的抗体也可识别其他维生素的衍生物，且通常抗原抗体的反应无法达到100％。因此，此方法结果差异性较大，特异性较差，在应用于临床检测时的可靠性较差，特别是针对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于其检测限的限制，仅针对于含量较高的维生素测定或单一维生素的测定。
国内现有的试剂盒主要针对于单一的脂溶性维生素，没有针对于多种脂溶性维生素共同检测的试剂盒，且检测方法选择性差。对于现有脂溶性维生素检测方法来说，主要使用蛋白沉淀法与液相萃取法进行样本前处理，耗时时间长，操作繁琐，对人员技术要求高，无法配合自动化使用。
发明内容
为了克服现有试剂盒的不足，本发明旨在提供一种用于液相色谱串联质谱法的高通量、快速的同时精准检测5种脂溶性维生素的技术方法。
第一方面，本发明要求保护一种定量检测血浆中多种脂溶性维生素的试剂盒。
本发明所提供的定量检测血浆中多种脂溶性维生素的试剂盒，包括脂溶性维生素校准品、同位素混合标准品、脂溶性维生素质控品、仪器质控品、流动相添加剂。
所述脂溶性维生素校准品包括(或为)系列浓度已知的由50％甲醇(体积百分含量)溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌混合溶液。
进一步地，所述脂溶性维生素校准品由如下9种溶液组成：
(1)脂溶性维生素校准品(Cal0)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(0.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.0ng/ml)、25羟基维生素D3(0.0ng/ml)、α-生育酚(0.0ng/ml)和叶绿醌(0.0ng/ml)；
(2)脂溶性维生素校准品(Cal1)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(20.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.2ng/ml)、25羟基维生素D3(1.0ng/ml)、α-生育酚(200.0ng/ml)和叶绿醌(0.2ng/ml)；
(3)脂溶性维生素校准品(Cal2)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(50.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.5ng/ml)、25羟基维生素D3(2.5ng/ml)、α-生育酚(500.0ng/ml)和叶绿醌(0.5ng/ml)；
(4)脂溶性维生素校准品(Cal3)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(100.0ng/ml)、25羟基维生素D2(1.0ng/ml)、25羟基维生素D3(5.0ng/ml)、α-生育酚(1000.0ng/ml)和叶绿醌(1.0ng/ml)；
(5)脂溶性维生素校准品(Cal4)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(200.0ng/ml)、25羟基维生素D2(2.0ng/ml)、25羟基维生素D3(10.0ng/ml)、α-生育酚(2000.0ng/ml)和叶绿醌(2.0ng/ml)；
(6)脂溶性维生素校准品(Cal5)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(500.0ng/ml)、25羟基维生素D2(5.0ng/ml)、25羟基维生素D3(25.0ng/ml)、α-生育酚(5000.0ng/ml)和叶绿醌(5.0ng/ml)；
(7)脂溶性维生素校准品(Cal6)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(800.0ng/ml)、25羟基维生素D2(8.0ng/ml)、25羟基维生素D3(40.0ng/ml)、α-生育酚(8000.0ng/ml)和叶绿醌(8.0ng/ml)；
(8)脂溶性维生素校准品(Cal7)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(1000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(10.0ng/ml)、25羟基维生素D3(50.0ng/ml)、α-生育酚(10000.0ng/ml)和叶绿醌(10.0ng/ml)；
(9)脂溶性维生素校准品(Cal8)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(2000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(20.0ng/ml)、25羟基维生素D3(100.0ng/ml)、α-生育酚(20000.0ng/ml)和叶绿醌(20.0ng/ml)。
所述同位素混合标准品包括(或为)含量已知的视黄醇-d5、25羟基维生素D2-d6、25羟基维生素D3-d3、α-生育酚-d6、叶绿醌-d7的混合干粉。
其中，所述同位素混合标准品中，五种同位素的配比为“视黄醇-d5 0.53625μg：25羟基维生素D2-d6 0.06435μg：25羟基维生素D3-d3 0.32175μg：α-生育酚-d6 0.32175μg：叶绿醌-d7 0.06435μg”。
所述脂溶性维生素质控品包括(或为)浓度已知的由混合血浆溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌混合溶液。
