CN115598278A

CN115598278A - 乳铁蛋白定量检测方法

Info

Publication number: CN115598278A
Application number: CN202211597787.5A
Authority: CN
Inventors: 王象欣; 解庆刚; 崔东影; 高鹏; 张影; 张永久; 蒋士龙; 陆思宇
Original assignee: Feihe Harbin Dairy Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Current assignee: Feihe Harbin Dairy Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-01-13

Abstract

本发明属于检测领域，涉及一种乳铁蛋白定量检测方法，所述方法包括：检测的步骤，其使用二维色谱装置和检测器对含有乳铁蛋白的样品进行定量检测，所述二维色谱装置包括一维色谱系统和二维色谱系统，其中，所述一维色谱系统包括乳铁蛋白特异性亲和色谱柱以及乳铁蛋白捕获色谱柱，所述二维色谱系统包括反相色谱柱，所述一维色谱系统与二维色谱系统通过多通阀组进行连接或切换，并且，所述检测的步骤中：所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化后在所述乳铁蛋白捕获色谱柱中进行富集，进而通过所述二维色谱系统后被所述检测器检测。

Description

乳铁蛋白定量检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，特别是涉及蛋白/肽物质的分离和分析的检测领域，具体涉及一种乳铁蛋白的定量分析的方法，尤其是乳制品中乳铁蛋白含量的定量分析。

背景技术

乳铁蛋白(Lf)是一种天然蛋白质，是碱性蛋白的一种，其主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛存在于动物乳汁中，是一种双叶铁结合的球状糖蛋白，相对分子质量为70～80kDa。乳铁蛋白在人初乳中含量较高，浓度为6～8mg/mL；奶牛初乳中浓度为1～2mg/mL，而在常乳中含量较低，人常乳中浓度为1～2mg/mL，奶牛常乳中浓度为0.02～0.35mg/mL。不同哺乳阶段乳汁中乳铁蛋白含量不断变化。

乳铁蛋白具有以下主要作用：调节机体的免疫反应、调节胃肠道铁的吸收、广谱抗菌作用、抗病毒、抗氧化、抗癌以及同药物的协同作用。因此，乳铁蛋白作为功能性成分，已经被应用到很多领域，诸如食品、医药、口腔医学等方面。

目前乳制品、乳粉领域中，均没有与食品中乳铁蛋白测定相关的标准。目前比较主流的乳制品中Lf的测定方法通常为色谱法（RP-HPLC）、光谱法、基于表面等离子体共振（SPR）的免疫传感器、毛细管电泳法（CE）法、酶联免疫法（ELISA）和超高效液相色谱-串联质谱光谱法（UHPLC-MS/MS）。

其中，酶联免疫吸附法（ELISA）常用于乳制品中Lf的定量，液态乳中的定量范围为0.73~9.84mg/mL，乳粉中Lf的定量范围为5~600ng/mL。ELISA分析具有高度的特异性，结果分布属于偏态分布，因此，有可能会导致假阴性或测定结果误差过大，而且，该方法在使用过程中需要多次洗涤和培养的过程。

超高效液相色谱-串联质谱光谱法（UHPLC-MS/MS）虽然可高灵敏地测定乳制品中的Lf，但该方法是基于Lf 经胰蛋白酶水解后的特征肽进行定性和定量，需要使用稳定同位素标记的肽段作为内标，价格昂贵，而且不能分辨活性乳Lf与非活性Lf。

基于表面等离子体共振（SPR）的生物传感器免疫分析法也已开发使用，定量范围为1~1000 ng/mL，与ELISA分析方法类似，结果分布属于偏态分布，两次结果直接误差过大，很难对结果进行判定。

Lf也可以通过电泳方法检测，包括凝胶电泳和毛细管电泳分析。另外，包括反相高效液相色谱（RP-HPLC）、离子交换色谱（IEC）和亲和色谱几种色谱技术可用于分析Lf含量。

