CN104777257A

CN104777257A - 一种乳制品中乳清蛋白成分的快速分离检测方法

Info

Publication number: CN104777257A
Application number: CN201510217875.1A
Authority: CN
Inventors: 袁晓; 戴智勇; 莫红卫; 潘丽娜; 张岩春
Original assignee: AUSNUTRIA DAIRY (CHINA) Co Ltd
Current assignee: AUSNUTRIA DAIRY (CHINA) Co Ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104777257B

Abstract

本发明提供一种乳制品中乳清蛋白成分的快速分离检测方法，包括步骤A，配制标准溶液或解冻标准溶液，步骤B，配制待测样品溶液，步骤C，HPLC分离和检测：使用凝胶色谱柱分离所述标准溶液和待测样品溶液。本发明中，首先利用磷酸盐缓冲液溶解或稀释所述待测奶制品和/或标准品；然后利用凝胶色谱柱分离各种蛋白质组分，并用紫外检测器或二极管阵列检测器检测，通过与标准品峰面积的比较计算奶制品中每种乳清蛋白的含量。使用本发明之检测方法检测乳制品中的乳清蛋白，其检测快速、操作简便且重现性好。

Description

一种乳制品中乳清蛋白成分的快速分离检测方法

技术领域

本发明涉及一种乳制品中乳清蛋白成分的检测方法，尤其是涉及一种婴幼儿乳制品中乳清蛋白成分的快速检测方法。

背景技术

乳清蛋白是一些小的、紧密的球状蛋白，其独特的氨基酸序列和三维结构赋予它广泛的功能特性，其必需氨基酸组成完全符合或超出FAO/WHO的要求。它的胆固醇、脂肪和乳糖含量低，易消化，易吸收。与其它蛋白质比较，具有最高的生物利用价值。生产工艺可影响乳清蛋白的功效，低温、膜超滤技术提取的未变性乳清蛋白的活性和功效最佳。

乳清蛋白的功能性成分包括：β-乳球蛋白占48％，α-乳清蛋白占19％左右，牛血清白蛋白占5％，免疫球蛋白(IgG)占8％，还含有乳铁蛋白、乳过氧化酶、生长因子和许多生物活性因子及酶，这些物质均具有一定的生物活性。乳清蛋白中必需氨基酸种类齐全，组成模式与人体相似，容易消化吸收，因而具有极高的生物利用效价。

牛乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例约为20∶80，而人乳中这一比例超过60∶40，GB10765《食品安全国家标准婴幼儿食品》中规定乳基婴儿配方食品的蛋白质中乳清蛋白含量应≥60％。因此以牛乳为主要原料生产婴儿配方奶粉时，就要对乳清蛋白和酪蛋白的比例进行调整。但是世界各国尚没有乳清蛋白的权威检测方法和固定的检测标准。我国的婴幼儿食品国家标准中虽然把乳清蛋白列为检测项目，但现行国家标准GB 5413.2-1997是引进了日本森永公司的检测方法，只能测定乳清蛋白和酪蛋白的比例，且检测结果与实际含量误差较大、测定时间长、重现性差。使用液相色谱-质谱联用法和特异性肽段检测法检测乳制品中乳清蛋白的含量也有报道，如专利CN200910161153.3中提供一种分离和测定牛乳清蛋白的方法，它包括对乳清蛋白进行预处理、用以1.7μm亚乙基桥杂化颗粒为填料的超高效液相色谱柱将试样中的牛乳α-乳清蛋白和牛乳βa-乳球蛋白、牛乳βb-乳球蛋白完全分离和用质谱仪进行区间扫描，对未变性的上述牛乳白蛋白和牛乳球蛋白进行定量。在该方法中，添加人α-乳清蛋白作为内标。使用该方法，可以准确测定各种食品中的未变性的上述三种牛乳清蛋白的含量。但是奶制品尤其是奶粉经过较高加工温度，各种蛋白质存在不同程度的变性，这些变性后的蛋白质无法用该方法检测。同时该专利方法需要配备质谱仪等昂贵设备，而且存在样品前处理时间长、检测成本高等缺点。

