CN112229933A - 利用二维液相色谱测定维生素种类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，包括以下步骤：流路连接；确定维生素K1切割窗口；建立标准的VAEK1分析方法；标准溶液制备；前处理方法。本发明有益效果是：本发明提出的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法实现对维生素A、维生素K1、α‑维生素E快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及维生素检测技术领域，具体为利用二维液相色谱测定维生素种类的方法。
背景技术
对于维生素A，维生素k1，α-维生素E的测定一般参照国家标准《GB5009.82-2016食品安全国家标准食品中维生素A，D，E的测定》,《GB5009.158-2016食品安全国家标准食品中维生素K1的测定》，为提高研发工艺验证阶段维生素AEK1快速检测，本发明开发了利用二维液相色谱测定维生素种类的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供技术方案，包括以下步骤：流路连接；确定维生素K1切割窗口；建立标准的VAEK1分析方法；标准溶液制备；前处理方法。
步骤1：流路连接
按照设计要求（图1）先连接液相系统每个模块和色谱柱，即把1D泵（9）在流路上连接于1D分析柱（2）的输入端，2D分析柱（3）在流路上连接于锌还原柱（5）的输入端，高效液相色谱检测器FID（7）在流路上连接于锌还原柱（5）的输出端，连接器（8）设置有六个端口，六个端口分别为端口a，端口b，端口c，端口d，端口e，端口f，用于连通流路四个阶段的二维液相检测：
0-4.5min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
4.5-5.5min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端；
5.5-20min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
20-25min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端。
步骤2：确定维生素K1切割窗口
按设定色谱条件按顺序分别进一针空白溶液，两针维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标样，保证维生素A、维生素K1、α-维生素E保留时间重复性后，得到维生素K1的保留时间约5min。
步骤3：建立完整的 VAEK1 分析方法
建立完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E分析方法，根据步骤二结果确定维生素K1捕获窗口并编辑阀的切换时间，切换开始时间为维生素K1峰起始时间减去0.1min，切换结束时间为维生素K1峰回到基线时间加0.1min，得到完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E色谱条件，得到健全的分析法VAK1-2D，用该方法再进一针维生素A、维生素K1、α-维生素E混标，可以在1D检测器和2D检测器分步得到维生素A、α-维生素E、维生素K1色谱图。
步骤4：标准溶液制备
1样品测定标准溶液配制，准确称取维生素A标准品25.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到VA-1标准储备液，浓度：0.5mg/ml，分别准确称取α-维生素E标准品50.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到α-VE-1混合标准储备液，浓度：1.0mg/ml，准确称取维生素K1标准品50.0mg，用甲醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得VK1-1标准储备液，浓度1mg/ml；
2维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标准溶液配制，分别移取维生素A-1储备液2ml，维生素E-1混合标准储备液10ml，各0.5ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，得到VAEK1-1混合标准储备液，维生素A：10μg/ml；α-维生素E：100μg/ml，维生素K1：10μg/m，准确移取VAEK1-1混合标准储备液1ml于10ml容量瓶中用甲醇定容，得到VAEK1-2混合标准储备液，维生素A：1μg/ml；α-维生素E：10μg/ml，维生素K1：1μg/ml；
步骤5.前处理方法
参照GB 5009.158-2016食品安全国家标准食品中维生素K1的测定国标前处理皂化方法：脂肪酶酶解-提取-浓缩。
酶解
准确称取经均质的试样1g-5g于50 ml离心管中，加入5 ml 温水溶解(液体样品直接吸取5 ml，植物油不需加水稀释)，加入磷酸盐缓冲液(pH8.0) 5 ml，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶(不含淀粉的样品可以不加淀粉酶)，加盖，涡旋2 min-3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。
提取
取出酶解好的试样，分别加10ml乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10ml正己烷和10ml水，涡旋或振荡提取10 min，6000r/min离心5min，或将酶解液转移至150ml的分液漏斗中萃取提取，静置分层，如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象，转移上清液至100ml旋蒸瓶中，向下层液再加入10ml正己烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。
浓缩
