CN103884799A - 乳制品中β-环糊精的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳制品中β-环糊精的检测方法，包括以下步骤：（1）将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液；（2）进行高效液相色谱-示差折光检测；示差折光检测的温度30-50℃；高效液相色谱法的流动相：流动相A：甲醇，流动相B：水，二者体积比（3：97）-（10：90）。本发明的检测方法操作简单，检测结果精准，检测限低，针对β-环糊精包合胆固醇而制得的低（零）胆固醇乳制品，检测效果更佳。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品中β-环糊精的检测方法。
背景技术
乳制品中含有丰富的乳钙、维生素以及必须氨基酸，营养成分全面。《居民膳食指南》（2007年修订）建议每人每天应吃相当300g的牛奶等乳制品。牛奶中的胆固醇含量约为15mg/100g，一般而言，健康人体每日胆固醇的摄入量最好不超过300mg，长期摄入大量的胆固醇会给人体带来健康隐患，血清中胆固醇含量偏高容易引起高血压、动脉粥样硬化等疾病。对于高胆固醇人群，每日摄入的胆固醇含量最好不超过200mg。以每日饮用300g牛奶计算，胆固醇的摄入水平已超过建议量的20％。
由于“三高”患者日益增多，越来越多的消费者开始关注饮食健康，加入控制使用胆固醇和脂肪摄入的行列中，研究开发低胆固醇食品或零胆固醇食品已成为食品加工产业的热点之一。
牛奶中的胆固醇多集中于乳脂肪中，除去脂肪后，牛乳中的胆固醇可减少约75％，但是脂肪作为牛乳中的重要成分，富有营养价值，并且在各种膳食脂肪和油类中具有较好的消化率，容易被人体消化吸收，对机体造成的负担很少。同时乳脂肪还起到提供牛奶香浓风味的作用。去除脂肪的脱脂乳在胆固醇含量降低的同时，营养成分以及口感风味均有损失。
β-环糊精是一种环状寡糖，由7个葡糖单元以α-4糖苷键结合而成。β-环糊精作为增稠剂和稳定剂，已经广泛应用于乳制品领域。但是，X射线衍射及核磁共振研究证明：环糊精的立体结构为中空圆筒形，内腔呈疏水性，这种特殊的筒状结构使得β-环糊精可以与胆固醇结合，形成稳定的胆固醇-β-环糊精包合物，利用β-环糊精的这种特性可以将牛奶中的胆固醇脱除，得到低胆固醇或零胆固醇牛奶。
利用β-环糊精包合法去除胆固醇的乳制品，不会造成原有营养成分的损失或是风味口感的改变，但是其中的加工助剂β-环糊精残留量的检测方法在国内未见报道。
另一方面，QB1613-1992《食品添加剂环状糊精》中记载了纯品β-环糊精的检测方法：利用分光光度计，通过苯酚硫酸法测定出β-环糊精中的葡萄糖含量，从而计算出样本中β-环糊精的含量（纯度）。但该方法仅限于纯品β-环糊精的检测，无法适用于溶解于乳品中的β-环糊精定量检测。
GB2760中记载了α-环状糊精和γ-环状糊精含量（纯度）的检测方法，但是并未涉及乳品中β-环糊精含量应如何检测。
综上所述，现在有技术中没有检测乳品中β-环糊精的方法。针对一些特殊的待测样品，即如前所述的用β-环糊精包合胆固醇而得到的低（零）胆固醇乳制品而言，产品中β-环糊精的残留量的检测更是尤为重要。
发明内容
本发明克服了现有技术中尚没有针对乳品中β-环糊精的检测方法的缺陷，提供一种乳制品中β-环糊精的检测方法。本发明的检测方法操作简单，检测结果精准，可进行乳制品中β-环糊精的定性和定量检测，检测限低；特别是针对β-环糊精包合胆固醇而制得的低（零）胆固醇乳制品，检测效果更佳。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
一种乳制品中β-环糊精的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：
（1）将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液；
（2）将待测样品溶液进行高效液相色谱-示差折光检测，即可；
所述的示差折光检测的温度为30-50℃；
所述的高效液相色谱法的检测条件包括：
流动相：流动相A：甲醇，流动相B：水，所述的流动相A和流动相B的体积比为（3：97）-（10：90）。
以下针对上述技术方案的优选的方案作进一步的说明：
步骤（1）中，所述的蛋白沉淀处理的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的蛋白沉淀处理的方法较佳地包括以下步骤：将所述的待测样品置于35-55℃温度条件下提取1-10min，再与蛋白沉淀剂混合均匀，即可；