另有专利CN201110283264中公开一种超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，包括在待测的奶粉和牛奶中加入含TritonX-100的盐酸提取液、超声溶解，用乙酸钠水溶液调整pH在4.4-4.6之间，用水定容、均质，室温静置后过滤，滤液通过滤膜，上ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱，采用ACQUITYUPLC-TUV超高效液相色谱系统测定奶粉和牛奶中Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种牛乳清蛋白的含量。运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，的分离，保证了定量精度，并有效去除酪蛋白质和脂类等杂质干扰，提高了最终检测的灵敏度。方法的检出限为1μg/g。该方法中使用的ACQUITYUPLCBEH300C18色谱柱为亚乙基桥杂化颗粒(BEH)填充的硅烷基柱。但该方法中仅能检测α-乳清蛋白和两种β-乳球蛋白共三种牛乳清蛋白，因而其所得的乳制品中乳清蛋白含量的准确度有限，且该方法中并未公开分离和检测牛血清白蛋白和牛乳IgG等活性组分的方法。

而专利申请CN201410722848中公开一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以下的步骤：①待检样品上样液的制备；②酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液的制备；③聚丙烯酰胺凝胶电泳；④染色与脱色；⑤成像与计算。所述的方法准确性高、操作简单、成本低。但该方法中只能计算乳清蛋白和酪蛋白中含量较高的成分，对于乳清蛋白中微量活性成分如乳铁蛋白、免疫球蛋白(牛乳IgG)等无法分离和测定。

因此研究一种准确、快速、低耗的乳制品中乳清蛋白成分，特别是婴幼儿奶粉中乳清蛋白成分的检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于乳制品中的乳清蛋白快速检测方法。

因此，本发明提供一种乳制品中乳清蛋白成分的快速分离检测方法，包括如下步骤，步骤A，配制标准溶液或解冻标准溶液：称取牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品溶解于pH值为7.2～8.0的磷酸盐缓冲液中制得标准溶液，其中牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品在磷酸盐缓冲液中的重量浓度分别为0.002～0.01％、0.005～0.02％、0.005～0.02％和0.01～0.04％；或者取配制时间在3个月以内且储藏在－25℃～－18℃环境下的所述标准溶液解冻；步骤B，配制待测样品溶液：使用pH值为7.2～8.0的磷酸盐缓冲液稀释待测样品至其中蛋白质含量≤x％，待测样品中本身蛋白质含量≤x％时不需稀释，且0.075≤x≤0.125；步骤C，HPLC分离和检测：使用凝胶色谱柱分离所述标准溶液和待测样品溶液，其中HPLC的流动相为乙腈、水和三氟乙酸的混合液；且使用紫外光谱仪或二极管阵列检测器检测并计算得到乳制品中乳清蛋白组分牛乳IgG、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的含量。

在实际运用中，应根据样品种类选择各标准品在混合标液中的浓度，使待测组分与标准品的色谱峰面积尽量接近，并使总蛋白浓度小于x％。

本发明中，制备得到的所述标准溶液可以分装并储藏在小型的具盖塑料离心管中。本领域技术人员能理解的，所述步骤A和步骤B可以先后进行、同时进行，或步骤B先于步骤A进行，本发明对此无限制。

本发明中，首先使用pH值为7.2～8.0的磷酸盐缓冲液溶解所述标准品和/或样品，所述磷酸盐缓冲液的适宜pH值是经过发明人仔细筛选得出的。其pH值≤7.0时，HPLC中部分组分不能完全分开，而pH值≥8.0时，主要待测组分出峰时间会推后，造成检测时间的延长，同时长期使用较高pH值的流动相容易对色谱柱造成伤害。因此本发明中优选使用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液。本发明中还使用凝胶色谱柱对标准品和待测样品进行快速分离，与现有技术中检测时间约为1天相比，本发明极大地缩短了检测乳清蛋白含量的时间(除去配制溶液的时间，其它关键检测时间可控制为每个样在1.5小时以内)。也就是说，本发明提供了一种检测精度达到要求的快速的乳清蛋白含量检测方法。

在确定乳清蛋白中上述组分的含量后，就能基本确定乳清蛋白在乳制品中的总含量。若待测乳制品为婴幼儿奶粉时，则还优选检测乳清蛋白中乳铁蛋白的含量，如此可以更全面准确地检测乳制品中乳清蛋白的总含量，还可以获知乳制品中重要蛋白质乳铁蛋白的含量。

虽然昂贵的质谱仪设备等能更精确地检测出乳清蛋白中的各组分的含量，但本发明的方法已经完全能满足对乳制品中乳清蛋白的检测精度和准确度的需求，且其检测快速、简便，与现有技术相比具有明显的优势。

在一种具体的实施方式中，所述标准溶液中牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品的浓度分别为0.005％、0.01％、0.01％和0.02％。虽然牛乳IgG在乳清蛋白中的含量并不低，约为5％，但因其分子量大，在HPLC中出峰最早，干扰少且响应值较高，因而其标准品的用量可以略少。为了使得本发明中所用标准品的总浓度尽量地低，因而选择牛乳IgG标准品的浓度为0.002～0.01％，优选为0.005％。

