KR20130129865A

KR20130129865A - 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법

Info

Publication number: KR20130129865A
Application number: KR1020130057332A
Authority: KR
Inventors: 정소희; 조혜영; 이상원; 권돈선
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2013-11-29
Also published as: WO2013176454A1; KR101513872B1

Abstract

본 발명은 액체 크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서, (A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계; (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및 (C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 거쳐 다양한 종류의 비타민 성분들을 신속하게 분리할 수 있으며, 분리도가 높아 다수의 비타민 성분을 포함하는 시료 분석에 유용하다.

Description

액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법{METHOD FOR SIMULTANEOUS ANALYSIS OF VITAMINS BY USING LIQUID CHROMATOGRAPHY}

본 발명은 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법에 관한 것이다.

비타민은 동물의 정상적인 생명현상과 생산활동을 위해 소량으로 요구되는 분자량 1,000 이하의 상대적으로 작은 크기의 유기화합물이다. 상기 비타민은 1) 조효소 및 효소 보결 분자단의 필수적인 구성요소로서 영양소의 대사작용에 관계, 2) 시력, 골격형성, 번식 등의 생리현상에 중요한 역할, 3) 여러 영양소의 효율적인 이용을 돕는 역할, 4) 피부병, 빈혈, 신경증 등 여러 증상을 억제, 5) 성장률과 사료효율을 개선하여 생산성을 증진 등 다양한 역할을 수행한다.

앞서 살펴본 바와 같이 비타민은 인체의 정상적인 성장, 발달 및 건강 유지에 필수적인 영양소이지만, 체내에서는 거의 합성되지 않으므로 반드시 식품을 통해서만 섭취해야 한다. 그러나 현대인이 즐겨먹는 가공식품이나 인스턴트 식품은 자체 내 열량은 높지만 비타민 함량은 낮으므로 평소 이를 즐겨먹는 현대인의 경우 비타민이 부족하기 쉽다. 또한 쉽게 파괴되는 비타민의 성질로 인해 정상적인 식습관을 가지고 있더라도 조리 등의 과정에서 비타민이 파괴되어 섭취가 어려우며, 산업사회가 발달 할수록 수반되는 환경오염, 피로, 스트레스 등으로 인하여 체내 비타민의 소모량이 늘어나 신체의 건강한 상태를 유지하기 위해서는 별도의 비타민 섭취가 필수적인 상황이다.

이러한 비타민의 중요성으로 인하여 오래 전부터 종합 비타민이라고 하는 두 종 이상의 비타민을 함유하는 다양한 제품이 의약품, 건강기능식품, 화장품 등의 형태로 연구개발, 제조, 수입, 유통되어 왔으며 최근 들어 그 종류와 함량 그리고 첨가되는 비타민의 종류는 점점 더 증가하고 있는 추세이다.

올바른 연구개발과 제조를 위해서는 신속하고 정확한 비타민 분석이 필수적이지만, 대한민국 공개특허 제1998-0048347호 등에서 개시하고 있는 종래의 비타민 분석방법들은 개별적인 비타민 성분에 대한 분석방법만을 제공하고 있기 때문에 종합 비타민 제품 내에 포함되어 있는 다양한 비타민들에 대한 동시적이면서도 신속한 분석에 어려움이 있었다.

대한민국 공개특허 제 1998-0048347호

Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography (Journal of Chromatography A, 870 (2000) 207-215) Simultaneous determination of twelve water- and fat-soluble vitamins by high-performance liquid chromatography with diode array detection (Chromatographia 2001, 54, August(No. 3/4)

본 발명에 따른 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법은, 액체 크로마토그래피(LC)의 고정상 및 이동상을 조절함에 따라, 종합비타민 등 다수의 비타민 성분을 포함하는 제품의 비타민 성분들을 동시에 분석하고, 신속하게 분석 결과를 얻을 수 있는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 의하면, 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,

(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;

(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및

(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,

상기 유기용액은 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이온쌍 시약을 포함하고,

상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,

상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,

상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고,

상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.