其中，所述脂溶性维生素质控品中，各个分析物浓度为：视黄醇(458.6±127.8ng/ml)、25羟基维生素D2(5.83±3.67ng/ml)、25羟基维生素D3(26.1±12.99ng/ml)、α-生育酚(11331.2±5342.6ng/ml)和叶绿醌(6.24±1.42ng/ml)。
所述仪器质控品包括(或为)浓度已知的由80％乙腈+0.1％甲酸溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液。
其中，所述仪器质控品中，各个分析物浓度为：视黄醇(1000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(10.0ng/ml)、25羟基维生素D3(50.0ng/ml)、α-生育酚(10000.0ng/ml)和叶绿醌(10.0ng/ml)。
所述流动相添加剂是甲酸。
进一步地，所述试剂盒中还可含有SLE板(如96孔SLE板)。更进一步地，所述试剂盒中还可含有深孔板(如2ml 96孔深孔板)、微孔板(如350μL 96孔微孔板)、过滤板(如96孔过滤板)和热封铝膜。
其中，所述深孔板是前处理过程中使用的，一共用两块板。所述微孔板是上机检测时使用的。所述过滤板是将复溶后液体加入所述过滤板，将所述过滤板与所述微孔板上下组合，放置于离心机离心，这一过程中使用的，目的是将复溶液中的沉淀去除。
另外，所述试剂盒中还可含有操作说明书；所述操作说明书上记载有如下第二方面中所述的方法。
第二方面，本发明要求保护一种定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量的方法。
本发明所提供的定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量的方法，可包括如下步骤：
(a)配制稀释剂、萃取剂和复溶液；
所述稀释剂按照包括如下步骤的方法配制：向前文所述的同位素混合标准品中加入甲醇复溶，得到中间溶液I；然后将所述中间溶液I与50％异丙醇(体积百分含量)混合，即得所述稀释剂；
所述萃取剂为正己烷；
所述复溶液按照包括如下步骤的方法配制：将乙腈与去离子水混合，得到中间溶液II；然后将所述中间溶液II与甲酸混合，即得所述复溶液；
(b)将所述稀释剂与待测血浆样本混合后，将所得混合液转移至前文所述的SLE板中，静置后加入所述萃取剂进行萃取，得到含有脂溶性维生素的萃取液；
(c)用氮气将所述萃取液吹干后用所述复溶液进行复溶，然后经超声、过滤后得到待上机待测样品；
(d)用液相色谱串联质谱仪对所述待上机待测样品和待上机标准品分别进行检测，根据检测结果得出所述待测血浆样本中多种脂溶性维生素的含量；
所述待上机标准品为将前文所述的脂溶性维生素校准品替代步骤(b)和(c)中的所述待测血浆样本后，按照步骤(b)和(c)进行操作后获得的。
进一步地，步骤(a)中，在配制所述稀释剂的过程中，所述同位素混合标准品与所述甲醇的配比可为1.30845μg：1.3mL。所述中间溶液I与所述50％异丙醇的体积比可为122μL：50mL。
进一步地，步骤(a)中，在配制所述复溶液的过程中，所述乙腈与所述水的体积比可为80ml:20ml。所述中间溶液II与所述甲酸的体积比可为1000:1。
进一步地，步骤(b)中，将所述稀释剂与所述待测血浆样本混合时两者的体积比可为1:1。将所述混合液转移至所述的SLE板中后静置时间可为15min。
进一步地，步骤(b)中，用所述萃取剂进行两次萃取，每次萃取时加入所述萃取剂体积为750μL，每次加入所述萃取剂后静置5分钟；之后还可包括使用正压仪压干1分钟的步骤。用所述复溶液进行复溶时所述复溶液的用量须为80μL(根据上机前样本用量来确定复溶液用量，上机时的最少用量为40μL，因此为保证拥有充足的上机溶液体积，复溶液确定为80μL)。
进一步地，步骤(d)中，对所述待上机待测样品和所述待上机标准品进行检测时采用的液相色谱条件可为如下：色谱柱为C18色谱柱(50mm×2.1mm)；流动相为流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A是将水和前文所述流动相添加剂按照体积比1000:1的比例混合后制得的；所述流动相B是将甲醇、乙腈和前文所述流动相添加剂按照体积比500:500:1的比例混合后制得的；所述梯度洗脱为：0-0.5min(含端点)，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为6：4；0.5-1.5min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比由6:4向2:8匀速等梯度变化；1.5-2.5min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A与所述流动相B的体积比由2:8向0:10匀速等梯度变化；2.5-4.5min(不含左端点，含右端点)，保持所述流动相为所述流动相B；4.5-4.6min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A与所述流动相B的体积比由0:10向6:4匀速等梯度变化；4.6-5min(不含左端点，含右端点)，保持所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为6:4。
在本发明的具体实施方式中，对所述待上机待测样品和所述待上机标准品进行检测时采用的是超高效液相色谱，具体采用的是Waters ACQUITY I-class UPLC液相系统。