在另一种具体实施方式中，所述标准溶液中还包括溶解于磷酸盐缓冲液中的乳铁蛋白标准品，且其中乳铁蛋白标准品的重量浓度为0.0001～0.001％，优选为0.0005％，且所述乳铁蛋白标准品中乳铁蛋白的含量为＞90％。在检测婴幼儿奶粉时，使用该标准溶液能相应得到在营养角度上来说具有重要意义的乳铁蛋白的检测结果。

优选地，在步骤C之前还包括对所述标准溶液和待测样品溶液使用含孔径为0.22μm膜的过滤器过滤。本领域常用的过滤器中的膜的孔径有两种，0.22μm和0.45μm，但本发明中更适宜使用孔径为0.22μm的膜过滤。

本发明的一种具体实施方式中，步骤C中使用的色谱柱包括两根串联的TSKG3000PW_Xl凝胶柱和一根预柱PW_Xl，优选所述预柱直径为6mm且长度为4cm。本领域中，生产凝胶色谱柱的厂商和产品型号众多，适当选择一种合适的凝胶色谱柱即可进行本发明中的HPLC分离。本发明中，例如使用两根TSK G3000PW_Xl凝胶柱串联且附带使用预柱PW_Xl(6mm×4cm)，所述预柱可以预先吸附部分杂质，起到对凝胶色谱柱的保护作用。

在一种具体实施方式中，用于配制标准溶液的标准品中牛乳IgG、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的含量分别为＞90％、＞95％、＞90％和＞90％。

具体地，所述紫外光谱仪的检测器波长设定为215nm或280nm。本发明中，所述紫外光谱仪的检测器波长设定为215nm或280nm，在这两种波长下，本发明中涉及的牛乳IgG、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白这五种乳清蛋白的响应值最好。本发明中，使用紫外光谱仪即可达到所需的检测要求，但若能使用二极管阵列检测器检测，因其可以扫描每种蛋白的最大吸收波长并分别进行检测，同时对色谱峰纯度进行判断，因而使用二极管阵列检测器是更佳的。

在一种具体实施方式中，所述流动相为乙腈35-55wt％和水45-65wt％的混合溶液中加入0.1-0.2wt％的三氟乙酸而得到。

本发明中，首先利用磷酸盐缓冲液溶解或稀释所述待测奶制品和/或标准品；然后利用凝胶色谱柱分离各种蛋白质组分，并用紫外检测器或二极管阵列检测器检测，通过与标准品峰面积的比较计算奶制品中每种乳清蛋白的含量。使用本发明之检测方法检测乳制品中的乳清蛋白，其检测快速、操作简便且重现性好。

附图说明

图1为标准品的HPLC谱图，

图2为标准品的谱图重现性结果，

图3为使用不同pH值的磷酸盐缓冲液对样品谱图的影响，

图4为待测样品为婴幼儿奶粉的样品谱图，

图5为待测样品为巴氏奶的样品谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中使用的乙腈、三氟乙酸为色谱纯，水为去离子水。

实施例1

(1)标准溶液配制

称取25mg牛乳IgG，50mgα-乳清蛋白，50mg牛血清白蛋白，100mgβ-乳球蛋白、2.5mg乳铁蛋白溶解于500ml的磷酸盐缓冲液中。将标样分装倒入Eppendorph试管中，在－25℃～－18℃之间冷冻保藏，可保质3个月，在使用当天解冻。

(2)样品处理

样品为粉末状时将100-1000mg粉末溶解于100ml磷酸盐缓冲液中；样品为液体时用磷酸盐缓冲液稀释样品，至蛋白质含量约0.1％，若样品中蛋白质含量低于0.1％，不用稀释。

所有样品均用0.22μm过滤器过滤后，上高效液相色谱仪测定。

(3)HPLC实验条件

色谱柱：2根TSK G3000PW_Xl凝胶柱串联，附带预柱PW_Xl(6mm×4cm)，

流动相：乙腈+水+三氟乙酸，

流速：0.8ml/min，

检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器，

(4)计算(如x为0.1时)

X：蛋白组分百分含量，

A：样品测得的峰面积，

0.1：0.1％溶液换算系数，

F：稀释系数(100000/样品质量，以mg计)，

B：标准品峰面积。

本发明中的磷酸盐缓冲液可以商购获取，也可以自行配制。配制方法可以按照公知常识中的方法进行，例如为：先将2.7598g磷酸二氢钠(一水)溶于900ml去离子水中，用1.0M的氢氯化钠调pH值至7.5，然后加去离子水至1000ml，得到浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