상기의 과제 해결 수단에 따른 본 발명의 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법은 다양한 종류의 비타민 성분들을 신속하게 분리하여, 다수의 비타민 성분을 포함하는 시료에서 비타민 성분을 동시에 분석하는데 유용하다.

또한, 종합 비타민 제품 등 다수의 비타민 성분을 포함하는 제품의 연구개발이나 제조의 품질관리 시 함량분석을 통해 연구개발 및 제품 생산의 경제적 시간적 효율을 증대시킬 수 있다.

도 1은 실시예 1의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 2는 비교예 1의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 3은 비교예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 4는 비교예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 7은 비교예 4의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 8은 비교예 5의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 9는 제조예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 10은 제조예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 11은 비교예 6의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 12는 비교예 7의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 13은 실험예 1의 표 12의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 14는 실험예 1의 표 13의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 15는 실험예 1의 표 14의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 16은 실험예 2의 표 16의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 17은 실험예 2의 표 17의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 18은 실험예 2의 표 18의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 19는 실험예 3의 표 20의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 20은 실험예 3의 표 21의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 21은 실험예 3의 표 22의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 22는 실험예 3의 표 23의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명에 따른 2종 이상의 비타민의 동시 분석 방법을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다.

상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,

비타민은 효소의 중요한 활성성분으로 미량으로 동물의 영양을 지배하고 정상적인 생리 기능을 조절하며 완전한 물질 대사를 돕는다. 상기 비타민은 지용성 비타민과 수용성 비타민으로 나뉘며, 상기 비타민은 화학적 구조에 따라, 극성의 차이를 나타낸다. 이로 인해서 다양한 종류의 비타민 성분은 크로마토그래피 컬럼 내의 고정상에 대한 친화력의 차이를 야기하여, 컬럼 통과시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 상기 비타민의 종류에 따라 다르게 나타난다.

상기 컬럼을 통과한 비타민 성분들은 머무름 시간에 따라 차례대로 자외부흡광광도계(UV) 상에서 흡광도의 증가로 인한 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 비타민은 표준물질과의 머무름 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 비타민의 양이 계산된다(정량분석).

상기 비타민은 수용성 비타민 및 지용성 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로 수용성인 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C), 티아민(thiamine, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 니아신(niacin, 비타민 B3, 니코틴산(nicotinic acid)과 니코틴산아미드(nicotinamide)를 총칭한다.), 판토텐산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6), 비오틴(biotin, 비타민 B7), 폴산(엽산, folic acid, 비타민 B9 또는 비타민 M), 시아노코발라민(cyanocobalamin) 및 푸르설티아민(fursultiamine)과 지용성인 리보플라빈부티레이트(riboflavinbutyrate, 비타민 B2 활성형), 레티놀(retinol, 비타민 A), 레티놀팔미테이트(retinol palmitate, 비타민 A 활성형), 콜레칼시페롤(cholecalciferol, 비타민 D), 알파 토코페롤(alpha tocopherol, 비타민 E), 알파 토코페롤아세테이트(alpha tocopherol acetate, 비타민 E 활성형), 에르고칼시페롤(ergocalciferol), 베타카로틴(beta-carotene), 감마오리자놀(γ-oryzanol), 유비데카레논(ubidecarenone, CoQ-10) 및 필로퀴논(phylloquinone, 비타민 K)으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 비타민은 아스코르브산, 판토텐산, 니코틴산아미드, 피리독신, 비오틴, 리보플라빈, 폴산, 및 티아민을 포함하는 비타민, 또는 필로퀴논, 리보플라빈부티레이트, 콜레칼시페롤, 레티놀, 레티놀팔미테이트, 베타카로틴, 유비데카레논 및 알파토코페롤아세테이트를 포함하는 비타민이 좋지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 비타민을 포함하는 시료 용액에서 용매는 물, 메탄올, 이소프로판올, 헥산 또는 석유에테르 등일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 용액은 정제(tablet), 액체(liquid) 및 캡슐(capsule)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제품으로부터 상기 용매를 사용한 추출공정으로 제조될 수 있다.

