CN102565234A - 一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法：提取乳制品中的α-乳白蛋白，高效液相色谱法测定含量；高效液相色谱法：C18色谱柱，等度洗脱，检测波长为210-230nm，洗脱液由流动相A和流动相B组成，该流动相A为体积分数0.05-0.15％三氟乙酸的超纯水溶液，该流动相B为乙腈、超纯水和三氟乙酸的混合液，流动相A和所述流动相B的体积比为80∶20-82∶18；流动相B中：乙腈和超纯水的体积比为320∶100-480∶100，超纯水和三氟乙酸的体积比为100∶0.4-100∶0.6。本发明的检测方法费用低，目标物出峰时间短，峰形尖锐对称，分离度好，准确程度高，受环境变化影响小，有利于α-乳白蛋白在乳制品中含量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法。
背景技术
α-乳白蛋白是一种天然乳清蛋白，是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，是一种能结合钙的乳清蛋白，其成分接近人乳，不易过敏。α-乳清蛋白含有丰富的色氨酸，大量实验表明食用较高色氨酸含量的蛋白有助于提高血液中复合胺的释放，在动物实验中发现其有抗焦虑的作用。
目前测定乳制品中α-乳白蛋白含量的方法有很多，如酶联免疫法、电泳和毛细管电泳等几种方法。
但以上各种方法在测定α-乳白蛋白时都有一定的局限性，如酶联免疫法对试剂的选择性高，牛乳中蛋白质种类很多，很难有效的准确检测；电泳技术在定量方面有很大的局限性；毛细管电泳重复性差，容易堵塞。以上技术上的局限性限制了这些方法在实践中推广应用。
因而，探寻一种成本低廉、检测快速、准确、适用于复杂体系，如乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法是研究的首要问题。
高效液相色谱法(HPLC)是定量分析的有效测试方法之一，与其他方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。但是，目前关于高效液相色谱法分析α-乳白蛋白含量的检测方法还存在着色谱峰较多，难以进行定量分析以及分析时间过长等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有测定乳制品中α-乳白蛋白含量方法的成本高，准确性较差，分析时间长，样品中α-乳白蛋白含量低时测定不准确的缺陷，提供了一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法。本发明的检测方法目标物出峰时间短，峰形尖锐对称，分离度好，准确性高。
本发明提供了一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法，其包括如下步骤：按照本领域常规方法提取乳制品中的α-乳白蛋白，再通过高效液相色谱法测定含量；所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，等度洗脱，检测波长为210-230nm，洗脱液由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和所述流动相B的体积比为80∶20-82∶18；所述流动相A是体积分数0.05-0.15％的三氟乙酸的超纯水溶液；所述流动相B为乙腈、超纯水和三氟乙酸的混合液；所述流动相B中：所述乙腈和超纯水的体积比为320∶100-480∶100，优选400∶100；所述超纯水和三氟乙酸的体积比为100∶0.4-100∶0.6。
其中，所述的C18色谱柱可为现有的各种型号和规格的C18色谱柱，如4.6mm×250mm和4.6mm×150mm等径长规格均可适用。本发明优选AgilentZORBOX ECLIPSE XDB-C18柱(4.6mm×250mm)。
其中，所述的检测波长较佳地为215nm。
其中，所述高效液相色谱法的其他色谱条件为本领域常规条件，优选条件为：流动相总流速较佳地为0.5-1.0mL/min，更佳地为0.8mL/min；柱温较佳地为30-40℃，更佳地为35℃。
其中，所述的乳制品是指本领域各种常规的乳制品，一般为液体乳或乳粉。所述的液体乳可以为鲜乳、杀菌乳、酸乳或配方乳。所述的乳粉可以为全脂乳粉、脱脂乳粉或配方乳粉。
其中，所述的提取乳制品中的α-乳白蛋白的方法优选下述操作方式进行：
①离心脱脂：将所述的乳制品离心，去除脂肪得脱脂样品；
