CN115463647A - 一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用 - Google Patents

一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质分离专用固定相的制备方法，本申请中，常见的廉价鸡蛋白、鸭蛋白等蛋白被键合在甲基丙烯酸缩水甘油酯‑二乙烯基苯共聚物微球表面，形成蛋白质分离专用固定相。本发明所提供的合成方法条件简单、环境温和，所制备的蛋白质分离专用固定相依“相似相亲”原理实现分离，再者由于键合的蛋白质非单一组分，因此对待测蛋白可以产生特殊的分离选择性和优异的样品负载量。本发明采用聚合物微球基质，相比于硅胶键合固定相，具有更广泛的pH耐受范围，所用键合蛋白来源广泛、成本低廉，可以规模生产用于蛋白的制备。

Description

一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用
技术领域：
本发明涉及色谱分离固定相技术领域，具体地说，是一种蛋白分离专用固定相的制备方法及其应用。
背景技术：
蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命生长发育的各个阶段都起着很重要的作用。进行蛋白的高效率和高灵敏度的分离和分析研究是现代药物分析、分析化学及生命科学研究的热点领域之一。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。因此，发展多元化的适用于蛋白分离的固定相显得尤为重要。
蛋白键合类固定相具有独特的三维结构，这种立体选择性使得其在蛋白分离过程中呈现出独特的分离效果，因而成为在色谱分离蛋白中极具吸引力的固定相之一。目前，已有多种蛋白键合色谱固定相，如牛血清白蛋白(高等化学学报，2002,7:1251～1254)、人血清白蛋白(中国发明专利CN 103623796A)等，已经商品化的如ChromTech公司的α1-酸性糖蛋白柱。但是这类固定相多以硅胶为基质，硅胶pH耐受范围为2～8，而流动相pH和有机相比例都对蛋白分离影响甚巨，这无疑在蛋白分析方法建立的过程中极大的限制了分离模式的选择。此外，此类蛋白柱普遍存在样品容量小、价格昂贵等现象，不适用于规模化的制备。
甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物微球(GMA-DVB)具有pH耐受范围广，机械强度高、溶胀系数小等特点，能够在较极端的pH环境下保持良好的性能，也能够耐受较高压力，很适合用作蛋白分离固定相的基质，且其表面含有丰富的环氧基，易于蛋白键合等改性修饰。GMA-DVB合成方法较为成熟，成本相对较低，在其表面进行合适的改性使其适用于蛋白分离，可以极大的降低蛋白分离固定相的成本，从而让其用于规模化的制备成为可能。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛋白分离专用固定相的制备及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种蛋白分离分离专用固定相的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
(1)GMA-DVB聚合物微球的平衡：将0.1～10g聚合物微球分散于10～50mL的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1～0.5mol/L，pH 7.0～8.0)中，于20～40℃下震荡10～20min后静置1～2h，优选为1h，过滤后固体产物中加入10～50mL，优选为40mL磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01～0.1mol/L，pH 7.0～8.0)；
(2)乳清蛋白的键合：将1～10g蛋清溶解于10～50mL质量浓度为0.5～1.5％的氯化钠溶液中，过滤残渣，待步骤(2)中聚合物微球与缓冲溶液平衡0.5～1h，优选为1h后，将配制好的蛋清溶液加入其中，在20～30℃，优选为30℃下，以100～200r/min速率震荡12～24h；
(3)：材料的清洗干燥：用质量浓度为0.5～1.5％氯化钠水溶液清洗掉未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤1～5次后，产物于50～60℃干燥12～24h，得到蛋白分离专用固定相。
步骤(1)中，所述的聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物(GMA-DVB)微球。