비타민 성분들은 아민기, 히드록실기, 카르복실기, 아미드기 등을 갖는 유기화합물로서, 화학적 구조에 따라 극성 차이를 보이게 된다. 그러나 본 발명자들은 상기 비타민들의 대부분이 고정상으로 극성 컬럼 보다는 비극성 컬럼을 사용하는 경우 분리가 잘 된다라는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

상기 (B) 단계에서 사용되는 컬럼은 분석 시간을 최소로 하기 위하여 컬럼의 길이와 내경을 줄이고, 분리도를 확보하기 위하여 컬럼 내 충전 입자의 크기를 줄인 것으로, 컬럼을 통과하는 이동상 용액이나 시료 용액은 컬럼에 걸려 압력을 높이거나 분석에 영향을 줄 수 있는 불용성 미립자나 미생물을 함유하지 않아야 한다. 따라서, 고정상으로 비극성을 갖는 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)으로 충전된 비극성 컬럼인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 화학적 성질이 비슷한 성분끼리 겹쳐져서 분리도가 감소되는 것을 방지하기 위하여, 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼인 것이 좋다. 상기 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼은 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 분자 사슬 작용기를 갖는 물질이 충전되어 있는 것으로 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용리되고 비극성 성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용리된다.

상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm이고, 바람직하게는 3 내지 15cm이며, 내경이 1.8 내지 5mm이고, 상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술한 규격을 만족하는 컬럼은 신속성 및 선택성이 우수하여, 비타민의 동시 분석 효율을 높일 수 있다.

상기 (C) 단계에서, 수용성 비타민 또는 지용성 비타민 성분의 분석시, 액체 크로마토그래피의 이동상으로는 유기용액 및 수용액을 포함하는 혼합용액을 사용하며, 각각의 유기용액과 수용액은 산과 이온쌍 시약을 포함한다. 상기 유기용액은 아세토니트릴 및 메탄올의 혼합용액이며, 보다 바람직하게는 상기 혼합용액은 아세토니트릴 및 메탄올을 2:1 내지 6:1의 부피비로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 혼합용액을 사용하는 경우, 극성도가 비슷한 비타민 성분들에 대한 분리가 우수하여, 다수의 비타민 성분을 동시에 분석하는데 효과적이다.

상기 (C) 단계에서 수용성 비타민 또는 지용성 비타민 성분의 분석시, 액체 크로마토그래피 이동상의 유속은 분석효율을 최대화하고 분석시간을 최소화하기 위하여 0.4 내지 1.5mL/min로 하는 것이 바람직하다.

상기 이동상 용액의 조성은 산을 사용하여 pH를 낮추면서 적절한 농도의 이온쌍 시약을 사용하여 비타민의 적절한 분리가 일어나도록 하였다.

상기 산은 인산, 트리플루오로아세트산, 아세트산, 포름산 및 헵타플루오로부티르산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 0.5 중량% 인산 및 트리플루오로아세트산인 것이 좋다. 상기 산은 이동상의 pH를 2 내지 3으로 유지시키므로 분석하려는 동일 성분 분자들의 전하 상태를 하나로 통일시켜주어 동일 분자들의 컬럼 내 이동속도 차이를 줄여주고 피크모양을 좁고 길게 만드는 작용을 하므로, 비분리 현상과 피크 일그러짐을 방지하고 피크간 분리도를 높이는 역할을 한다.

상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 사용하고, 바람직하게는 1-헵탄설폰산 나트륨 및 1-옥탄설폰산 나트륨을 사용한다. 또한, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 0.2 중량%인 1-헵탄설폰산나트륨인 것이 좋다. 상기 이온쌍 시약의 탄소수가 9를 초과하면 분리시간이 길어지는 단점이 있다. 상기 이온쌍 시약은 음이온 계면활성제의 하나로 분자 내에 비극성 탄소 분자 사슬과 극성 작용기(설폰산 음이온)를 가지고 있다. 이온쌍 시약의 비극성 탄소 분자 사슬은 비극성의 고정상과 비극성결합을 하고 음이온을 갖는 극성 작용기는 분석하려는 물질 중 양전하를 띠는 이온과 정전기적 인력을 형성하여 결과적으로 양전하를 띠는 성분의 컬럼 내 유지시간을 길게 해주어 피크간 분리도를 높이고 피크의 대칭성을 확보할 수 있도록 보조하는 역할을 한다.