其中，所述的蛋白沉淀剂为本领域常规的蛋白沉淀剂，较佳地为亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铅、草酸锰-磷酸氢二钠，硫酸铜、乙腈和乙醇中的一种或多种，更佳地为亚铁氰化钾溶液和/或乙酸锌溶液。
所述的待测样品与所述的蛋白沉淀剂的质量比较佳地为（1-5）：（0.01-0.04），更佳地为（1-5）：（0.015-0.03）。
所述的蛋白沉淀剂较佳地为以其水溶液的形式加入。当所述的蛋白沉淀剂为溶液时，乙酸锌溶液的浓度较佳地为15-30g/L，更佳地为21.9g/L；亚铁氰化钾的浓度较佳地为5-20g/L，更佳地为10.9g/L。
其中，所述的提取前，先按照本领域常规将所述的待测样品进行稀释。当所述的待测样品为固态时，按照本领域常规先将所述的待测样品溶解后再稀释。所述的稀释较佳地为用水稀释，所述的待测样品与所述的水的质量比较佳地为（1-5）：（10-50）。
其中，所述的提取的温度较佳地为40℃。
其中，所述的提取较佳地为震荡提取，更佳地为水浴振荡提取。所述的提取的时间较佳地为1-5min，更佳地为2min。步骤（1）中，所述的震荡提取较佳地在容量瓶中进行。
步骤（1）中，所述的分离的方法为本领域常规分离方法，较佳地为离心分离。所述的离心分离的离心速度较佳地为3000-5000r/min，更佳地为4000r/min；所述的离心分离的时间较佳地为5-10min，更佳的为5min。
步骤（1）中，所述的过滤的滤膜的孔径为0.45μm。
步骤（1）的一个优选的技术方案为：将5g的待测样品在40℃条件下震荡提取1-5min，加入21.9%的乙酸锌溶液1mL和10.6%的亚铁氰化钾溶液1mL，混合均匀，在4000r/min速度下离心5min，过滤，得待测样品溶液。
步骤（2）中，所述的示差折光检测的温度较佳地为40℃。
步骤（2）中，所述的检测条件还包括色谱柱；所述的色谱柱较佳地为C18反相液相色谱柱，更佳地为Waters Atlantis T3色谱柱、Agilent Eclipse PlusC18色谱柱或Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，进一步更佳地为Agilent EclipsePlus C18色谱柱。所述的Agilent Eclipse Plus C18色谱柱的规格较佳地为4.6×100mm，3.5μm。所述的Waters Atlantis T3色谱柱的规格较佳地为2.1×150mm，5μm
步骤（2）中，所述的检测条件还包括柱温；所述的柱温较佳地为30-50℃，更佳地为40℃。
步骤（2）中，所述的检测条件还包括流速；所述的流速较佳地为0.6-1.2mL/min，更佳地为1.0mL/min。
步骤（2）中，所述的检测条件还包括进样体积；所述的进样体积较佳地为10-20μL，更佳地为10μL。
本发明的一个优选的高效液相色谱法检测的检测条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相：流动相A：甲醇；流动相B：水；所述的流动相A和流动相B的体积比为3：97；
柱温：40℃；
流速：1.2mL/min；
进样体积：10μL。
步骤（1）中，所述的待测样品为本领域常规的乳制品，较佳地为低（零）胆固醇牛奶、低（零）胆固醇稀奶油和低（零）胆固醇乳饮料中的一种或多种，更佳地为用β-环糊精包合胆固醇处理得到的低（零）胆固醇牛奶、低（零）胆固醇稀奶油和低（零）胆固醇乳饮料中的一种或多种。
其中，所述的低（零）胆固醇牛奶较佳地为CN103238667A的发明内容及具体实施方式中公开的制备方法制得的低（零）胆固醇牛奶。
所述的低（零）胆固醇牛奶更佳地为按照以下两种方法之一制得的低（零）胆固醇牛奶：
方法一：所述的方法一包括以下步骤：
S（1）：在40℃-70℃温度条件下，原料奶与β-环糊精混合均匀；β-环糊精的用量为1%-4%；所述的百分比为β-环糊精占原料奶与β-环糊精总量的质量百分比；
S（2）：冷却至0-35℃，离心、排渣；所述的离心的速率为6000-12000rpm；
S（3）：升温至60-75℃，均质，杀菌，冷却，灌装。
其中，S（1）中，所述的原料奶与β-环糊精使用搅拌的方法混合均匀，所述的搅拌的速度较佳的为100-250rpm，所述的搅拌的时间较佳的为45-120min；所述的离心的速率为8000-12000rpm。S（3）中所述的离心、排渣的次数均为3次。所述的均质的温度为60-75℃，所述的均质的压力为18-25Mpa；所述的杀菌是巴氏杀菌或高温灭菌；较佳地，所述的巴氏杀菌的温度为75-85℃，所述的巴氏杀菌的时间为15-30s，所述的高温灭菌的温度为121-137℃，所述的高温灭菌的时间为2-15s；更佳地，所述的巴氏杀菌的温度为85℃，所述的巴氏杀菌的时间为15s，所述的高温灭菌的温度为137℃，所述的高温灭菌的时间为4s。S（3）中所述的冷却的温度为2-6℃。