目前领域内多采用液相色谱方法，但是前处理复杂、成本高，重现性需要具有大量实验经验的人才能保障。

引用文献1公开了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，该集合缓冲液包括十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水。用其作为乳铁蛋白的提取液，能够保证亲和柱对乳品中乳铁蛋白的结合能力。之后将吸附于柱上的乳铁蛋白进行洗脱，并可以对洗脱液进行HPLC极性分析和测定。

引用文献2公开了一种快速分离富集乳制品中乳铁蛋白的方法，其通过一种硼酸官能化聚合物材料用于选择性富集乳制品中乳铁蛋白，之后，将吸附的乳铁蛋白脱附，再使用HPLC进行分析和测定。

引用文献3公开了一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法：将分离了脂肪和酪蛋白的测试液采用高效液相色谱系统分离检测，所采用的色谱柱为亲和层析柱，检测器为二极管阵列检测器。

引用文献4公开了一种乳铁蛋白的液相色谱质谱测定方法，其包括：将待测样品和乳铁蛋白标准品分别进行胰蛋白酶酶解处理，制成含特异肽段的待测样品供试液、含特异肽段的乳铁蛋白标准工作液处理试液；以特异肽段标准品配制特异肽段标准工作液；进行高效液相色谱质谱检测。

另外，由于乳铁蛋白具有其结构的特殊性、实际样品基质复杂和添加含量甚少等原因，造成其含量测定的准确性和重现性较差，在生产企业和监督检验机构的日常检测过程中难以持续可靠使用。

因此，根据待测样品中Lf的含量以及实验条件选择一种适当的方法，使其能够进行准确定性和定量，尤为重要。

引用文献

引用文献1：CN114414687A

引用文献2：CN112552395A

引用文献3：CN102854262A

引用文献4：CN108398503A。

发明内容

发明要解决的问题

以上引用文献1～3中虽然提供了乳铁蛋白的分离方法，需要在富集这些乳铁蛋白之后，单独的进行高效液相色谱分析，因此，一方面其可能无法提供连续、便捷或快速的乳铁蛋白的定量分析，另一方面，目前常规方法固相萃取方法中，将分析样品吸附后进行脱附、富集其中的乳铁蛋白，之后将物质在色谱仪上进行检测，其总的乳铁蛋白的回收率也通常不高。

因此，鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明首要的提供一种快速、高效的乳铁蛋白定量检测的方法，其用二维色谱系统对检测样品连续或自动完成分离、富集和检测，不仅节省了人力物力，也具有良好的精确性、可靠性和重现性，同时，也使得在线实时定量检测乳铁蛋白含量成为可能。

因此，本发明进一步也提供了一种在线检测乳制品生产的方法，其通过本发明的乳铁蛋白的快速检测分析方法，以检测乳制品生产是否符合设计要求。

用于解决问题的方案

本发明通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：

[1]. 本发明首先提供了一种乳铁蛋白定量检测方法，其中，所述方法包括：

检测的步骤，其使用二维色谱装置和检测器对含有乳铁蛋白的样品进行定量检测，

所述二维色谱装置包括一维色谱系统和二维色谱系统，其中，

所述一维色谱系统包括乳铁蛋白特异性亲和色谱柱以及乳铁蛋白捕获色谱柱，所述二维色谱系统包括反相色谱柱，所述一维色谱系统与所述二维色谱系统通过多通阀组进行连接或切换，

并且，所述检测的步骤中：

所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化之后在所述乳铁蛋白捕获色谱柱中进行富集，进而通过所述二维色谱系统后被所述检测器检测。

[2]. 根据[1]所述的方法，其中，所述含有乳铁蛋白的样品选自液态乳或乳粉。

[3]. 根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述方法还包括前处理的步骤，所述前处理的步骤中，将含有乳铁蛋白的样品进行脱脂和/或脱酪蛋白的处理。

[4]. 根据[1]～[3]任一项所述的方法，其中，所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱选自肝素亲和色谱柱。