상기 비타민이 수용성 비타민인 경우, 상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고, 상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 0~45:55~100이며, 바람직하게는 제 3단계 이상으로 이루어질 수 있다. 상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 제1 단계에서 0~15:85~100이고, 제2 단계에서는 5~15:85~95이고, 제3 단계에서는 10~55:45~90이고, 추가로 컬럼의 세척 및 다음 시료 분석을 위한 컬럼의 안정화를 위하여 제4 단계에서는 0~100:0~100인 것이 바람직하다. 각각의 단계에서 농도구배 방법을 사용할 수 있다.

상기 각 단계별 시간은 특별한 제한 없이 적용 가능하며, 바람직하게는 제 3단계의 시간을 제 1단계, 제 2단계 및 제 4단계의 시간보다 길게 한다. 본 발명의 전체 용리 시간을 5분으로 할 경우에 제 1 단계는 최초 1분, 제 2 단계는 1분에서 2분, 제 3 단계는 2분에서 4분, 제 4 단계는 4분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 15분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 3분, 제 2단계는 3분에서 6분, 제 3단계는 6분에서 13분, 제 4 단계는 13분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 30분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 7분, 제 2단계는 7분에서 13분, 제 3단계는 13분에서 27분, 제 4단계는 27분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 45분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 11분, 제 2단계는 11분에서 19분, 제 3단계는 19분에서 40분, 제 4단계는 41분 이후 시간으로 표현될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로,

상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고, 상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.

상기 비타민은 바람직하게는 지용성 비타민이다.

지용성 비타민 성분은 전하를 띠는 극성 작용기를 거의 가지고 있지 않고 비극성이므로 pH를 조절할 필요가 없어 산이나 염 등의 첨가 없이 순수한 물만 사용할 수 있다. 비극성이 큰 지용성 비타민 성분을 용리시키기 위해 유기용매로 아세토니트릴, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이외에도 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 추가로 사용하며, 바람직하게는 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올을 사용한다. 상기 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종은 액체 크로마토그래피에서 흔히 사용하지 않는 용매이지만 본 발명에서는 비타민의 분석을 위하여 사용되었다. 비극성 성분의 용리력은 이소프로판올>메탄올>아세토니트릴 순이므로 이에 맞게 시간에 따른 용매 혼합비율을 조절한다.

상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고, 물 : 아세토니트릴 : 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 : 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 부피비는 2~15:25~35:15~65:0~50 이다. 바람직하게는 1 단계 이상으로 이루어질 수 있으며, 용매의 부피비는 제 1단계에서 2~15:25~35:15~65:0~50 이고, 추가로 컬럼의 세척을 위하여 제 2단계에서 0~10:0~35:15~55:40~55 이고, 다음 시료 분석을 위한 컬럼의 안정화를 위하여 제 3단계에서 0~15:0~35:45~65:0~55인 것이 바람직하다. 각각의 단계에서 농도구배 방법을 사용할 수 있다.

상기 각 단계별 시간은 특별한 제한 없이 적용 가능하며, 바람직하게는제 1단계의 시간을 제 2단계 및 제 3단계의 시간보다 길게 한다. 본 발명의 전체 용리 시간을 7분으로 할 경우에 제 1 단계는 최초 5분, 제 2 단계는 5분에서 6분, 제 3 단계는 6분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 14분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 10분, 제 2단계는 10분에서 12분, 제 3단계는 12분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 30분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 20분, 제 2단계는 20분에서 24분, 제 3단계는 24분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 45분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 30분, 제 2단계는 30분에서 36분, 제 3단계는 36분 이후 시간으로 표현될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

기타 나머지 사항은 전술한 것과 같다.

본 발명의 분리 방법에 의하면 크로마토그래피의 상대표준편차(RSD)가 2.0% 이내이고, 분리도는 1.5 이상인 우수한 효과가 있다.