方法二：所述的方法二包括以下步骤：
S1：原料乳升温至55-65℃，离心分离得到无脂肪牛奶和稀奶油；
S2：将稀奶油均质、杀菌处理，冷却至30-50℃后与β-环糊精混合均匀；β-环糊精添加量为5-20%，所述的百分比为β-环糊精占原料奶与β-环糊精总量的质量百分比；
S3：冷却至0-35℃，离心、排渣后得混合物A；所述的离心的速率为6000-12000rpm；
S4：将混合物A与无脂肪牛奶混合，标准化后，升温至60-75℃，均质，杀菌，冷却，灌装。
其中，所述的步骤S2中混合均匀为使用搅拌的方法进行混合均匀，所述的搅拌的时间较佳地为30-60min，所述的搅拌的速度较佳地为100-250rpm；所述的离心、排渣均在离心机中进行，所述的离心的速率为8000-12000rpm。步骤S3中所述的离心、排渣的次数均为3次。步骤S3中所述的冷却的温度为4-20℃。步骤S4中，所述的均质的温度较佳地为60-75℃，所述的均质的压力较佳地为18-25Mpa；所述的杀菌较佳地为巴氏杀菌处理或高温灭菌处理；较佳地，所述的巴氏杀菌的温度为75-85℃，所述的巴氏杀菌的时间为15-30s，所述的高温灭菌的温度为121-137℃，所述的高温灭菌的时间为2-15s；更佳地，所述的巴氏杀菌的温度为85℃，所述的巴氏杀菌的时间为15s，所述的高温灭菌的温度为137℃，所述的高温灭菌的时间为4s。步骤S4中所述的冷却的温度为2-6℃。
其中，所述的低（零）胆固醇稀奶油为按照一定方法制得的低（零）胆固醇稀奶油，所述的方法包括以下步骤：
（1）原料乳升温至65℃，离心分离稀奶油，分离出稀奶油脂肪含量为40%；
（2）稀奶油冷却至40℃，加入20%（w/w）的β-环糊精，在40℃下搅拌60min，搅拌速度100rpm；
（3）冷却至0℃，离心排渣，离心速率为8000rpm，重复操作3次；
（4）升温至60℃，均质（20Mpa）→杀菌（85℃，15s）→冷却至6℃→灌装。
其中，所述的低（零）胆固醇乳饮料为按照一定方法制得的低（零）胆固醇乳饮料，所述的低（零）胆固醇乳饮料包括以下重量份的各原料：零胆固醇牛奶700重量份，水228重量份，白砂糖60重量份，苹果汁10重量份，结冷胶0.2重量份，单硬脂酸甘油酯0.5重量份，蔗糖酯0.4重量份，柠檬酸钠0.4重量份，柠檬酸0.3重量份，食用香精0.2重量份；所述的零胆固醇牛奶为按照如上所述的方法制得的零胆固醇牛奶；
所述的制备方法包括以下步骤：
（1）部分零胆固醇牛奶升温至80℃→添加白砂糖，结冷胶，单硬脂酸甘油酯，蔗糖酯，柠檬酸钠，柠檬酸→保温搅拌15min；
（2）冷却至40℃，加入剩余零胆固醇牛奶，水，苹果汁以及香精→保温搅拌10min；
（3）均质（20±2MPa）→杀菌（138±1℃，4s）→灌装。
本发明中，所述的检测的仪器一般为配有示差折光检测器的高效液相色谱仪。该仪器中，所述的高效液相色谱仪作为进样系统，进行样品的各成分的分离。
本发明中，较佳地，所述的检测后，可按照本领域常规的标准曲线法计算待测样品中β-环糊精的含量。
所述的标准曲线法的操作步骤为：用β-环糊精溶解于水中制成标准储备液，用水逐级稀释配制成系列浓度的标准样品溶液，在与待测样品溶液相同的色谱条件下分别进样；测量各标准样品溶液的峰面积，用峰面积对标准样品溶液的浓度绘制标准曲线。再根据测得的待测样品的峰面积，计算待测样品溶液的浓度。
所述的待测样品溶液的含量的计算方法为：
其中：X：待测样品溶液中β-环糊精的含量，mg/100g；
C：待测样品溶液中的β-环糊精的浓度，mg/mL；
B：标准样品溶液中β-环糊精的浓度，mg/mL；
V：标准样品溶液的体积，mL；
m：待测样品的质量，g；
f：待测样品溶液的稀释倍数。
本发明中，为了检测结果的准确性，在所述的震荡提取前，可以适当进行待测样品溶液的稀释。
本发明中，所述的水为本领域常规的分析用水，所述的分析用水一般为三级或三级以上级别的水。
本发明中，为了去除进样溶液和流动相中的颗粒杂质，避免色谱柱阻塞，一般所有的进样溶液和流动相溶液需分别用滤膜过滤。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的检测方法操作简单，检测结果精准，可进行乳制品中β-环糊精的定性和定量检测，特别是针对β-环糊精包合胆固醇而制得的低（零）胆固醇乳制品，检测效果更佳。
附图说明
图1为实施例1测得的β-环糊精的标准曲线图。
图2为空白标准样品的色谱图。
图3为含有α-环糊精、γ-环糊精和β-环糊精的标准样品的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
标准曲线的制备
将β-环糊精溶解于水中，制成10mg/mL的标准储备液，用水逐级稀释此储备液，配制成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL的标准样品溶液。