本发明中，一般在待测样品进样个数为3～20个后，需要进样一份标准溶液。因为连续进样会导致柱压改变，影响标准品的保留时间。尤其是婴幼儿奶粉等复杂组分的乳制品，一般需要在进样待测样品3个左右就需要进样一次标准品，而组分简单的乳饮料则可以进样数十次后才进样一次标准品。

本发明中，所得标准品的HPLC谱图如图1所示。

实施例2

缓冲液pH值的选择：由图2可以看出，采用不同pH值的磷酸盐缓冲液对组分分离度和出峰时间均有影响。通过一系列pH梯度的实验，最终确定磷酸盐缓冲液的最优pH为7.5。

实施例3

本实施例为使用本发明方法检测某婴儿配方奶粉中的乳清蛋白组份。

试剂及材料准备：

流动相配制：470.0g去离子水、413.4g乙腈，1.0ml三氟乙酸加入色谱柱的液面以下。

将标准溶液在带盖试剂瓶中混和并用0.22μm膜过滤。

样品处理：称取0.500g样品，溶解于磷酸盐缓冲液中，并定容至100ml；

测定液的制备和检测：取处理液过0.22μm滤膜后，上高效液相色谱仪测定。

依照公示计算各组分的含量，所得结果见表1。

表1

组分名称	保留时间(min)	含量
			牛乳IgG	5.229	512.2mg/100g
乳铁蛋白	11.286	78.8mg/100g
			牛血清白蛋白	15.732	352.1mg/100g
β-乳球蛋白	25.251	3343.8mg/100g
			α-乳清蛋白	28.379	1382.4mg/100g

实施例4

本实施例为使用本发明方法检测某巴氏杀菌牛奶中的乳清蛋白组份。

检测步骤与实施例3基本相同，但样品处理时是称取2.50g样品，加磷酸盐缓冲液定容至100ml。所得结果见表2。

表2

组分名称	保留时间(min)	含量
			牛乳IgG	5.233	未检出
乳铁蛋白	11.288	未检出

牛血清白蛋白	15.731	30.2mg/100g
			β-乳球蛋白	25.260	114.2mg/100g
α-乳清蛋白	28.389	282.4mg/100g

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种乳制品中乳清蛋白成分的快速分离检测方法，包括如下步骤，

步骤A，配制标准溶液或解冻标准溶液：称取牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品溶解于pH值为7.2～8.0的磷酸盐缓冲液中制得标准溶液，其中牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品在磷酸盐缓冲液中的重量浓度分别为0.002～0.01％、0.005～0.02％、0.005～0.02％和0.01～0.04％；或者取配制时间在3个月以内且储藏在－25℃～－18℃环境下的所述标准溶液解冻；

步骤B，配制待测样品溶液：使用pH值为7.2～8.0的磷酸盐缓冲液稀释待测样品至其中蛋白质含量≤x％，待测样品中本身蛋白质含量≤x％时不需稀释，且0.075≤x≤0.125；

步骤C，HPLC分离和检测：使用凝胶色谱柱分离所述标准溶液和待测样品溶液，其中HPLC的流动相为乙腈、水和三氟乙酸的混合液；且使用紫外光谱仪或二极管阵列检测器检测并计算得到乳制品中乳清蛋白组分牛乳IgG、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液中牛乳IgG标准品、α-乳清蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品和β-乳球蛋白标准品的浓度分别为0.005％、0.01％、0.01％和0.02％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液中还包括溶解于磷酸盐缓冲液中的乳铁蛋白标准品，且其中乳铁蛋白标准品的重量浓度为0.0001～0.001％，优选为0.0005％，且所述乳铁蛋白标准品中乳铁蛋白的含量为＞90％。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C之前还包括对所述标准溶液和待测样品溶液使用含孔径为0.22μm膜的过滤器过滤。

5.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C中使用的色谱柱包括两根串联的TSK G3000PW_Xl凝胶柱和一根预柱PW_Xl，优选所述预柱的直径为6mm且长度为4cm。

6.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，用于配制标准溶液的标准品中牛乳IgG、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的含量分别为＞90％、＞95％、＞90％和＞90％。

7.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述紫外光谱仪的检测器波长设定为215nm或280nm。

8.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述流动相为乙腈35-55wt％和水45-65wt％的混合溶液中加入0.1-0.2wt％的三氟乙酸而得到。