[5]. 根据[1]～[4]任一项所述的方法，其中，所所述乳铁蛋白捕获色谱柱和所述二维色谱系统中的反相色谱柱均选自C4反相色谱柱，所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱的孔径大于所述乳铁蛋白捕获色谱柱和所述二维色谱系统中的反相色谱柱。

[6]. 根据[1]～[5]任一项所述的方法，其中，所述多通阀组为六通阀；所述检测器为紫外光检测器。

[7]. 根据[1]～[6]任一项所述的方法，其中，所述二维色谱装置包括一个或多个泵以对包括所述一维色谱系统和所述二维色谱系统提供流动相。

[8]. 根据[1]～[7]任一项所述的方法，其中，所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化时，流动相中磷酸二氢盐的浓度为20~100mM，并且所述流动相的pH值为6.3～7.6。

[9]. 进一步，本发明也提供了一种用于乳铁蛋白在线定量检测的方法，其包括根据[1]～[8]任一项所述的方法。

[10]. 此外，本发明还提供了一种乳制品生产方法，其包括使用根据[9]所述的一种乳铁蛋白在线定量检测的方法以在线地检测所述乳制品中乳铁蛋白含量是否符合预设的标准，根据所述在线定量检测方法的结果调整或不调整所述乳制品生产方法。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明能够得到如下的技术效果：

1）本发明通过二维色谱装置对含有乳铁蛋白的样品进行检测将乳铁蛋白的分离、富集和色谱检测一次上机处理，不仅大大提高了检测效率，检测结果也具有良好的准确性和可重现性，在一些具体的实施方案中，同一样品的100次检测结果的变异系数低至0.5%，极大提高了检测方法的可靠性。

2）本发明将乳铁蛋白的分离、富集和色谱检测一次上机处理完毕，能够避免现有技术中固相萃取，然后单独进行色谱上机检测的方法中的总的回收率低的问题。

3）本发明处理无需复杂的加热处理，适用于活性乳铁蛋白的精确检测。

4）本发明的检测方法，由于检测效率极高，可以作为一种在线（以及全自动）检测乳铁蛋白的方法，可以实现对含有乳铁蛋白的乳制品的生产线的产品品质的实时监控。

附图说明

图1：本发明一些具体实施方案中一维色谱系统中的亲和色谱柱工作状态图

图2：本发明一些具体实施方案中一维色谱系统中的捕获色谱柱工作状态图

图3：本发明一些具体实施方案中二维色谱系统中色谱柱工作状态图

图4：显示了本发明实施例中仅使用一维色谱系统进行样品乳铁蛋白时检测器得到的峰型

图5：显示了本发明实施例中与图4相同样品条件下使用本发明的二维色谱装置时检测器的峰型

图6：显示了与图5相同样品情况下使用二维色谱装置（但不使用本发明的捕获柱）时检测器的峰型

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。

<定义>

本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，使用“任选”或“任选的/任选地”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。

本说明书中，如没有特殊说明，所使用的“常温”通常指的23±3℃时的温度。

本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。

本说明书中，使用“份”均为重量份数。

本说明书中，使用“实质上”指的是与标准存在的偏差为1%以下，优选为0.5%以下的情况。

本说明书中，“柱”与“色谱柱”具有相同的含义。

本说明书中，在对波长的说明中使用“附近”的含义在于，包括了检测装置所引入的系统性误差的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

除非另有定义，本发明所用的其他的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本发明主要提供了一种适用于乳制品，尤其是液体乳制品和乳粉制品中的所含的乳铁蛋白的定量分析检测方法，本发明主要基于如下见解而完成：

尽管集合使用不同的色谱柱虽然在理论上能够一次完成纯化和检测，然而对于不同的物质的定量分析而言，集成不同的色谱系统的普遍困难在于系统匹配性的问题，这种匹配性源自于固定相、流动相以及控制系统多方面的因素。本发明在大量的检测实践中遇到如下问题，在尝试使用通常的二维色谱装置对乳铁蛋白进行一次性纯化和检测时，由于匹配性问题，导致检测器中特征峰的峰型不佳或者由于溶剂效应而导致峰分裂进而难以进行定量分析。