取上述标准样品溶液10μL，进行高效液相色谱法测定，检测条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（规格为4.6×100mm，3.5μm）；
柱温：40℃；
流动相：流动相A：甲醇；流动相B：水（甲醇：水体积比=3：97）；
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μL；
示差检测器的温度：40℃。
以峰面积对浓度做标准曲线，标准曲线方程为：
Y=76655X＋1116，R2=0.99993。其中：X表示β-环糊精的环糊精浓度，mg/mL；Y表示峰面积。
标准曲线如图1所示。
实施例2
低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
该低胆固醇牛奶为按照以下方法制得的牛奶：
（1）原料奶升温至65℃，加入4%（w/w）的β-环糊精；
（2）在65℃下，保温搅拌，搅拌速度为250rpm，搅拌时间为75min；
（3）冷却至35℃→低温离心→离心速率为12000rpm→离心后排渣，此重复操作3次；
（4）升温至60℃→均质（18Mpa）→巴氏杀菌（85℃，15s）→冷却至6℃。
该牛奶符合GB19645-2010《食品安全国家标准巴氏杀菌乳》的规定：脂肪≥3.1g/100g，蛋白质≥2.9%。
通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：胆固醇含量为5.14mg/100g；根据GB28080-2011《食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》：胆固醇含量≤10mg/mL（液体）为低胆固醇；胆固醇含量≤5mg/100mL（液体）为无或不含胆固醇；则该牛奶为低胆固醇牛奶。
检测方法：
取上述牛奶5g，置于10mL容量瓶中，40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入21.9%乙酸锌溶液1mL和10.6%亚铁氰化钾溶液1mL，加水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，4000r/min离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。分别重复上述实验5次。
根据实施例1制得的标准曲线方程Y=76655X＋1116，R2=0.99993（X表示β-环糊精的环糊精浓度，mg/mL；Y表示峰面积），计算得到β-环糊精的环糊精浓度。
并根据 计算得到β-环糊精的含量；
其中：X：待测样品溶液中β-环糊精的含量，mg/100g；
C：待测样品溶液中的β-环糊精的浓度，mg/mL；
B：标准样品溶液中β-环糊精的浓度，mg/mL；
V：标准样品溶液的体积，mL；
m：待测样品的质量，g；
f：待测样品溶液的稀释倍数。
实验结果如表1所示：
表1低胆固醇牛奶中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测低胆固醇牛奶中的β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
实施例3
零胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
该零胆固醇牛奶为按照以下方法制得的牛奶：
（1）原料乳升温至65℃，离心分离稀奶油，分离出脱脂乳脂肪含量为0.08%；
（2）稀奶油均质（20Mpa）→灭菌（121℃，15s）→冷却至30℃，加入20%（w/w）的β-环糊精；
（3）在30℃下，搅拌60min，搅拌速度100rpm；
（4）冷却至0℃，离心排渣，离心速率为8000rpm，重复操作3次；
（5）与脱脂奶混合，标准化后，搅拌均匀→升温至60℃，均质（20Mpa）→杀菌（85℃，15s）→冷却至6℃→灌装。
该零胆固醇牛奶符合GB19645-2010《食品安全国家标准巴氏杀菌乳》的规定：脂肪≥3.1g/100g，蛋白质≥2.9%。通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：胆固醇未检出。
检测方法：
取上述牛奶5g，置于10mL容量瓶中，30℃水浴中振荡提取10min，取出后分别加入21.9%乙酸锌溶液1mL和10.6%亚铁氰化钾溶液1mL，加水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，3000r/min离心10min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。