②净化：将pH值为4.6的醋酸盐缓冲液和所述的脱脂样品混合均匀，离心后取上清液；
③过滤：过滤所述的上清液，得上机液。
步骤①中，所述离心的条件和方法为本领域常规的离心条件和方法。所述离心的温度较佳地为1-4℃。所述离心的速度较佳地为3500-4500转/分钟。所述离心的时间较佳地为10-15min。
步骤①中，根据本领域常规方法，所述的乳制品以液态形式进行离心，即当所述的乳制品为液态乳时，可直接将所述的液态乳进行离心；当所述的乳制品为乳粉时，需将所述的乳粉与水混合得乳液，再进行离心，乳粉与水的混合比例较佳地为1g乳粉∶5mL水-1g乳粉∶15mL水。
按本领域常识，步骤①中所述的脱脂样品可于-20℃保存，在24小时内进行步骤②即可。
步骤②中，所述醋酸盐缓冲液中醋酸的浓度为本领域常规浓度，较佳地为0.08-0.12mol/L。
步骤②中，所述的醋酸盐缓冲液和所述的脱脂样品的体积比较佳地为4∶1-6∶1。
步骤②中，所述混合均匀的条件和方法为本领域常规的条件和方法，较佳地用漩涡振荡器振荡1-2min。
步骤②中，所述离心的条件和方法为本领域常规的离心条件和方法。所述离心的温度较佳地为1-4℃。所述离心的速度较佳地为6000-8000转/分钟。所述离心的时间较佳地为8-10min。
步骤③中，所述过滤的条件和方法为本领域常规的条件和方法，较佳地采用0.45μm的滤膜进行过滤。
本发明中，α-乳白蛋白的含量可通过本领域常用的定量分析方法确定，较佳地选用外标法计算峰面积，从而确定α-乳白蛋白的含量。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明解决了复杂乳制品体系中α-乳白蛋白的快速提取和准确定量分析的问题，该法与目前常用的酶联免疫法相比，具有检测费用低，目标物出峰时间短，峰形尖锐对称，分离度好，准确程度高，受环境变化影响小，有利于α-乳白蛋白在乳制品中含量的检测。
附图说明
图1为α-乳白蛋白标准品的HPLC曲线图。
图2为实施例2中检测α-乳白蛋白的HPLC曲线图。
图3为HPLC法测定α-乳白蛋白质量浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，α-乳白蛋白标准品购自于Sigma-Aldrich中国有限公司，批号为9051-29-0，纯度≥85％。
实施例1-2的高效液相色谱法条件：
色谱柱：C18色谱柱(4.6mm×250mm，Agilent公司，美国)；流动相A：体积分数0.1％三氟乙酸的超纯水溶液，流动相B：乙腈、超纯水和三氟乙酸以400∶100∶0.5的体积比混合的混合液，等度洗脱：流动相A和流动相B的体积比为81∶19，总流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长：215nm。
工作曲线的绘制(外标法测定物质含量)：
准确称取α-乳白蛋白标准品(其HPLC曲线见图1)，制成α-乳白蛋白溶液，用高效液相色谱测定溶液，其在215nm处的吸收峰绘制标准曲线如下：Y＝2.0594X-28.011(R2＝0.9977，见图3)。
实施例1 婴幼儿奶粉中α-乳白蛋白的含量测定
①离心脱脂：准确称取10g婴幼儿奶粉(市售)样品，使其完全溶解于100mL水中，然后在4℃下以4000r/min速度离心10min，去除上层漂浮的脂肪得脱脂样品；
②净化：分别取5mL 0.10mol/L、pH值为4.6的醋酸盐缓冲液和1mL脱脂样品于10mL离心管中，用漩涡振荡器振荡2min混合均匀，于4℃温度下8000r/min离心10min，取上清液；
③过滤：上清液经0.45μm滤膜过滤，得上机液；
④取10μL上机液进高效液相色谱仪。
测得婴幼儿奶粉中α-乳白蛋白的含量为6.8mg/g。
实施例2 乳饮料中α-乳白蛋白的含量测定
①离心脱脂：取乳饮料样品(市售)500ml，在4℃下以4000r/min速度离心10min，去除上层漂浮的脂肪得脱脂样品；
②净化：取5mL 0.10mol/L、pH值为4.6的醋酸盐缓冲液和1mL脱脂样品于10mL离心管中，用漩涡振荡器振荡2min混合均匀，于4℃温度下8000r/min离心10min，取上清液；
③过滤：上清液经0.45μm滤膜过滤，得上机液；
④取10μL上机液进高效液相色谱仪。
测得乳饮料中α-乳白蛋白的含量为0.86mg/ml。
效果实施例
准确称取3份实施例1的婴幼儿奶粉10g，分别完全溶解于100mL水后，分别添加500mg、1g和2g的α-乳白蛋白，其它步骤同实施例1。按实施例1-2的高效液相色谱法条件进行回收率试验，分别重复6次。测得实施例1的样品加标回收率分别为92％、92％和100％，RSD分别为3.1％、2.9％和3.6％，结果见表1。