对此，本发明认为，通过在一维色谱系统的纯化柱之后设置作为捕获柱的反相色谱柱，将纯化后的乳铁蛋白富集于该捕获柱后，再通过二维色谱系统进行检测，能够得到峰型合适的检测信号，并避免溶剂效应的影响，从而能够实现准确定量检测以及良好的重现性。

基于上述见解，本发明具体的提供了一种通过二维色谱装置进行乳铁蛋白定量检测的方法。

本发明的定量方法主要包括检测的步骤。该检测步骤中使用二维色谱装置和检测器对含有乳铁蛋白的样品进行定量检测。所述二维色谱装置包括一维色谱系统和二维色谱系统，其中，所述一维色谱系统包括乳铁蛋白特异性亲和色谱柱以及乳铁蛋白捕获色谱柱，所述二维色谱系统包括反相色谱柱。在进行定量检测时，所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化之后，在所述乳铁蛋白捕获色谱柱中进行富集，进而通过所述二维色谱系统后被所述检测器检测。

（检测对象）

对于本发明的检测对象，原则上没有特别限定，可以是各种含有乳铁蛋白的制品，尤其是乳制品。

对于本发明的乳铁蛋白的来源，通常可以为源自于人乳或动物乳。对于所述动物乳，可以列举的包括牛乳、羊乳、马乳或骆驼乳等。

在本发明一些优选的实施方案中，所述检测对象可以为液体乳，如液体的牛乳、羊乳等，也可以为乳粉制品。进一步，对于液体乳，可以为经过或未经过杀菌处理的液体乳；对于乳粉制品，其可以包括婴幼儿配方乳粉、成人乳粉、中老年人乳粉、蛋白粉或者作为辅食的乳粉等。在一些更优选的实施方案中，所述检测对象可以包括经过或未经过杀菌处理的人乳、牛乳或羊乳的液体乳，或者婴幼儿配方乳粉。

（样品前处理）

本发明的定量分析检测方法中，在进行本发明的定量检测前，可以根据任意需要对上述检测对象进行前处理。

在一些具体的实施方案中，所述前处理的步骤包括去除脂肪的步骤、去除酪蛋白的步骤、去除乳糖的步骤、浓缩或稀释的步骤中的一种或多种。通过前处理步骤，可以减少对后续二维色谱装置定量检测的干扰。

对于去除脂肪的步骤，可以列举的例如，通过离心处理以去除检测对象中的油脂。在一些具体的实施方案中，通过去除脂肪的步骤，将检测对象中80质量%以上，优选为90质量%以上，或者实质上的全部油脂进行去除。

对于去除酪蛋白的步骤，可以列举的包括通过等电点的沉淀方法将酪蛋白以固体方式去除。对于调整的等电点的方法，没有特别限制，可以先将处理对象形成溶液（微乳液），之后使用酸性成分将该溶液的pH值调整至4.3~4.6之间将酪蛋白进行沉淀。对于所述的酸性成分，常用的可以为有机酸，例如乙酸等。在一些具体的实施方案中，通过去除酪蛋白的步骤，将检测对象中80质量%以上，优选为90质量%以上，或者实质上的全部的酪蛋白进行去除。

对于去除乳糖的步骤，原则上没有特别限制，可以列举的包括通过（超滤）膜处理分离的方法。在一些具体的实施方案中，通过去除乳糖的步骤，将检测对象中80质量%以上，优选为90质量%以上，或者实质上的全部乳糖进行去除。

对于浓缩或稀释的步骤，主要是出于后续检测的需要，以使得上机检测的样品具有合适的物质含量。对于具体的干物质含量，可以根据检测仪器的具体标准或要求来确定。

（检测的步骤）

通过任选的上述的前处理的步骤，得到本发明的含有乳铁蛋白的样品，之后，可以直接使用本发明的二维色谱装置进行定量检测。

本发明的二维色谱装置包括一维色谱系统以及二维色谱系统，并且所述一维色谱系统和二维色谱系统可以通过多通阀组进行连接或切换以完成检测路径的调整。

一维色谱系统

本发明中所述一维色谱系统，包括一个或多个的乳铁蛋白特异性亲和色谱柱、一个或多个的乳铁蛋白捕获柱。在一些优选的实施方案中，所述一维色谱系统包括串联的一个乳铁蛋白特异性亲和色谱柱和一个乳铁蛋白捕获柱。