分别重复上述实验5次，实验结果如表2所示：
表2零胆固醇牛奶中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测零胆固醇牛奶中β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
实施例4
低胆固醇稀奶油中β-环糊精含量测定
该低胆固醇稀奶油为按照以下方法制得的低胆固醇稀奶油：
（1）原料乳升温至65℃，离心分离稀奶油，分离出稀奶油脂肪含量为40%；
（2）稀奶油冷却至40℃，加入20%（w/w）的β-环糊精，在40℃下搅拌60min，搅拌速度100rpm；
（3）冷却至0℃，离心排渣，离心速率为8000rpm，重复操作3次；
（4）升温至60℃，均质（20Mpa）→杀菌（85℃，15s）→冷却至6℃→灌装。
该低胆固醇稀奶油符合GB19646-2010《食品安全国家标准稀奶油、奶油和无水奶油》的标准，脂肪≥10.0％，酸度≤30°Τ；通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：胆固醇含量为4.3mg/100g。
取上述稀奶油1g，置于10mL容量瓶中，放入50℃水浴中振荡提取10min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液和1mL亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，5000r/min离心10min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。
分别重复上述实验5次，实验结果如表3所示：
表3低胆固醇稀奶油中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测低胆固醇稀奶油中β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
实施例5
零胆固醇乳饮料中β-环糊精含量测定
该零胆固醇乳饮料的配料（kg）：零胆固醇牛奶（制法同实施例3）700，水228，白砂糖60，苹果汁10，结冷胶0.2，单硬脂酸甘油酯0.5，蔗糖酯0.4，柠檬酸钠0.4，柠檬酸0.3，食用香精0.2；
制备方法：
（1）部分零胆固醇牛奶升温至80℃→添加白砂糖，结冷胶，单硬脂酸甘油酯，蔗糖酯，柠檬酸钠，柠檬酸→保温搅拌15min；
（2）冷却至40℃，加入剩余零胆固醇牛奶，水，苹果汁以及香精→保温搅拌10min；
（3）均质（20±2MPa）→杀菌（138±1℃，4s）→灌装。
该零胆固醇乳饮料符合GB21732-2008《含乳饮料》的标准，蛋白质≥1.0g/100g；通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：胆固醇未检出。
取上述乳饮料5g，置于10mL容量瓶中，放入40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液和1mL亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，4000r/min离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。
分别重复上述实验5次，实验结果如表4所示：
表4零胆固醇乳饮料中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测零胆固醇乳饮料中β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
实施例6
对低胆固醇乳饮料中的β-环糊精含量测定
①标准曲线的制备：
使用与实施例1相同的方法制得标准曲线方程。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Waters Atlantis T3色谱柱（规格为2.1×150mm，5μm）；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：甲醇；流动相B：水；（甲醇：水体积比=10：90）；
流速：1.2mL/min；
进样体积：20μL；
示差检测器的温度：30℃。
得到的标准曲线方程为：
Y=72381X＋1093.9，R2=0.9982。
其中：X表示β-环糊精的环糊精浓度，mg/mL；Y表示峰面积。
②低胆固醇乳饮料中β-环糊精含量的测定：
该低胆固醇乳饮料符合GB21732-2008《含乳饮料》的标准，蛋白质≥1.0g/100g，通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：胆固醇含量为1.85mg/100g。