将上述正己烷提取液旋蒸至干(如有残液,可用氮气轻吹至干)，用甲醇转移并定容至5ml容量瓶中，摇匀，0.22μm滤膜过滤，滤液待进样。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法能够实现对维生素A、维生素K1、α-维生素E快速检测。
附图说明
图1为流路连接示意图；
图2为奶粉质控样典型色谱中维生素K1色谱图；
图3为奶粉质控样典型色谱中维生素A、α-维生素E色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
步骤1：流路连接
按照设计要求（图1）先连接液相系统每个模块和色谱柱，即把1D泵（9）在流路上连接于1D分析柱（2）的输入端，2D分析柱（3）在流路上连接于锌还原柱（5）的输入端，高效液相色谱检测器FID（7）在流路上连接于锌还原柱（5）的输出端，连接器（8）设置有六个端口，六个端口分别为端口a，端口b，端口c，端口d，端口e，端口f，用于连通流路四个阶段的二维液相检测：
0-4.5min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
4.5-5.5min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端；
5.5-20min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
20-25min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端。
其中：
1D 分析柱：Poroshell 120 PFP，4.6×100mm，4µm
捕获柱：Poroshell 120 EC-C18，4.6×5mm，4µm
2D 分析柱：Poroshell 120 EC-C18，4.6×100mm，4µm
锌还原柱：50mm×4.6mm,LAAA-0002-01
确定维生素K1切割窗口：按设定色谱条件（表 1）按顺序分别进一针空白溶液，两针维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标样，保证维生素A、维生素K1、α-维生素E保留时间重复性后，得到维生素K1的保留时间约5min，正常情况下 维生素K1 的峰底宽一般小于 0.3min，典型色谱图如图 2 所示。
表1 VAEK1 色谱条件
步骤3：建立完整的 VAEK1 分析方法
建立完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E分析方法，根据步骤二（图2）结果确定维生素K1捕获窗口并编辑阀的切换时间，切换开始时间为维生素K1峰起始时间减去0.1min，切换结束时间为维生素K1峰回到基线时间加0.1min，得到完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E色谱条件（表2），得到健全的分析法VAK1-2D，用该方法再进一针维生素A、维生素K1、α-维生素E混标，可以在1D检测器和2D检测器分步得到维生素A、α-维生素E、维生素K1色谱图，典型色谱如图 3 所示。
表2标准工作溶液浓度
步骤4：标准溶液制备
1样品测定标准溶液配制，准确称取维生素A标准品25.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到VA-1标准储备液，浓度：0.5mg/ml，分别准确称取α-维生素E标准品50.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到α-VE-1混合标准储备液，浓度：1.0mg/ml，准确称取维生素K1标准品50.0mg，用甲醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得VK1-1标准储备液，浓度1mg/ml；
2维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标准溶液配制，分别移取维生素A-1储备液2ml，维生素E-1混合标准储备液10ml，各0.5ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，得到VAEK1-1混合标准储备液，维生素A：10μg/ml；α-维生素E：100μg/ml，维生素K1：10μg/m，准确移取VAEK1-1混合标准储备液1ml于10ml容量瓶中用甲醇定容，得到VAEK1-2混合标准储备液，维生素A：1μg/ml；α-维生素E：10μg/ml，维生素K1：1μg/ml；
步骤5：前处理方法
参照GB 5009.158-2016食品安全国家标准食品中维生素K1的测定国标前处理皂化方法：脂肪酶酶解-提取-浓缩。
酶解
准确称取经均质的试样1g-5g于50 ml离心管中，加入5 ml温水溶解(液体样品直接吸取5 ml，植物油不需加水稀释)，加入磷酸盐缓冲液(pH8.0) 5 ml，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶(不含淀粉的样品可以不加淀粉酶)，加盖,涡旋2 min-3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。
提取
取出酶解好的试样，分别加10ml乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10ml正己烷和10ml水，涡旋或振荡提取10 min，6000r/min离心5min，或将酶解液转移至150ml的分液漏斗中萃取提取，静置分层，如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象，转移上清液至100ml旋蒸瓶中，向下层液再加入10ml正己烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。
浓缩
将上述正己烷提取液旋蒸至干(如有残液,可用氮气轻吹至干)，用甲醇转移并定容至5ml容量瓶中，摇匀，0.22μm滤膜过滤，滤液待进样。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
步骤6：日常维护