对于所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱，原则上没有特别限制，可以使用本领域中现有的对乳铁蛋白具有亲和性的色谱柱，例如具有肝素偶联的琼脂糖或糖胺聚糖的凝胶、具有肝素偶联的多孔树脂（交联的甲基丙烯酸系树脂等）等。在本发明一些优选的实施方案中，从提高乳铁蛋白的回收率的角度考虑，所述亲和色谱柱的孔径在800埃以上，更优选在900埃以上。进一步，具体可以列举的上述亲和色谱柱包括东曹株式会社的TSKgel Heparin系亲和柱，GE医疗基团的HiTrap Heparin HP系亲和柱等。

对于本发明所述的乳铁蛋白的捕获柱，可以起到将保留于上述特异性亲和色谱柱的乳铁蛋白成分进行富集的作用。本发明认为，通过在所述一维色谱系统中使用一个或多个所述捕获柱能够使得检测结果峰型合适并且也能避免溶剂效应产生的峰的不期望的分裂。

对于本发明可用的捕获柱，可以为反相色谱柱，在一些优选的实施方案中，所述反相色谱柱为碳原子为5以下的烷基基团改性的硅胶或聚合物，典型地，可以为以C4为填充物的反相色谱柱。进一步，在本发明一些优选的实施方案中，所述捕获柱具有400埃以下的孔径，优选为具有350埃以下的孔径，这样的孔径不仅有利于捕获来自于上述亲和色谱柱淋洗或脱附下来的乳铁蛋白，并同时也有利于将全部富集的乳铁蛋白在流动相的作用下更容易地转移到下文将述的二维色谱系统以进行定量检测。

二维色谱系统

本发明的二维色谱系统包括一个或多个的反相色谱柱，对于所述反相色谱柱，在一些优选的实施方案中，所述反相色谱柱为碳原子为5以下的烷基基团改性的硅胶或聚合物，典型地，可以为以C4为填充物的反相色谱柱。

进一步，在本发明一些优选的实施方案中，所述二维色谱系统中的反相色谱柱的孔径为400埃以上，优选为400～500埃，控制该反相色谱柱具有合适的孔径以得到合适的保留时间和提高乳铁蛋白检测的回收率。并且优选的，所述二维色谱系统中的反相色谱柱的孔径大于捕获柱的孔径。

泵以及流动相供给

本发明的二维色谱装置中，还具有一个或多个（液相）泵，以在工作中向一维色谱系统和二维色谱系统提供流动相。

在本发明一些具体的实施方案中，可以具有一个或多个的液相泵，优选地，可以提供两个相互独立的液相泵以分别对一维色谱系统和二维色谱系统供应流动相。

对于一维色谱系统，通过液相泵（1D泵）主要是在亲和色谱柱工作阶段提供能够增进乳铁蛋白与亲和色谱柱结合性的流动相（A），这样的流动相（A）可以为包含有磷酸氢盐或其水合物的水溶液，典型地，所述磷酸氢盐可以为磷酸一氢盐、磷酸二氢盐等，尤其是钠盐等。另外，对于流动相（A）的浓度，从促进亲和柱与乳铁蛋白的亲和角度考虑，其磷酸氢盐的浓度可以为20~100 mM，并且流动相（A）pH值可以为6.3～7.6，优选为6.5～6.9。上述流动相（A）在这些浓度和pH值环境的作用下提供的离子强度更有利于乳铁蛋白的保留以及其他成分的去除，从而有利于提高最终的乳铁蛋白的回收率。