取低胆固醇乳饮料5g，置于10mL容量瓶中，40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入21.9%乙酸锌溶液1mL和10.6%亚铁氰化钾溶液1mL，加水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，4000r/min离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测。检测条件如本实施例所示。重复上述实验5次，实验结果如表5所示：
表5低胆固醇乳饮料中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测零胆固醇乳饮料中β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
实施例7
对低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
①标准曲线的制备：
使用与实施例1相同的方法制得标准曲线方程。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（规格为4.6×100mm，3.5μm）；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：甲醇；流动相B：水（甲醇：水体积比=3：97）；
流速：0.6mL/min；
进样体积：10μL；
示差检测器的温度：50℃。
得到的标准曲线方程为：
Y=66669X＋1037，R2=0.9983。
其中：X表示β-环糊精的环糊精浓度，mg/mL；Y表示峰面积。
②低胆固醇牛奶中β-环糊精含量的测定：
β-环糊精处理过的低胆固醇牛奶样品，通过GB/T22220-2008食品中胆固醇的测定方法（高效液相色谱法）检测，检测结果为：5.14mg/100g。
取低胆固醇牛奶5g，置于10mL容量瓶中，40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入21.9%乙酸锌溶液1mL和10.6%亚铁氰化钾溶液1mL，加水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，4000r/min离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测。检测条件如本实施例所示。重复上述实验5次，实验结果如表6所示：
表6同一低胆固醇牛奶中β-环糊精含量的测定
实验结果表明：本发明的实验方法能够检测零胆固醇乳饮料中β-环糊精的含量，并且测量结果重现性良好。
对比例1
采用高效液相色谱-紫外检测方法检测低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量
样品预处理方法、标准曲线的制备方法及高效液相色谱的检测条件均同实施例1。
检测结果：发生基线漂移，灵敏度低，检测结果不准确。
对比例2
低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
取实施例2中的低胆固醇牛奶，检测方法包括以下步骤：
取牛奶5g，置于10mL容量瓶中，40℃水浴中振荡提取2min，取出后加水定容至刻度。将容量瓶中的溶液混合均匀，转入15mL塑料离心管中，4000r/min离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法检测，检测方法同实施例1。分别重复上述实验5次。
结果：获得的图谱中多为杂峰，分离度小，对β-环糊精的检测产生干扰。
对比例3
低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
取实施例2中相同制法得到的低胆固醇牛奶，前处理方法同实施例2。
低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
取实施例2中的低胆固醇牛奶，检测方法同实施例2；检测条件中流动相与实施例2有区别，其余检测条件同实施例2。
本实施例中，流动相A：甲醇；流动相B：水（甲醇：水体积比=20：80）；
检测结果：图谱中色谱峰分离不充分，对β-环糊精的检测产生干扰。
对比例4
低胆固醇牛奶中的β-环糊精含量测定
取实施例2中相同制法得到的低胆固醇牛奶，前处理方法同实施例2。检测条件中示差折光检测器的温度为20℃，其他检测条件同实施例2。
检测结果：基线不稳定，发生基线偏移。无法准确测量低胆固醇牛奶中的β-环糊精。
效果实施例1
准确度实验