상기 비타민의 동시 분석 방법을 통하여, 의약품, 건강기능식품 및 화장품 형태인 종합비타민 제품의 비타민 함량을 측정하여 품질을 확인할 수 있고 식품 원료의 비타민 함량을 측정할 수 있다.

이하 본 발명의 구성을 아래의 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하지만 본 발명은 이들 예에 의해서만 반드시 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 . 1> 수용성 비타민 분석을 위한 이동상의 최적 조건 선정

8종의 수용성 비타민을 포함하는 비타민 혼합용액을 하기 표 1과 같은 조성으로 제조한 후, 이것을 시료용액으로 하여 이동상의 최적 조건을 하기 표 2와 같이 선정하였다.

분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계(UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.

비타민 성분	농도(mg/mL)
니코틴산아미드	0.2
피리독신염산염	0.1
티아민질산염	0.2
판토텐산칼슘	0.2
아스코르브산	0.2
폴산	0.08
비오틴	0.1
리보플라빈	0.1

시간(분)	유기용액(%)	수용액(%)
0	0	100
1.3	13	87
2.3	13	87
3.7	23	77
4.7	100	0
4.8	0	100
15	0	100

< 실시예 . 1> 이동상으로 메탄올, 아세토니트릴 및 물에 인산 및 이온쌍 시약을 첨가

이동상의 유기용매로 부피비 4:1로 혼합된 아세토니트릴 및 메탄올 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부, 1-헵탄설폰산나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하고, 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부, 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 1과 같다.

< 비교예 . 1> 이동상으로 메탄올 및 물에 인산을 첨가

이동상의 유기용매로 메탄올 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 2와 같다. 인산을 첨가하여 pH를 낮고 일정하게 유지시킨 만큼 분리도가 향상된 모습을 보이나, 낮은 pH에서 양이온을 띠는 비타민 성분들(니코틴산아미드, 피리독신)은 강한 극성으로 인해 컬럼 내 유지시간이 짧고 빠르게 용리되어 분리되지 않는 현상을 볼 수 있다.

< 비교예 . 2> 이동상으로 아세토니트릴 및 물에 인산을 첨가한 경우

이동상의 유기용매로 아세토니트릴 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 3과 같다.

비교예 1과 마찬가지로 pH를 낮고 일정하게 유지시킨 만큼 분리도가 향상된 모습을 보이나, 낮은 pH에서 양이온을 띠는 비타민 성분들(니코틴산아미드, 피리독신)은 강한 극성으로 인해 컬럼 내 유지시간이 짧고 빠르게 용리되어 분리되지 않는 현상을 볼 수 있다.

또한 아세토니트릴은 메탄올에 비해 비극성이 더 크므로 용리력이 좋아 성분들의 컬럼 내 유지시간을 더 짧게 만든다. 이러한 강한 용리력으로 인해 폴산과 비오틴의 불완전한 분리현상을 볼 수 있다.

< 비교예 . 3> 이동상으로 메탄올 및 물에 이온쌍 시약을 첨가한 경우

이동상의 유기용매로 메탄올 100 중량부에 대하여 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 4와 같다.

이온쌍 시약을 첨가한 만큼 비타민 성분의 컬럼 내 유지시간이 길어져 어느 정도 분리가 일어나는 효과는 있으나 산인 인산을 넣지 않아 피크모양이 분석에 적절하지 않음을 알 수 있다.

< 실시예 . 2> 산으로 트리플루오로아세트산을 사용한 경우

인산 대신 트리플루오로아세트산을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 5와 같다.

인산을 사용한 실시예 1과 마찬가지로 8개의 수용성 비타민 성분이 빠른 시간 내에 적절히 분리된 것을 확인 할 수 있었다.

<다른 종류의 이온쌍 시약을 사용>

< 실시예 . 3> 이온쌍 시약으로 1- 옥탄설폰산 나트륨을 사용한 경우

이온쌍 시약으로 1-옥탄설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 6과 같다.

전체적인 분석 양상은 양호하나 분석시간이 더 소요됨을 알 수 있었다.

< 비교예 . 4> 이온쌍 시약으로 1- 펜탄설폰산 나트륨을 사용한 경우

이온쌍 시약으로 1-펜탄설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 7과 같다.