进一步，一维色谱系统的纯化完成后，可以通过上述液相泵（1D泵）调整流动相种类以实现对亲和色谱柱的淋洗进而使得乳铁蛋白从该亲和色谱柱上洗脱进而被流动相输送到所述捕获柱上。此时，通过所述一维色谱系统的液相泵（1D泵）供给流动相（B），所述流动相（B）为包含磷酸二氢盐或其水合物、中性盐的水溶液。其中所述流动相（B）中的磷酸二氢盐的浓度可以为20~100 mM，中性盐的浓度可以为0.9M以上，例如1M，1.2M等，并且流动相（B）pH值可以为6.3～7.6，优选为6.5～6.9。流动相（B）中的中性盐主要是用于调整强度以增加乳铁蛋白的析出和粒径，以便于洗脱。对于中性盐的具体种类，没有特别要求，优选为盐酸盐，例如氯化钠等。

进一步，通过流动相（B）将乳铁蛋白富集于捕获柱之后，启动二维色谱系统的液相泵（2D泵），供给流动相（D）以将捕获柱富集的乳铁蛋白淋洗到二维色谱系统中的反相色谱柱，从而进行定量分析。该过程中通过下文所述的多通阀组实现捕获柱和二维色谱系统中的反相色谱组的串联。

对于流动相（D），通常可以为含水体系，从二维色谱系统中反相色谱柱对乳铁蛋白的分析时峰型良好（例如改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题）的角度考虑，所述流动相（D）可以为的同含有分离增强助剂的水溶液。具体而言，可以通过二维色谱系统的液相泵（2D泵）供给诸如三氟乙酸等分离增强助剂的水溶液以作为流动相（D）。在一些具体的实施方案中，所述流动相（D）中分离增强助剂的浓度通常为2质量%以下，优选为0.01～0.5质量%。

另外，从极性调节的角度来说，可以在提供流动相（D）的同时，通过二维色谱系统的液相泵（2D泵）也提供流动相（C），其可以为极性流体，该极性流体是不会导致蛋白变性的极性溶剂，在本发明一些具体的实施方案中所述极性溶剂可以为腈类溶剂，例如乙腈等。

进一步，在本发明一些具体的实施方案中，以所述二维色谱系统供给的总流动相的体积计，所述流动相（C）的体积分数为10体积%以下，优选为1～8体积%，更优选为2～7体积%。

多通阀组与工作路径

本发明通过多通阀组的使用实现一维色谱系统到二维色谱系统工作路径的连接切换。

对于多通阀组的多通阀的个数，没有特别限制，在一些具体的实施方案中，以借助一个或两个多通阀实现上述工作路径的连接或切换。

从操作简便性的角度考虑，本发明可以使用一个六通阀。以下通过附图1～3来说明通过六通阀控制的工作路径。

如图1所示六通阀处于图1所示连接状态，当二维色谱装置通过进样器进样后，首先启动液相泵（1D泵），此时通过供给流动相（A）将分析成分送往一维色谱系统的亲和色谱柱（1D分析柱），废液通过六通阀通向出口（VWD），在流动相（A）的作用下，乳铁蛋白成分被保留于1D分析柱上，主要杂质成分通过VWD排出系统。并且，在一些具体的实施方案中，还可以通过如图1所示的连接状态或工作路径精确确定乳铁蛋白在1D分析柱上的保留时间，该保留时间可以通过图1所示的工作路径末端连接紫外检测器所监测得到。并且，精确的确定该保留时间，有利于在合适的时间进行二维色谱装置连接方式的切换以将包括（全部）乳铁蛋白成分的蛋白成分收集于捕获柱中。

图2中，六通阀通过切换形成图2的连接方式，此时，1D分析柱通过六通阀与捕获柱相连通，进一步捕获柱通过六通阀与VWD相连接，此时，液相泵（1D泵）停止向一维色谱系统供应流动相（A），改为提供流动相（B），此时保留于1D分析柱的乳铁蛋白被流动相（B）淋洗至捕获柱，即乳铁蛋白完成了在捕获柱上的富集或二次纯化，一些杂质进一步通过六通阀组被流动相（B）从VWD排出。