每批样品分析前需要按方法走两针的VAEK1-1混合标准溶液，取标准曲线最高点，测试1D色谱柱的柱效以及维生素K1保留时间，并适时根据维生素K1峰宽调整阀切换时间窗口；注意进样时各个泵的压力波动是否正常，尤其是SPE泵的压力是否突然升高，若突然升高首先排查在线过滤器，再排查SPE小柱；配置标准曲线及样品时，用正己烷或者甲醇定容；使用滤膜过滤皂化液，过滤后应当再观察进样小瓶内有无颗粒再上机进样；定期对VAEK1-1的标准品进行校准。
Claims (6)
1.利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，包括以下步骤：流路连接；确定维生素K1切割窗口；建立标准的VAEK1分析方法；标准溶液制备；前处理方法；
其特征在于：
所述的流路连接：
按照设计要求先连接液相系统每个模块和色谱柱，即把1D泵（9）在流路上连接于1D分析柱（2）的输入端，2D分析柱（3）在流路上连接于锌还原柱（5）的输入端，高效液相色谱检测器FID（7）在流路上连接于锌还原柱（5）的输出端，连接器（8）设置有六个端口，六个端口分别为端口a，端口b，端口c，端口d，端口e，端口f，用于连通流路四个阶段的二维液相检测：
0-4.5min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
4.5-5.5min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端；
5.5-20min，1D分析柱（2）的输出端连接端口b，端口b-c连通，端口c连接紫外检测器VWD（6）输入端；
20-25min，2D泵（4）的输出端连接端口e，端口e-d连通，端口d的输出端连接捕获柱（1）的输入端，端口a的输入端与捕获柱（1）的输出端连接，端口a-f连通，端口f的输出端连接2D分析柱（3）的输入端。
2.根据权利要求1所述的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，
其特征在于：
所述确定维生素K1切割窗口：
按设定色谱条件按顺序分别进一针空白溶液，两针维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标样，保证维生素A、维生素K1、α-维生素E保留时间重复性后，得到维生素K1的保留时间约5min。
3.根据权利要求1所述的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，
其特征在于：
所述的建立标准的VAEK1分析方法：
建立完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E分析方法，根据维生素K1捕获窗口并编辑阀的切换时间，切换开始时间为维生素K1峰起始时间减去0.1min，切换结束时间为维生素K1峰回到基线时间加0.1min，得到完整的维生素A、维生素K1、α-维生素E色谱条件。
4.根据权利要求1所述的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，
其特征在于：
所述的标准溶液制备：
1样品测定标准溶液配制，准确称取维生素A标准品25.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到VA-1标准储备液，浓度：0.5mg/ml，分别准确称取α-维生素E标准品50.0mg，用无水乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得到α-VE-1混合标准储备液，浓度：1.0mg/ml，准确称取维生素K1标准品50.0mg，用甲醇溶解后，转移至50ml容量瓶定容，得VK1-1标准储备液，浓度1mg/ml；
2维生素A、维生素K1、α-维生素E混合标准溶液配制，分别移取维生素A-1储备液2ml，维生素E-1混合标准储备液10ml，各0.5ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，得到VAEK1-1混合标准储备液，维生素A：10μg/ml；α-维生素E：100μg/ml，维生素K1：10μg/m，准确移取VAEK1-1混合标准储备液1ml于10ml容量瓶中用甲醇定容，得到VAEK1-2混合标准储备液，维生素A：1μg/ml；α-维生素E：10μg/ml，维生素K1：1μg/ml。
5.根据权利要求1所述的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，
其特征在于：
所述的前处理方法：
1酶解方法，准确称取经均质的试样1g-5g于50ml离心管中，加入5ml温水溶解，液体样品直接吸取5ml，植物油不需加水稀释，加入磷酸盐5ml调节缓冲液为pH8.0，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶，不含淀粉的样品可以不加淀粉酶，加盖，涡旋2min-3min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解；
2提取方法，取出酶解好的试样，分别加入10ml乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10ml正己烷和10ml水，涡旋或振荡提取10min，6000r/min离心5min，或将酶解液转移至150ml的分液漏斗中萃取提取，静置分层，如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象，转移上清液至100ml旋蒸瓶中，向下层液再加入10ml正己烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中；
3浓缩方法，将步骤七制得的正己烷提取液旋蒸至干，如有残液，可用氮气轻吹至干，用甲醇转移并定容至5ml容量瓶中，摇匀，0.22μm滤膜过滤,滤液待进样；不加试样，按同一操作方法做空白试验。
6.根据权利要求1所述的利用二维液相色谱测定维生素种类的方法，
其特征在于：
1D分析柱：Poroshell120PFP，4.6×100mm，4µm；
捕获柱：Poroshell120EC-C18，4.6×5mm，4µm；
2D分析柱：Poroshell120EC-C18，4.6×100mm，4µm；
锌还原柱：50mm×4.6mm，LAAA-0002-01。
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