전체적인 분석 양상은 양호하나 판토텐산칼슘과 니코틴산아미드의 분리도가 적절치 않았다.

< 비교예 . 5> 이온쌍 시약으로 1- 헥산설폰산 나트륨을 사용한 경우

이온쌍 시약으로 1-헥산설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 8과 같다.

티아민, 폴산, 비오틴의 분리도가 적절치 않았다.

< 제조예 . 2> 수용성 비타민 성분의 동시 분석

상기 실시예 1의 이동상을 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 시료 내에 존재하는 수용성 비타민 성분들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

하기 표 3과 같이 수용성 비타민들을 물에 녹여 혼합용액을 제조하여 이를 시료용액으로서 분석하였을 때 비타민 성분들이 적절히 분리 분석되는 것을 확인할 수 있었다.

비타민 성분	농도(mg/mL)
니코틴산아미드	0.2
피리독신염산염	0.1
티아민질산염	0.2
판토텐산칼슘	0.2
아스코르브산	0.6
폴산	0.8
비오틴	0.2
리보플라빈	0.2
푸르설티아민	0.2

하기 표 4와 같이 아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 비오틴, 리보플라빈, 폴산, 티아민, 푸르설티아민 순서로 비타민이 용리되었으며, 크로마토그램을 도 9에 나타내었다.

머무름시간(분)	비타민 성분
0.25	아스코르브산
1.19	판토텐산칼슘
1.43	니코틴산아미드
2.15	피리독신 염산염
2.33	비오틴
2.41	리보플라빈
2.71	폴산
3.56	티아민
4.54	푸르설티아민

< 제조예 . 3> 지용성 비타민 성분의 동시 분석

이동상의 유기용매 및 물을 이용하여 시료 내에 존재하는 지용성 비타민 성분들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

하기 표 5와 같이 지용성 비타민 성분들을 이소프로판올에 녹여 혼합용액을 제조하여 이를 시료용액으로 분석하였으며, 하기 표 6과 같이 이동상의 유기용액과 물을 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석하였을 때 비타민 성분들이 적절히 분리 분석되는 것을 확인할 수 있었다.

지용성 비타민 혼합용액 조성

비타민 성분	농도(mg/mL)
에르고칼시페롤	0.05
콜레칼시페롤	0.01
알파토코페롤아세테이트	0.2
필로퀴논	0.02
레티놀팔미테이트	0.05
유비데카레논	0.1

시간(분)	물(%)	아세토니트릴(%)	메탄올(%)	이소프로판올(%)
0	10	30	60	0
5	5	30	20	45
5.4	5	30	20	45
5.5	0	0	50	50
6.5	0	0	50	50
6.6	10	30	60	0

분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계(UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.8mL/분이고, 시료 주입량은 2μL이며, 컬럼 온도는 40℃로 조절하였다.

하기 표 7과 같이 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 알파토코페롤아세테이트, 필로퀴논, 레티놀팔미테이트, 유비데카레논 순서로 비타민이 용리되었으며, 크로마토그램을 도 10에 나타내었다.

머무름시간(분)	비타민 성분
1.48	콜레칼시페롤
1.98	에르고칼시페롤
2.31	알파토코페롤아세테이트
2.51	필로퀴논
3.93	레티놀팔미테이트
5.37	유비데카레논

도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 분석 방법에 의하여 시료에 포함된 비타민의 성분을 분석하는 경우, 다양한 종류의 비타민 성분의 종류와 함량을 신속하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다.

<다른 종류의 이동상을 사용한 수용성 비타민의 동시 분석>

< 비교예 . 6> 이동상으로 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올을 사용한 경우

상기 표 1과 같이 8종의 수용성 비타민을 포함하는 비타민 혼합용액을 제조한 후, 이것을 시료용액으로 사용하였다.

분석은 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올을 이동상으로 사용하여 농도구배 방법으로 이루어졌다. 상기 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올의 부피비는 0.29분까지는 92.5:7.5, 0.31분까지는 84:16, 3분까지는 70:30의 부피비를 사용하였다.