实验方法：将样品（不含β-环糊精）置于10mL容量瓶中，放入40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液（浓度21.9%，质量百分比）和1mL亚铁氰化钾溶液（浓度10.6%，质量百分比），用水定容至刻度，混合均匀，在15mL塑料离心管中，以4000r/min的速度离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤。
对三个浓度梯度进行加标验证，分别为1mg/mL、2mg/mL或10mg/mL，高效液相色谱法检测的检测条件同实施例1。
每个浓度的梯度做三个加标实验。其结果如表7所示：
表7准确度实验数据
实验结果表明：实验回收率为103％，待测样品加标回收率的相对标准偏差为2.46％，符合GB/T-27404-2008附录F检测方法确认的技术要求，本发明的检测方法相对标准偏差很小，每次实验结果之间的波动很小，以此可以证明本发明的检测方法准确度良好，稳定性好，且加样回收率高。
效果实施例2
精密度实验
以供试品为样品，做加标实验，实验共验证了三个浓度梯度，每个浓度梯度做三个样品平行加标实验。
实验方法：将样品（不含β-环糊精）置于10mL容量瓶中，放入40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液（浓度21.9%，质量百分比）和1mL亚铁氰化钾溶液（浓度10.6%，质量百分比），用水定容至刻度，混合均匀，在15mL塑料离心管中，以4000r/min的速度离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤；进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。检测结果如表7所示：
表8精密度实验数据
实验结果表明：三个浓度梯度加标实验的相对标准偏差分别为2.26％、1.71％和0.55％，均符合GB/T-27404-2008附录F检测方法确认的技术要求，本发明的检测方法相对标准偏差很小，实验结果之间的波动很小，精密度良好，且稳定性好。
效果实施例3
专属性试验
空白样品中加入α-环糊精，γ-环糊精和β-环糊精，其余检测方法均同本发明实施例1。检测结果如图2、图3所示。图2为空白标准样品的色谱图。图3为含有α-环糊精、γ-环糊精和β-环糊精的标准样品的色谱图。其中，1为β-环糊精，2为α-环糊精，3为γ-环糊精。由图2和图3可知：α-环糊精，γ-环糊精与β-环糊精分离度较大，不会对β-环糊精的检测产生干扰。
效果实施例4
检测限实验
实验方法：将不含β-环糊精的牛奶5g置于10mL容量瓶中，放入40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液（浓度21.9%，质量百分比）和1mL亚铁氰化钾溶液（浓度10.6%，质量百分比），用水定容至刻度，混匀后转入15mL塑料离心管中，以4000r/min的速度离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤；以1mg/mL的β-环糊精标准溶液做10次加标实验，加标量如表8所示。进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。检测结果如表8所示：
表8检测限实验数据
本效果实施例中，称样量为5.0g，定容体积为10mL。方法检出限的理论值，根据前文公式β-环糊精含量的计算方法，为1.2mg/mL。检出限的实际值按照本领域常规为理论值的3-5倍，本方法中以5倍计，为6mg/100mL。
效果实施例5
定量限实验
取空白牛奶样品（不含β-环糊精），混匀后，准确称取5g左右置于10mL容量瓶中，放入40℃水浴中振荡提取2min，取出后分别加入1mL乙酸锌溶液（浓度21.9%，质量百分比）和1mL亚铁氰化钾溶液（浓度10.6%，质量百分比），用水定容至刻度，混匀后转入15mL塑料离心管中，以4000r/min的速度离心5min，取上清液经0.45μm水相滤膜过滤；以1mg/mLβ-环糊精标准溶液做10次加标实验，加标量如表9所示。进行高效液相色谱法检测，检测条件同实施例1。检测结果如表9所示：
表9定量限实验数据
本效果实施例中，称样量为5.0g，定容体积为10mL。方法检出限的理论值，根据前文公式β-环糊精含量的计算方法，为4mg/mL。检出限的实际值按照本领域常规为理论值的3-5倍，本方法中以5倍计，为20mg/100mL。
效果实施例6
线性实验
准确配置5个β-环糊精标准系列溶液，浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL检测方法如实施例1，以峰面积对浓度做标准曲线，结果如表10所示。
表10β-环糊精标准曲线
| 浓度mg/mL | 峰面积Area（mRID） |