进一步地，步骤(d)中，对所述待上机待测样品和所述待上机标准品进行检测时采用的质谱条件可如下：质谱：三重四级杆质谱，使用APCI离子源阳离子模式检测；离子源参数为毛细管电压：3000V；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气：150L/H；脱溶剂气：1000L/H；离子对信息如下：5种化合物各个离子对的驻留时间均为0.08秒，锥孔电压均10伏；视黄醇：269.1>93.1，碰撞能量20eV；269.1>105.0，碰撞能量30eV；269.1>119.2，碰撞能量15eV。25羟基维生素D2：395.2>119.4，碰撞能量20eV；395.2>269.3，碰撞能量20eV。25羟基维生素D3：383.4>211.1，碰撞能量25eV；383.4>229.2，碰撞能量20eV。α-生育酚：431.4>137.3，碰撞能量30eV；431.4>165.2，碰撞能量50eV。叶绿醌：451.4>187.1，碰撞能量25eV；451.4>199.2，碰撞能量25eV；451.4>227.0，碰撞能量25eV。
在本发明的具体实施方式中，对所述待上机待测样品和所述待上机标准品进行检测时采用的是质谱仪为Waters Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪。
更进一步地，所述液相色谱条件中的柱温可为45℃；样品池温度可为8℃；进样体积可为10μL；洗脱时的流速可为0.5ml/min；流速曲线为6。其中，流速曲线是指在流动相洗脱过程中，所述流动相A和所述流动相B的比例变化方式，6是指匀速等梯度变化。这个名词是本领域公知。
进一步地，步骤(d)中，所述“根据检测结果得出所述待测血浆样本中多种脂溶性维生素的含量”的方法，具体可包括如下步骤：
(d1)标准曲线的绘制：以所述脂溶性维生素校准品中脂溶性维生素的赋值浓度为横坐标，检测后的所述脂溶性维生素校准品中相应脂溶性维生素的峰面积与所述同位素混合标准品(内标)中相应脂溶性维生素的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，并得出相应脂溶性维生素的校准方程(方程中X为浓度，Y为峰面积比值)；
(d2)多种脂溶性维生素含量的计算：根据校准方程，将所述待测血浆样本的检测结果中的分析物的峰面积与所述同位素混合标准品(内标)中相应脂溶性维生素的峰面积比值带入所述校准方程，通过计算得出所述待测血浆样本中相应脂溶性维生素的浓度。
另外，所述方法中的步骤(b)可采用自动化移液工作站自动完成。所述方法中还可包括采用前文所述的仪器质控品检测所述液相色谱串联质谱仪设备稳定性的步骤(仪器质控品的主要作用是用于检测当前质谱仪的稳定性是否合格。仪器质控品不经过前处理步骤，直接上机检测)。所述方法中还可包括采用前文所述的脂溶性维生素质控品检测所述脂溶性维生素前处理及检测方法稳定性的步骤(脂溶性维生素质控品是随着脂溶性维生素校准品和待测血浆样本一起进行前处理流程，之后再跟随样本一起进行上机检测。主要作用是保证前处理方法和检测方法的稳定性和准确性)。
第三方面，本发明要求保护一种基于液相色谱串联质谱仪法定量检测血浆中脂溶性维生素含量时对待测血浆样本进行前处理的方法。
本发明所提供的基于液相色谱串联质谱仪法定量检测血浆中脂溶性维生素含量时对待测血浆样本进行前处理的方法，具体可包括前文第二方面所述方法中的步骤(a)和步骤(b)。
其中，所述脂溶性维生素可为如下五种中的任一种或多种：视黄醇，25羟基维生素D2，25羟基维生素D3，α-生育酚和叶绿醌。
第四方面，本发明要求保护如下任一所示应用：
(A1)前文所述的试剂盒在定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量中的应用；
(A2)前文第三方面所述方法在定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量中的应用。
在第一至第四方面中，所述多种脂溶性维生素为5种脂溶性维生素。进一步地，所述5种脂溶性维生素均分别为视黄醇，25羟基维生素D2，25羟基维生素D3，α-生育酚和叶绿醌。
本发明所提供的试剂盒应用LC-MS/MS方法快速精准的检测人血浆中5种脂溶性维生素的含量。与现有的试剂盒相比，本发明比国内外同等类型试剂盒更具有优势，通过优化后样本前处理固相支撑液液萃取方法(SLE方法)与分析方法，极大的简化了样本前处理方法，使用SLE方法代替液液萃取方法中反复震荡的方式及蛋白沉淀方法中上清液提取困难的方式，极大的降低了前处理的难度，缩短了前处理时间。另外，本发明试剂盒方法可以适配自动化移液工作站以避免了人员操作带来的误差，进一步的提升通量和精度。在样本分析阶段使用液相色谱串联质谱分析技术，能够快速、同时定量血浆中5种脂溶性维生素，具有高通量、高时效的特点。再有，本发明在检测外周血制备而成的血浆样本时，仅需250微升血液样本就可以一次性定量5种脂溶性维生素，且由于前处理方法简单快捷，节省了操作时间，根据这些指标能够有效的诊断和检测人体中脂溶性维生素的含量，及时的预防和诊断脂溶性维生素缺乏或过量带来的疾病。因此，本发明在临床、健康检查和科研中具有极高的应用价值。
附图说明
图1为脂溶性维生素校准品Cal8浓度中5种脂溶性维生素的色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及检测方法
一、定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒的组成
本发明提供的脂溶性维生素SLE检测方法检测的指标包括：视黄醇，25羟基维生素D2，25羟基维生素D3，α-生育酚和维生素K1。