분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계 (UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower Ⅱ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.

분석 결과는 하기 표 8과 같으며 크로마토그램을 도 11에 나타내었다. 티아민과 피리독신이 분리되지 않았고, 니코틴산 아미드와 폴산도 적절한 분리도를 보이지 않았다.

머무름시간(분)	비타민 성분
0.27	아스코르브산
0.422	판토텐산칼슘
0.422	티아민 질산염
0.480	피리독신 염산염
0.508	폴산
0.558	니코틴산아미드
0.814	비오틴
2.418	리보플라빈

< 비교예 . 7> 이동상으로 메탄올, 0.1M 인산 수용액 및 물을 사용한 경우

분석은 메탄올, 0.1M 인산 수용액 및 물을 사용하여 농도구배 방법으로 이루어졌다. 상기 메탄올 : 0.1M 인산 수용액 : 물의 부피비는 초기 ~ 1.13분까지는 10:90:0, 1.29 ~ 2.26분은 40:60:0, 2.42 ~ 3.22분은 40:0:60의 부피비를 사용하였다.

분석기기인 액체크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계 (UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower Ⅱ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.

분석 결과는 하기 표 9와 같으며, 크로마토그램을 도 12에 나타내었다. 판토텐산 칼슘과 티아민이 분리되지 않았고, 피리독신, 폴산 및 니코틴산 아미드도 적절한 분리도를 보이지 않았다.

머무름시간(분)	비타민 성분
0.241	아스코르브산
0.412	판토텐산칼슘
0.515	티아민 질산염
0.515	피리독신 염산염
0.600	니코틴산아미드
0.671	폴산
0.900	비오틴
2.809	리보플라빈

< 실험예 . 1> 복합비타민제의 분석(정제)

아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈부티레이트, 콜레칼시페롤 및 토코페롤아세테이트을 포함하는 복합비타민제(푸른비타정, 한국콜마 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 10과 같다.

비타민 성분		1정(1287mg) 중 함량	시료 용액
수용성비타민	니코틴산아미드	50mg	A
	피리독신염산염	5mg
	티아민질산염	60mg
	아스코르브산	600mg
	판토텐산칼슘	20mg
	비오틴	0.2mg	B
	폴산	0.4mg	B
	시아노코발라민	0.024mg	C
지용성비타민	리보플라빈부티레이트	5mg	D
	알파토코페롤아세테이트	20mg	D
	콜레칼시페롤	0.00625mg	E

상기 표 10의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물과 메탄올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.

실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 상기 표 2와 같이 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비를 조절하였다. 또한, 상기 복합비타민제에 포함된 지용성 비타민은 비극성이 큰 성분이 없고, 종류가 많지 않으므로 상기 실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비는 하기 표 11과 같이 사용하였다.

시간(분)	유기용액(%)	수용액(%)
0	65	35
1	65	35
2	100	0
5	100	0
5.1	65	35
10	65	35

실험예 1의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B 및 D의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 12 내지 14와 같으며, 크로마토그램을 도 13 내지 15에 도시하였다.

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
0.25	아스코르브산	612
1.21	판토텐산칼슘	21
1.45	니코틴산아미드	53
2.14	피리독신	5.1
3.54	티아민	61

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
2.79	비오틴	0.21
4.07	폴산	0.42

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
1.03	리보플라빈부티레이트	5.2
3.83	알파토코페롤아세테이트	21

< 실험예 . 2> 복합비타민제의 분석(정제)

아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈, 콜레칼시페롤, 필로퀴논, 토코페롤아세테이트, 레티놀 및 베타카로틴을 포함하는 복합비타민제(센트룸정, 와이어스 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 15와 같다.

비타민 성분		1정(1310mg) 중 함량	시료 용액
수용성비타민	니코틴산아미드	18mg	A
	피리독신염산염	2.4mg
	티아민질산염	1.7mg
	아스코르브산	60mg
	판토텐산칼슘	6.5mg
	리보플라빈	1.6mg
	비오틴	0.15mg	B
	폴산	0.2mg	B
	시아노코발라민	0.001mg	C
지용성비타민	레티놀	0.6mg	D
	알파토코페롤아세테이트	14.9mg
	베타카로틴	1.2mg
	필로퀴논	0.036mg
	콜레칼시페롤	0.005mg	E

상기 표 15의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물,헥산 및 메탄올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.