| 0.1 | 9618 |
| 0.2 | 16782 |
| 0.5 | 39800 |
| 1.0 | 77277 |
| 2.0 | 154509 |
| 斜率 | 76655 |
| 截距 | 1116 |
| 相关系数 | 0.99993 |
表10可知：根据标准曲线的线性范围，本检测方法的线性范围为20-400mg/100g。
Claims (10)
1.一种乳制品中β-环糊精的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
（1）将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液；
（2）将待测样品溶液进行高效液相色谱-示差折光检测，即可；
所述的示差折光检测的温度为30-50℃；
所述的高效液相色谱法的检测条件包括：
流动相：流动相A：甲醇，流动相B：水，所述的流动相A和流动相B的体积比为（3：97）-（10：90）。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的示差折光检测的温度为40℃。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的蛋白沉淀处理的方法包括以下步骤：将所述的待测样品置于35-55℃温度条件下提取1-10min，再与蛋白沉淀剂混合均匀，即可。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：其中，所述的蛋白沉淀剂为亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铅、草酸锰-磷酸氢二钠，硫酸铜、乙腈和乙醇中的一种或多种；所述的待测样品与所述的蛋白沉淀剂的质量比较佳地为（1-5）：（0.01-0.04），更佳地为（1-5）：（0.015-0.03）；所述的提取的温度较佳地为40℃；所述的提取较佳地为震荡提取，更佳地为水浴振荡提取；所述的提取的时间较佳地为1-5min，更佳地为2min。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的分离为离心分离；所述的离心分离的离心速度较佳地为3000-5000r/min，更佳地为4000r/min；所述的离心分离的时间较佳地为5-10min，更佳的为5min；所述的过滤的滤膜的孔径为0.45μm。
6.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）为：将5g的待测样品在40℃条件下震荡提取1-5min，加入21.9%的乙酸锌溶液1mL和10.6%的亚铁氰化钾溶液1mL，混合均匀，在4000r/min速度下离心5min，过滤，得待测样品溶液。
7.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的检测条件还包括色谱柱、柱温、流速或进样体积；
所述的色谱柱较佳地为C18反相液相色谱柱，更佳地为Waters AtlantisT3色谱柱、Agilent Eclipse Plus C18色谱柱或Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱；所述的Agilent Eclipse Plus C18色谱柱的规格较佳地为4.6×100mm，3.5μm；所述的Waters Atlantis T3色谱柱的规格较佳地为2.1×150mm，5μm；
所述的柱温较佳地为30-50℃，更佳地为40℃；
所述的流速较佳地为0.6-1.2mL/min，更佳地为1.0mL/min；
所述的进样体积较佳地为10-20μL，更佳地为10μL。
8.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的检测条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相：流动相A：甲醇；流动相B：水；所述的流动相A和流动相B的体积比为3：97；
柱温：40℃；
流速：1.2mL/min；
进样体积：10μL。
9.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的待测样品为乳制品，较佳地为低胆固醇牛奶、低胆固醇稀奶油、低胆固醇乳饮料、零胆固醇牛奶、零胆固醇稀奶油和零胆固醇乳饮料中的一种或多种。
10.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的检测后，按标准曲线法计算待测样品中β-环糊精的含量。
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