本发明中提供的人血浆中5种脂溶性维生素快速检测试剂盒组成如表1所示。
表1本发明定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒的组成
注：表中标注为Set A的是指试剂盒中可以常温放置的部分，Set B指试剂盒中必须-20℃保存的部分。
表1中，所述脂溶性维生素校准品为系列已知浓度的由50％甲醇(体积百分含量)溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌混合溶液。配制时，先准确称量各个分析物标准品后，分别使用50％甲醇溶解配制成单一标准品溶液。之后按照最终混合标准品溶液浓度将各个单一标准品混合即成。具体由如下9种溶液组成：
(1)脂溶性维生素校准品(Cal0)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(0.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.0ng/ml)、25羟基维生素D3(0.0ng/ml)、α-生育酚(0.0ng/ml)和叶绿醌(0.0ng/ml)；
(2)脂溶性维生素校准品(Cal1)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(20.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.2ng/ml)、25羟基维生素D3(1.0ng/ml)、α-生育酚(200.0ng/ml)和叶绿醌(0.2ng/ml)；
(3)脂溶性维生素校准品(Cal2)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(50.0ng/ml)、25羟基维生素D2(0.5ng/ml)、25羟基维生素D3(2.5ng/ml)、α-生育酚(500.0ng/ml)和叶绿醌(0.5ng/ml)；
(4)脂溶性维生素校准品(Cal3)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(100.0ng/ml)、25羟基维生素D2(1.0ng/ml)、25羟基维生素D3(5.0ng/ml)、α-生育酚(1000.0ng/ml)和叶绿醌(1.0ng/ml)；
(5)脂溶性维生素校准品(Cal4)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(200.0ng/ml)、25羟基维生素D2(2.0ng/ml)、25羟基维生素D3(10.0ng/ml)、α-生育酚(2000.0ng/ml)和叶绿醌(2.0ng/ml)；
(6)脂溶性维生素校准品(Cal5)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(500.0ng/ml)、25羟基维生素D2(5.0ng/ml)、25羟基维生素D3(25.0ng/ml)、α-生育酚(5000.0ng/ml)和叶绿醌(5.0ng/ml)；
(7)脂溶性维生素校准品(Cal6)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(800.0ng/ml)、25羟基维生素D2(8.0ng/ml)、25羟基维生素D3(40.0ng/ml)、α-生育酚(8000.0ng/ml)和叶绿醌(8.0ng/ml)；
(8)脂溶性维生素校准品(Cal7)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(1000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(10.0ng/ml)、25羟基维生素D3(50.0ng/ml)、α-生育酚(10000.0ng/ml)和叶绿醌(10.0ng/ml)；
(9)脂溶性维生素校准品(Cal8)：视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的终浓度分别为：视黄醇(2000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(20.0ng/ml)、25羟基维生素D3(100.0ng/ml)、α-生育酚(20000.0ng/ml)和叶绿醌(20.0ng/ml)。
所述同位素混合标准品为视黄醇-d5、25羟基维生素D2-d6、25羟基维生素D3-d3、α-生育酚-d6、叶绿醌-d7的混合干粉。这些名称均为物质的同位素称呼，均为行业内公认。前面是分析物名称，后面的同位素标记的原子，d指氢原子的同位素氘(比正常氢原子多了一个中子)，d后面的数字指被标记的氢原子数量。这五种同位素混合干粉是现将5种同位素分析物配制成混合溶液，之后将按体积溶液分装后，冷冻干燥即可。每瓶同位素混合干粉中各个分析物含量约为：视黄醇-d5:0.53625μg、25羟基维生素D2-d6：0.06435μg、25羟基维生素D3-d3：0.32175μg、α-生育酚-d6：0.32175μg、叶绿醌-d7：0.06435μg。
所述脂溶性维生素质控品是由混合血浆溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌混合溶液。其中，各个分析物浓度为：视黄醇(458.6±127.8ng/ml)、25羟基维生素D2(5.83±3.67ng/ml)、25羟基维生素D3(26.1±12.99ng/ml)、α-生育酚(11331.2±5342.6ng/ml)和叶绿醌(6.24±1.42ng/ml)。混合血浆使用的是招募的志愿者抽血后分离血浆混合而成。对志愿者及血液各方面无要求。