실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 상기 표 2와 같이 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비를 조절하였다. 또한, 상기 복합비타민제에 포함된 지용성 비타민은 상기 제조예 3과 동일한 이동상을 사용하였으며, 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비는 상기 표 6과 같이 사용하였다.

실험예 2의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B 및 D의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 16 내지 18과 같으며, 크로마토그램 결과를 도 16 내지 18에 도시하였다.

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
0.25	아스코르브산	63
1.21	판토텐산칼슘	6.8
1.45	니코틴산아미드	20
2.14	피리독신	2.7
2.40	리보플라빈	1.7
3.59	티아민	1.7

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
5.12	비오틴	0.15
7.27	폴산	0.21

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
0.40	레티놀	0.65
1.67	알파토코페롤아세테이트	15.0
1.89	필로퀴논	0.038
3.73	베타카로틴	1.3

< 실험예 3> 복합비타민제의 분석(연질캡슐)

아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈, 콜레칼시페롤, 필로퀴논, 감마오리자놀, 토코페롤아세테이트, 레티놀팔미테이트 및 유비데카레논을 포함하는 복합비타민제(큐엔타민, 알피코프 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 19와 같다.

비타민 성분		1정(1630mg) 중 함량	시료 용액
수용성비타민	니코틴산아미드	10mg	A
	피리독신염산염	6mg
	티아민질산염	5mg
	아스코르브산	200mg
	판토텐산칼슘	17.2mg
	리보플라빈	12mg
	비오틴	0.1mg	B
	폴산	0.4mg	B
	시아노코발라민	0.0049mg	C
지용성비타민	레티놀팔미테이트	2.35mg	D
	알파토코페롤아세테이트	30mg
	유비데카레논	10mg
	콜레칼시페롤	0.025mg
	감마오리자놀	5mg
	필로퀴논	0.055mg	E

상기 표 19의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물, 헥산 및 이소프로판올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.

실험예 3의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B, D 및 E의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 20 내지 23과 같으며, 크로마토그램 결과를 도 19 내지 22에 도시하였다.

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
0.25	아스코르브산	220
1.20	판토텐산칼슘	18
1.44	니코틴산아미드	11
2.13	피리독신	6.5
2.40	리보플라빈	13
3.57	티아민	5.3

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
5.02	비오틴	0.11
7.21	폴산	0.43

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
1.58	콜레칼시페롤	0.027
2.45	알파토코페롤아세테이트	34
2.78, 2.93, 3.19	감마오리자놀	5.4
4.05	레티놀팔미테이트	2.48
5.57	유비데카레논	11.2

머무름시간(분)	비타민 성분	분석결과(mg/1정)
1.94	필로퀴논	0.061

Claims

2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이온쌍 시약을 포함하고,
상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,
상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 포함하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 비타민은 수용성 비타민 또는 지용성 비타민이고,
상기 유기용액은 아세토니트릴 및 메탄올을 2:1 내지 6:1의 부피비로 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 비타민은 수용성 비타민이고,
상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고,
상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 0~45:55~100인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 산은 인산 및 트리플루오로아세트산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고,
상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 비타민은 지용성 비타민이고,
상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고,
물 : 아세토니트릴 : 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 : 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 부피비는 2~15:25~35:15~65:0~50 인것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
상기 비극성 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)이 충전된 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
상기 비타민은 아스코르브산, 티아민, 리보플라빈, 리보플라빈부티레이트, 니아신(니코틴산 및 니코틴산아미드), 판토텐산, 피리독신, 비오틴, 폴산, 레티놀, 푸르설티아민, 레티놀팔미테이트, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 알파 토코페롤, 알파 토코페롤아세테이트, 베타카로틴, 시아노코발라민, 감마오리자놀, 유비데카레논 및 필로퀴논으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 비타민인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm, 내경이 1.8 내지 5mm이고,
상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.