CN105572246A - 检测乳样中乳铁蛋白含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，包括对乳样离心脱脂，过滤，亲和层析纯化以及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测等步骤。本方法成本低廉、检测简便、准确性高，可从乳样中同时测定重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白含量的方法，特别适用于转基因乳样中重组人乳铁蛋白及牛内源乳铁蛋白的检测，本方法重复性好，具有较强的可操作性。

Description

检测乳样中乳铁蛋白含量的方法
技术领域
本发明涉及乳品检测技术领域，具体地说，涉及一种检测乳样中乳铁蛋白含量的方法。
背景技术
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，在中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白。其分子量为80kDa，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。
目前，测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法包括免疫酶联吸附法(ELISA法)、高效毛细管电泳法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、凝胶色谱法等多种方法。ZL201410482589公开了将乳样离心处理得到含有乳铁蛋白粗提物的乳清，再通过过滤得到乳铁蛋白精提物；最后进行高效液相色谱测定确定样品中乳铁蛋白的含量。ZL201310567858公开了将待测乳制品离心除去上浮的脂肪；然后将除去脂肪的样品溶液的pH值调节到乳铁蛋白的等电点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液；将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进行高效液相色谱分析检测乳铁蛋白的含量。ZL201310187213公开了一种适于大批量样本的快速检测，可以满足各类乳制品中牛乳铁蛋白的准确定量的试剂盒；US20140308749公开了一种使用电泳和红外荧光在婴幼儿配方奶粉中检测乳铁蛋白的方法。以上方法步骤繁琐，价格昂贵，检测结果差异较大，不适合工业规模检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确、样品预处理简单的检测乳样中乳铁蛋白含量的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，包括对乳样离心脱脂，过滤，亲和层析纯化以及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测等步骤。
其中，对乳样离心脱脂的具体操作为：将乳样以2000-4000rpm离心5-20min，得到脱脂乳。然后，将脱脂乳用0.22μm滤器过滤，收集滤液。
亲和层析具体操作为：将滤液上样到经2-10ms/cm，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的含有亲和固相吸附剂的亲和层析柱(优选HiTrapHeparinHP)上，流速为1-5ml/min，用电导为170ms/cm以下的氯化钠或氯化钾缓冲液，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液洗脱，收集富含乳铁蛋白的洗脱液。
高效液相色谱检测具体操作为：将收集的富含乳铁蛋白的洗脱液用0.22μm滤器过滤，收集滤液，上样到粒径为3.5μm，规格为4.6mm×25cm的C4柱(优选WatersXBridgeBEH300C4色谱柱)，进行高效液相色谱检测。本发明还可以采用由不同公司提供的各种型号和规格的反相柱进行高效液相色谱检测。
流动相A为含有0.1％三氟乙酸的20％乙腈水溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的80％乙腈水溶液，柱温为20-35℃，检测波长为214-280nm，流速为0.3-1ml/min。具体过程见表1。
表1高效液相色谱检测条件
本发明所述乳铁蛋白包括重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白。所述乳样优选转基因牛乳。
本发明提供了一种成本低廉、检测简便、准确性高，可从乳样中同时测定重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白含量的方法，特别适用于转基因乳样中重组人乳铁蛋白及牛内源乳铁蛋白的检测，本方法重复性好，具有较强的可操作性。
附图说明
图1为本发明实施例1中人乳铁蛋白的HPLC图谱。
图2为本发明实施例1中牛乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。
图3为本发明实施例3中亲和色谱纯化色谱图，其中，FT为杂蛋白穿透组分；P为含有乳铁蛋白(重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白)组分。
图4为本发明实施例4中分离重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的HPLC图谱，其中，P1为重组人乳铁蛋白分离峰；P2为牛内源乳铁蛋白分离峰。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例中所用的主要试剂如下：人、牛乳铁蛋白标准品购自Sigma公司；乙腈购自赛默飞世尔科技有限公司；三氟乙酸购自Sigma公司；95％乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠购自西陇化工股份有限公司。
实施例中所用的主要试验仪器如下：高效液相色谱1260Infinity购自安捷伦科技有限公司；WatersXBridgeBEH300C4色谱柱购自沃特世公司；AKTAPurifier快速蛋白液相层析系统、HiTrapHeparinHP购自GE公司；台式高速离心机5810R购自Eppendorf公司。
实施例1人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白标准曲线的绘制
准确称取人和牛乳铁蛋白标准品，分别配制成浓度为4mg/ml、3.5mg/ml、3mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml的人乳铁蛋白溶液以及浓度为1.5mg/ml、1mg/ml、0.8mg/ml、0.5mg/ml、0.3mg/ml、0mg/ml的牛乳铁蛋白溶液，使用高效液相色谱WatersXBridgeBEH300C4色谱柱测定，选择波长为280nm，绘制人乳铁蛋白标准曲线为y＝2108.9x-39.216(R2＝0.9998)，牛乳铁蛋白标准曲线为y＝1990.9x+16.219(R2＝0.9997)。图1为人乳铁蛋白的HPLC图谱，图2为牛乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。
实施例2含重组人乳铁蛋白乳样的预处理
收集含有重组人乳铁蛋白的转基因哺乳动物奶样，以转基因牛奶为优选。将上述奶样分装于50ml离心管中，配平后置于台式高速离心机中，以2000rpm离心10min，离心结束后，弃去乳脂，得到脱脂乳。
实施例3亲和色谱纯化重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白
实施例2得到的脱脂乳用0.22μm滤器过滤，上样到用3ms/cm，pH7.0磷酸盐缓冲液平衡的HiTrapHeparinHP层析柱上，流速为5ml/min，上样结束后，使用84ms/cm的氯化钠，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱含有乳铁蛋白的纯化液(洗脱液)。图3为亲和色谱纯化色谱图，FT为杂蛋白穿透组分；P为含有乳铁蛋白(重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白)组分。
实施例4高效液相色谱测定重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的含量
实施例3得到的富含乳铁蛋白的纯化液用0.22μm滤器过滤，取100μl溶液上机进样，在高效液相色谱WatersXBridgeBEH300C4色谱柱中进行梯度洗脱，方法如表2所示：
表2梯度洗脱条件
结果表明，转基因奶样中重组人乳铁蛋白浓度为3.3mg/ml，牛乳铁蛋白浓度为0.3mg/ml，图4为分离重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的HPLC图谱，P1为重组人乳铁蛋白分离峰；P2为牛内源乳铁蛋白分离峰。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，包括对乳样离心脱脂，过滤，亲和层析纯化以及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对乳样离心脱脂的具体操作为：将乳样以2000-4000rpm离心5-20min，得到脱脂乳。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将脱脂乳用0.22μm滤器过滤，收集滤液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，亲和层析具体操作为：将滤液上样到经2-10ms/cm，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的含有亲和固相吸附剂的亲和层析柱上，流速为1-5ml/min，用电导为170ms/cm以下的氯化钠或氯化钾缓冲液，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液洗脱，收集富含乳铁蛋白的洗脱液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亲和层析柱为HiTrapHeparinHP。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高效液相色谱检测具体操作为：将收集的富含乳铁蛋白的洗脱液用0.22μm滤器过滤，收集滤液，上样到粒径为3.5μm，规格为4.6mm×25cm的C4色谱柱，进行高效液相色谱检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述C4柱为WatersXBridgeBEH300C4色谱柱。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，流动相A为含有0.1％三氟乙酸的20％乙腈水溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的80％乙腈水溶液，柱温为20-35℃，检测波长为214-280nm，流速为0.3-1ml/min；具体过程如下：
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述乳铁蛋白包括重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述乳样为转基因牛乳。
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