所述仪器质控品为由80％乙腈+0.1％甲酸溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液。其中，80％乙腈是由80％体积分数的乙腈混合20％体积分数的水。0.1％甲酸是在配制好80％乙腈溶液后，按溶液总体积的0.1％加入纯甲酸即可。仪器质控品是指先配制好80％乙腈+0.1％甲酸溶液，之后将Cal8稀释2倍即可。各个分析物的浓度等同于Cal7的浓度：视黄醇(1000.0ng/ml)、25羟基维生素D2(10.0ng/ml)、25羟基维生素D3(50.0ng/ml)、α-生育酚(10000.0ng/ml)和叶绿醌(10.0ng/ml)。
所述流动相添加剂是甲酸。
二、定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒的使用方法
本发明提供的使用上述快速定量检测血浆中五种脂溶性维生素的方法的主要步骤如下(即表1中操作说明书中所记载的内容)：
1、工作液配置：配制稀释剂、萃取剂和复溶液；
稀释剂按照包括如下步骤的方法配制：向同位素混合标准品瓶内(瓶内一共含有1.30845微克同位素混合标准品)加入1.3ml甲醇复溶，之后取122μL与50ml 50％异丙醇(体积百分含量，等体积的水和异丙醇混合)混合后配制成稀释剂。
萃取剂为正己烷。
复溶液按照包括如下步骤的方法配制：80ml乙腈与20ml去离子水混合后加入100μL甲酸混匀即可。
2、样本提取：
每个待测血浆样本、脂溶性维生素质控品(QC是质控品的英文简称，将试剂盒中的质控品取出与样本一起进行前处理，来保证处理方法和检测方法的稳定性和准确性)、脂溶性维生素校准品各取250μL加入对应的2ml 96孔深孔板内。将稀释剂按1:1体积比的比例加入样本混合后，将混合液转移至96孔SLE板内，静置15min，加入750μL萃取剂进行两次萃取，每次静置5分钟(即取750μL萃取液萃取，静置5min；静置结束后，再取750μL萃取液萃取，静置5min)。萃取后用正压仪将96孔SLE板内液体快速压入下方连接的2ml 96孔深孔板。使用氮吹仪将2ml 96孔深孔板内液体吹干。
3、复溶上机：
向吹干后的2ml 96孔深孔板内每个孔加入80μL复溶液。使用表1中的热封铝膜封口、涡旋、超声2分钟、离心。之后，将溶液转移至96孔过滤板。通过离心将滤液转移至96孔微孔板。至此，得到待上机待测样品(对应步骤2中的待测血浆)、待上机质控品(对应步骤2中的脂溶性维生素质控品)和待上机标准品(对应步骤2中的脂溶性维生素校准品)。
4、质谱上机检测：
配制流动相A：1000ml去离子水+1ml流动相添加剂。
配制流动相B：500ml甲醇+500ml乙腈+1ml流动相添加剂。
从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机来检测系统的稳定性(仪器质控品的主要作用是用于检测当前设备的运行稳定性)。
5、液相色谱条件：
超高效液相色谱：Waters ACQUITY I-class UPLC液相系统。
色谱柱：Waters BEH C18 1.7μm色谱柱(50mm×2.1mm)
柱温：45℃
样品池温度：8℃
进样体积：10μL
洗脱梯度如表2所示：
表2液相色谱洗脱梯度设置
梯度洗脱为：0-0.5min(含端点)，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为6：4；0.5-1.5min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比由6:4向2:8匀速等梯度变化；1.5-2.5min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A与所述流动相B的体积比由2:8向0:10匀速等梯度变化；2.5-4.5min(不含左端点，含右端点)，保持所述流动相为所述流动相B；4.5-4.6min(不含左端点，含右端点)，所述流动相中所述流动相A与所述流动相B的体积比由0:10向6:4匀速等梯度变化；4.6-5min(不含左端点，含右端点)，保持所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为6:4。
6、质谱条件：
质谱：Waters Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪，APCI离子源，阳离子模式检测。
离子源参数：毛细管电压：3000V；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气：150L/H；脱溶剂气：1000L/H。
离子对信息如表3所示：
表3质谱条件中的离子对信息
7、定量结果报告：
将350μL 96孔板放入自动进样器，采用液相色谱串联质谱进行检测，调用保存的质谱参数文件、液相参数文件和MRM方法文件对待测样本进行检测，通过质谱仪自带的数据分析软件自动得到各个分析物的浓度。检测原理如下：
(1)绘制标准曲线：以脂溶性维生素校准品中脂溶性维生素的赋值浓度为横坐标，质谱仪检测后的脂溶性维生素校准品中相应脂溶性维生素的峰面积与同位素混合标准品(内标)中相应脂溶性维生素的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，并得出相应脂溶性维生素的校准方程(方程中X为浓度，Y为峰面积比值)；
(2)计算测试样本中5种脂溶性维生素含量：根据校准方程，将待测血浆的检测结果中的分析物峰面积与相应的内标峰面积比值带入校准方程中的Y，通过计算得出的数值X即为血浆中脂溶性维生素的浓度。