图3中，六通阀通过切换形成图3的连接方式，此时，液相泵（2D泵）与捕获柱和反相色谱柱（2D分析柱）相串联。进一步，液相泵（2D泵）启动，其供给流动相（D）（以及任选的前文所述比例的流动相（C））。此时来自于液相泵（2D泵）的流动相主要为伴随有极性有机溶剂的水溶液，其可以将捕获柱富集的乳铁蛋白输送到2D分析柱以进行分析检测。

检测器和任选的其他辅助单元

本发明的对于从二维色谱系统的反相色谱柱淋洗出的乳铁蛋白的检测是通过紫外光检测器，该紫外光检测器可以检测380 nm以下的光吸收情况，优选地，在最终分析从二维色谱系统淋洗出的乳铁蛋白时，使用280 nm附近的波长的紫外光，进而通过其吸收峰来进行定量分析。

在其他一些具体的实施方案中，为了确定样品中在色谱系统中的保留时间，也可以对从VWD排除的物质进行紫外吸收检测。优选地，此时的紫外光的波长可以为220 nm附近。

在本发明一些优选的实施方案中，本发明的检测器可以为紫外二极管阵列检测器（DAD）。

此外，对于本发明的二维色谱装置中其他的辅助单元，没有特别限制。在一些具体的实施方案中，这些辅助单元任选地可以包括：

柱温箱，以保存各个色谱柱，并调整各个色谱柱的温度，典型地，可以在亲和柱工作时保持其工作温度为42℃以下，优选为20～40℃，当二维色谱中的反相色谱柱工作时，可以将其保持其工作温度为45℃以上，优选为47～55℃。

自动控制装置，其可以通过编程等方法以在合适的时间切换多通阀组中的多通阀的位置，以实现各个工作路径的切换。

液相泵流量控制装置，以调整液相泵供给不同的流动相以及流动相的速率，典型地，本发明的每个阶段流动相的总流量可以控制在0.5～2ml/min，优选为0.8～1.5ml/min。

自动进样装置，以实现自动进样检测。

定量限和线性范围

根据GB/T5009.1-2003，中A 2.1色谱法的计算方法。检出限公式为：

式中：

b－标准曲线回归方程中的斜率，响应值/µg或响应值/ng；

S—为空白噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。

采用空白（阴性）样品中添加目标化合物的方法，按样品前处理方法进行处理和检测，观察信噪比。逐步减少加标浓度，以3倍信噪比为方法检出限(LOD)，以10倍信噪比为方法定量限(LOQ)。测试结果符合标准要求，本发明中测试结果经计算得出乳铁蛋白的检出限(LOD)为0.1 mg/100g，定量限(LOQ) 为0.4 mg/100g。

（在线检测）

进一步，本发明也提供了一种在线的、自动检测乳制品中乳铁蛋白含量的定量检测方法，所述方法包括以上本发明所述的乳铁蛋白定量检测方法。

本发明的在线检测方法可以通过全自动、半自动等方式进行，以在合适的时间间隔检测乳制品生产中含有的乳铁蛋白的含量是否符合预设的目标或者产品要求。

进一步，根据上述在线定量检测结果，如果发现检测结果与预设的目标或者产品要求存在差异，可以通过生产线的调整来进行校正。

实施例

以下，将通过具体的实施例对本发明进行进一步的说明。

一、试剂和材料

试剂（色谱纯）：

乙腈（CH₃CN）：氯化钠（NaCl）；磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）；磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）；三氟乙酸（TFA ，CF₃COOH）。