准确称取3份实施例2的乳饮料500mL，分别添加1.0g、2.5g和5g的α-乳白蛋白，其它步骤同实施例2。按实施例1-2的高效液相色谱法条件进行回收率试验，分别重复6次。测得实施例2的样品加标回收率平均值分别为85％、92％和98％，RSD分别为4.6％、1.9％和1.8％，结果见表1。
准确称取实施例1的婴幼儿奶粉10g，完全溶解于100mL水后，添加500mg的α-乳白蛋白，其它步骤同实施例1。按实施例1-2的高效液相色谱法条件进行回收率试验，重复测定12次，回收率为93％，RSD为2.9％，结果见表2。
准确称取实施例2的乳饮料500mL，添加2.5g的α-乳白蛋白，其它步骤同实施例2。按实施例1-2的高效液相色谱法条件进行回收率试验，重复测定12次，回收率为91％，RSD为1.9％，结果见表2。
表1 实施例1-2回收率试验结果
表2 实施例1-2精密度试验结果
Claims (10)
1.一种乳制品中α-乳白蛋白含量的检测方法，其包括如下步骤：提取乳制品中的α-乳白蛋白，再通过高效液相色谱法测定含量；所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，等度洗脱，检测波长为210-230nm，洗脱液由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和所述流动相B的体积比为80∶20-82∶18；所述流动相A为体积分数0.05-0.15％的三氟乙酸的超纯水溶液，所述流动相B为乙腈、超纯水和三氟乙酸的混合液，所述流动相B中：所述乙腈和超纯水的体积比为320∶100-480∶100，所述超纯水和三氟乙酸的体积比为100∶0.4-100∶0.6。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的C18色谱柱为Agilent ZORBOX ECLIPSE XDB-C18柱；和/或，所述的检测波长为215nm。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件还包括：流动相总流速为0.5-1.0mL/min，较佳地为0.8mL/min；柱温为30-40℃，较佳地为35℃。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的乳制品为液体乳或乳粉。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述提取乳制品中的α-乳白蛋白的方法按下述操作方式进行：
①离心脱脂：将所述的乳制品离心，去除脂肪得脱脂样品；
②净化：将pH值为4.6的醋酸盐缓冲液和所述的脱脂样品混合均匀，离心后取上清液；
③过滤：过滤所述的上清液，得上机液。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤①中所述离心的温度为1-4℃；所述离心的速度为3500-4500转/分钟；所述离心的时间为10-15min。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤①中所述的乳制品以液态形式进行离心，当所述的乳制品为乳粉时，需将所述的乳粉与水混合得乳液，再进行离心，乳粉与水的混合比例较佳地为1g乳粉∶5mL水-1g乳粉∶15mL水；和/或，步骤①中所述的脱脂样品于-20℃保存，在24小时内进行步骤②即可。
8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤②中所述醋酸盐缓冲液中醋酸的浓度为0.08-0.12mol/L；和/或，步骤②中所述的醋酸盐缓冲液和所述的脱脂样品的体积比为4∶1-6∶1。
9.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤②中所述混合均匀采用漩涡振荡器振荡1-2min；和/或，步骤②中所述离心的温度为1-4℃；所述离心的速度为6000-8000转/分钟；所述离心的时间为8-10min。
10.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤③中所述的过滤采用0.45μm的滤膜进行。
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