上述步骤的具体操作应全部都在避光的条件下进行，尽可能避免分析物在光照下的降解。
三、本发明的液相色谱串联质谱检测用试剂盒与自动化移液工作站适配检测
按照如下方法对本公司生产中心提供的待测人血浆样本进行检测。
试剂材料：步骤一中所描述的试剂盒
样本：288例EDTA抗凝人血浆
检测方法：
1、工作液配置：配制稀释剂、萃取剂和复溶液；
稀释剂按照包括如下步骤的方法配制：向同位素混合标准品瓶内(瓶内一共含有1.30845微克同位素混合标准品)加入1.3ml甲醇复溶，之后取122μL与50ml 50％异丙醇(体积百分含量，将异丙醇和水等体积混合)混合后配制成稀释剂。
萃取剂为正己烷。
复溶液按照包括如下步骤的方法配制：80ml乙腈与20ml去离子水混合后加入100μL甲酸混匀即可。
配制好的稀释剂、萃取剂和复溶液一同置于自动化移液工作站内。
2、样本提取：
每个待测血浆样本、脂溶性维生素质控品(QC是质控品的英文简称，将试剂盒中的质控品取出与样本一起进行前处理，来保证处理方法和检测方法的稳定性和准确性)、脂溶性维生素校准品取250μL加入对应的2ml 96孔深孔板内。按照自动化移液工作站既定程序进行自动化样本提取(自动化移液工作站既定程序即为使用自动化程序代替人手操作的步骤，流程与之前人手操作的流程类似)。程序运行结束后，将96孔SLE板连同2ml 96孔深孔板从自动化移液站取出，用正压仪将96孔SLE板内溶液快速压出。使用氮吹仪将2ml 96深孔板内液体吹干。
3、复溶上机：
通过自动化移液站的复溶程序向每个孔内加入80μL复溶液(复溶程序与人手操作程序类似，目的都是移液，仅仅是操作方式不同)。使用表1中的热封铝膜封口、涡旋、超声2分钟、离心。之后，将溶液转移至96孔过滤板。通过离心将滤液转移至96孔微孔板。至此，得到待上机待测样品(对应步骤2中的待测血浆)、待上机质控品(对应步骤2中的脂溶性维生素质控品)和待上机标准品(对应步骤2中的脂溶性维生素校准品)。
4、质谱上机检测
同步骤二4。
5、液相色谱条件：
同步骤二5。
6、质谱条件：
同步骤二6。
7、定量结果报告：
将96孔板放入自动进样器，采用液相色谱串联质谱进行检测，采用设置好的程序对数据进行处理(参见步骤二7)，得到测试样本中5种脂溶性维生素的浓度。
8、结果
(1)脂溶性维生素校准品Cal8浓度中5种脂溶性维生素的色谱图如图1所示。图1所示结果表明5种脂溶性维生素在色谱中分离度良好，无交叉干扰。
(2)脂溶性维生素质控品可用于评估方法的稳定性，CV％≤20％表示方法稳定，数据采集可靠。表4为实施例中5种脂溶性维生素的CV％。表4所示结果表明本方法运行稳定，可靠。
表4脂溶性维生素质控品中各脂溶性维生素的CV％
注：n为重复次数。每15个样本后接1个脂溶性维生素质控品。
(3)288例人血浆样本中脂溶性维生素的检测值如表5所示。
表5 288例人血浆样本中脂溶性维生素的检测值(单位：ng/ml)
Claims (10)
1.一种定量检测血浆中多种脂溶性维生素的试剂盒，包括脂溶性维生素校准品、同位素混合标准品、脂溶性维生素质控品、仪器质控品、流动相添加剂；
所述脂溶性维生素校准品包括系列浓度已知的由50％甲醇溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；
所述同位素混合标准品包括含量已知的视黄醇-d5、25羟基维生素D2-d6、25羟基维生素D3-d3、α-生育酚-d6、叶绿醌-d7的混合干粉；
所述脂溶性维生素质控品包括浓度已知的由混合血浆溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；
所述仪器质控品包括浓度已知的由80％乙腈和0.1％甲酸溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；
所述流动相添加剂是甲酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有SLE板；
进一步地，所述试剂盒中还含有深孔板、微孔板、过滤板和热封铝膜；
更进一步地，所述试剂盒中还含有操作说明书；所述操作说明书上记载有权利要求3-7中任一所述方法。
3.一种定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量的方法，包括如下步骤：
(a)配制稀释剂、萃取剂和复溶液；
所述稀释剂按照包括如下步骤的方法配制：向权利要求1中所述的同位素混合标准品中加入甲醇复溶，得到中间溶液I；然后将所述中间溶液I与50％异丙醇混合，即得所述稀释剂；
所述萃取剂为正己烷；
所述复溶液按照包括如下步骤的方法配制：将乙腈与水混合，得到中间溶液II；然后将所述中间溶液II与甲酸混合，即得所述复溶液；
(b)将所述稀释剂与待测血浆样本混合后，将所得混合液转移至权利要求1中所述的SLE板中，静置后加入所述萃取剂进行萃取，得到含有脂溶性维生素的萃取液；
(c)用氮气将所述萃取液吹干后用所述复溶液进行复溶，然后经超声、过滤后得到待上机待测样品；
(d)用液相色谱串联质谱仪对所述待上机待测样品和待上机标准品分别进行检测，根据检测结果得出所述待测血浆样本中多种脂溶性维生素的含量；
所述待上机标准品为将权利要求1中所述的脂溶性维生素校准品替代步骤(b)和(c)中的所述待测血浆样本后，按照步骤(b)和(c)进行操作后获得的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，在配制所述稀释剂的过程中，所述同位素混合标准品与所述甲醇的配比为1.30845μg：1.3mL；和/或
步骤(a)中，在配制所述稀释剂的过程中，所述中间溶液I与所述50％异丙醇的体积比为122μL：50mL；和/或