1D分析柱：

TSKgel Heparin-5PW亲和色谱柱：内径：7.5mm；长度：7.5cm；粒径：10μm；孔径：1000Å；

捕获柱：TSKgel Protein C4-300色谱柱，内径：3.2mm；长度：1.5cm；粒径：3µm；孔径：300Å。

2D分析柱：

Agilent AdvanceBio RP-mAb C4，内径：4.6 mm；长度：15cm；粒径：3.5μm；孔径：450Å。

流动相：

流动相A：含有50mM Na₂HPO₄的水溶液，pH=6.7

流动相B：含有50mM Na₂HPO₄和1 M NaCl的水溶液，pH=6.7

流动相C：乙腈

流动相D：0.1% TFA水溶液。

流动相第一维梯度条件：

流动相第二维梯度条件：

阀位置：

0.00 min：位置如附图1；

11.20 min：位置如附图2；

13.50 min：位置如附图3。

检验波长：

第一维：220nm；第二维：280nm；

柱温：

第一维：35℃；第二维：50℃。

进样量：

一次进样量为50.00 µL；

样品处理方式：

称取奶粉5 g，加入40℃温水30 mL，漩涡震荡5 min；若是液体奶则称取约30 g，用50%乙酸溶液准确调整pH至4.5，定容至50 mL，摇匀，滤纸过滤，滤液用0.22 μm滤膜过滤到进样瓶中，上机检测。

其中附图4显示了仅使用一维色谱系统进行样品乳铁蛋白时检测器得到的峰型，附图5显示了相同样品使用本发明的二维色谱装置时检测器的峰型。前者出现的峰过宽，且出现裂分峰；后者峰型尖锐，没有峰的分裂，并且杂质基线分离，因此定量准确。

附图6附显示了相同样品使用二维色谱装置（但不使用本发明的捕获柱）时检测器的峰型，检测结果出现了溶剂效应的干扰，且出现了明显的峰分裂。

二、本发明检测方法的可靠性验证：

2.1 标准曲线以及可在线性

以下通过不同的时间多次进行标准曲线的制作。

其中，表1为使用不同浓度的标准样品制作的标准曲线测试数据（第一天），表2为使用不同浓度的标准样品制作的标准曲线测试数据（第二天），可见二者基本一致。

表1

表2

2.2 杀菌乳和乳粉中Lf测定的精密度数据

对自制的源自于牛乳的杀菌乳使用本发明的定量检测方法进行检测以考察本发明方法对杀菌乳中Lf测定的精密度数据。其结果参见表3：

表3：

对商购乳粉使用本发明的定量检测方法进行检测以考察本发明方法对杀菌乳中Lf测定的精密度数据。其结果参见表4：

表4：

2.3 杀菌乳和乳粉中Lf测定的时的回收率

以下通过加标检测的方法以考察本发明定量检测方法的乳铁蛋白的回收率，结果参见表5：

表5

需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

产业上的可利用性

本发明提供的定量检测方法可以在工业上对乳制品中乳铁蛋白的含量进行检测。

Claims

1.一种乳铁蛋白定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：

并且，所述检测的步骤中：

所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化之后在所述乳铁蛋白捕获色谱柱中进行富集，进而通过所述二维色谱系统进一步分离后被所述检测器检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有乳铁蛋白的样品选自液态乳或乳粉。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括前处理的步骤，所述前处理的步骤中，将含有乳铁蛋白的样品进行脱脂和/或脱酪蛋白的处理。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱选自肝素亲和色谱柱。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乳铁蛋白捕获色谱柱和所述二维色谱系统中的反相色谱柱均选自C4反相色谱柱，所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱的孔径大于所述乳铁蛋白捕获色谱柱和所述二维色谱系统中的反相色谱柱。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多通阀组为六通阀；所述检测器为紫外光检测器。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述二维色谱装置包括一个或多个泵以对所述一维色谱系统和所述二维色谱系统提供流动相。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化时，流动相中磷酸氢盐的浓度为20~100 mM，并且所述流动相的pH值为6.3～7.6。

9.一种乳铁蛋白在线定量检测的方法，其特征在于，包括根据权利要求1～8任一项所述的方法。

10.一种乳制品生产方法，其特征在于，所述生产方法包括使用根据权利要求9所述的一种乳铁蛋白在线定量检测的方法以在线的检测所述乳制品中乳铁蛋白含量是否符合预设的标准，根据所述在线定量检测方法的结果调整或不调整所述乳制品生产方法。