步骤(a)中，在配制所述复溶液的过程中，所述乙腈与所述水的体积比为80ml:20ml；和/或
步骤(a)中，在配制所述复溶液的过程中，所述中间溶液II与所述甲酸的体积比为1000:1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，将所述稀释剂与所述待测血浆样本混合时两者的体积比为1:1；和/或
步骤(b)中，将所述混合液转移至所述的SLE板中后静置时间为15min；和/或
步骤(b)中，用所述萃取剂进行萃取为两次萃取，每次萃取时加入的所述萃取剂的体积为750μL，每次加入所述萃取剂后静置5分钟；和/或
步骤(b)中，用所述复溶液进行复溶时所述复溶液的用量为80μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述液相色谱条件中的柱温为45℃；样品池温度为8℃；进样体积为10μL；洗脱时的流速为0.5ml/min。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中的步骤(b)是采用自动化移液工作站自动完成的；和/或
所述方法中还包括采用权利要求1中所述的仪器质控品检测所述液相色谱串联质谱仪的稳定性的步骤；和/或
所述方法中还包括采用权利要求1中所述的脂溶性维生素质控品检测方法稳定性和准确性的步骤。
8.一种基于液相色谱串联质谱仪法定量检测血浆中脂溶性维生素含量时对待测血浆样本进行前处理的方法，包括权利要求3-5任一中的步骤(a)和步骤(b)。
9.如下任一所示应用：
(A1)权利要求1或2所述的试剂盒在定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量中的应用；
(A2)权利要求8所述方法在定量检测血浆中多种脂溶性维生素含量中的应用。
10.根据权利要求1-9中任一所述的试剂盒或方法或应用，其特征在于：所述多种脂溶性维生素为5种脂溶性维生素；
进一步地，所述5种脂溶性维生素分别为视黄醇，25羟基维生素D2，25羟基维生素D3，α-生育酚和叶绿醌。
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| CN (1) | CN110763788A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110133135A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-08-16 | 山东博济医药科技有限公司 | 多种脂溶性维生素的含量测定方法 |
| CN111983244A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-24 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒 |
| CN112067388A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-11 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 一种血浆中脂溶性维生素高通量检测前处理方法、试剂盒 |
| CN112798708A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN113391008A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-09-14 | 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 | 一种基于自动化移液工作站进行脂溶性维生素检测样本前处理的方法 |
| CN114755321A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-07-15 | 瑞莱谱(杭州)医疗科技有限公司 | 血清中脂溶性维生素的检测方法 |
| CN114910592A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-16 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法和试剂盒 |
| CN115184482A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-10-14 | 广东太稳生物工程有限公司 | 一种lc-ms/ms检测脂溶性维生素的试剂盒 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1474685A2 (de) * | 2002-02-12 | 2004-11-10 | Biotesys Gmbh | Analyse von vitalstoffen |
| KR20130129865A (ko) * | 2012-05-21 | 2013-11-29 | 한국콜마주식회사 | 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법 |
| WO2015165434A1 (de) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Magnamedics Gmbh | Verfahren zur isolierung von spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen probe |
| CN105158394A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-12-16 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法 |
| CN106404947A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 陈大为 | 半自动样本处理液相色谱技术测定脂溶性维生素的方法 |
| CN106645500A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-10 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒 |
-
2018
- 2018-07-26 CN CN201810833326.0A patent/CN110763788A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1474685A2 (de) * | 2002-02-12 | 2004-11-10 | Biotesys Gmbh | Analyse von vitalstoffen |
| KR20130129865A (ko) * | 2012-05-21 | 2013-11-29 | 한국콜마주식회사 | 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법 |
| WO2015165434A1 (de) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Magnamedics Gmbh | Verfahren zur isolierung von spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen probe |
| CN105158394A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-12-16 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法 |
| CN106404947A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 陈大为 | 半自动样本处理液相色谱技术测定脂溶性维生素的方法 |
| CN106645500A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-10 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (6)
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110133135A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-08-16 | 山东博济医药科技有限公司 | 多种脂溶性维生素的含量测定方法 |
| CN111983244A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-24 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒 |
| CN112067388A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-11 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 一种血浆中脂溶性维生素高通量检测前处理方法、试剂盒 |
| CN112798708A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN113391008A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-09-14 | 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 | 一种基于自动化移液工作站进行脂溶性维生素检测样本前处理的方法 |
| CN113391008B (zh) * | 2021-02-03 | 2023-08-22 | 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 | 基于自动化移液工作站的脂溶性维生素样本前处理方法 |
| CN114755321A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-07-15 | 瑞莱谱(杭州)医疗科技有限公司 | 血清中脂溶性维生素的检测方法 |
| CN115184482A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-10-14 | 广东太稳生物工程有限公司 | 一种lc-ms/ms检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN114910592A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-16 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法和试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200207 |