步骤(1)中，所述GMA-DVB聚合物微球的制备方法：于三口烧瓶中加入1.0～2.0g的聚苯乙烯乳液和20～30mL质量浓度0.1～0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，同时于一烧杯中加入20～50mL的质量浓度0.1～0.5％的SDS溶液和5～10mL的邻苯二甲酸丁酯(DBP)，将烧杯中的溶液超声乳化至表面无油滴后加入到三口烧瓶中，于机械搅拌50～100rpm，水浴20～50℃条件下反应20～24h。
称取1.0～5.0g过氧化苯甲酰(BPO)、10～20mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、10～20mL二乙烯基苯(DVB)和20～50mL甲苯于一个烧杯中，于另一个烧杯中加入1～3g的SDS和200～500mL的聚乙烯醇(PVA,wt％,1～5％)，搅拌溶解，将第一个烧杯中的溶液倒入另一个烧杯中进行超声乳化，至表面无油滴后加入到上述三口烧瓶中，继续在水浴20～50℃条件下反应20～24h。将反应体系的温度升至70～90℃，氮气保护下继续反应20～24h。反应溶液抽滤，残余固体用热水洗涤至无泡沫后转移至20～40mL无水乙醇中，超声分散后抽滤，得到GMA-DVB的基球粗品。将GMA-DVB的基球粗品分散于二氯甲烷溶液中，搅拌20～24h后抽滤，残余固体重新分散于20～40mL无水乙醇中沉降，重复沉降1～3次后于50～60℃的烘箱中干燥12～24h，得GMA-DVB微球。
步骤(2)中，所述蛋清溶液为鸡蛋清、鸭蛋清中的一种或者是两者的混合溶液。
步骤(2)中，所述蛋清和聚合物微球的质量比为1:0.1～1:5,优选为1:1。
所制备的蛋白分离专用固定相可以被装填到色谱柱中，完成蛋白质的分离分析和制备。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
本发明制备得到的蛋白分离专用固定相将廉价易得的鸡蛋白、鸭蛋白等蛋白键合在聚合物微球基质上，依“相似相亲”原理实现分离，再者由于键合的蛋白质非单一组分，因此对待测蛋白具有特殊的分离选择性和优异的样品负载量。相比于硅胶键合固定相，本发明采用聚合物微球基质，具有更广泛的pH耐受范围，所用键合蛋白来源广泛、成本低廉，可以规模生产用于蛋白的制备。
附图说明：
附图1为本发明提供的一种实施方式的蛋白质分离专用固定相的制备流程图；
附图2为本发明提供的一种应用实施方式的卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在蛋白质分离专用固定相上的分离谱图。
附图3为本发明提供的一种应用对比方式的卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物(GMA-DVB)微球上的分离谱图。
附图4为本发明提供的一种应用实施方式的在蛋白质分离专用固定相上从新鲜牛乳中分离β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的液相色谱谱图。
具体实施方式：
以下提供本发明一种蛋白分离专用固定相的制备方法：
实施例1:
按照图1所示流程，在GMA-DVB聚合物微球的表面键合鸡蛋清蛋白制备蛋白分离专用固定相，其具体步骤为：
(1)于三口烧瓶中加入2.0g的聚苯乙烯乳液和30mL质量浓度0.2％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，同时于一烧杯中加入50mL的质量浓度0.2％的SDS溶液和7.7mL的邻苯二甲酸丁酯(DBP)，将烧杯中的溶液超声乳化至表面无油滴后加入到三口烧瓶中，于机械搅拌60rpm，水浴30℃条件下反应24h。
称取1.0g过氧化苯甲酰(BPO)、14mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、15.6mL二乙烯基苯(DVB)和33.4mL甲苯于第一个烧杯中，于另一个烧杯中加入1.25g的SDS和300mL的聚乙烯醇(PVA,wt％,2％)，搅拌溶解，将第一个烧杯中的溶液倒入另一个烧杯中进行超声乳化，至表面无油滴后加入到上述三口烧瓶中，继续在水浴30℃条件下反应24h。将反应体系的温度升至70℃，氮气保护下继续反应24h。反应溶液抽滤，残余固体用热水洗涤至无泡沫后转移至40mL无水乙醇中，超声分散后抽滤，得到GMA-DVB的基球粗品。将GMA-DVB的基球粗品分散于40mL二氯甲烷溶液中，搅拌24h后抽滤，残余固体重新分散于40mL无水乙醇中沉降，重复沉降2次后于60℃的烘箱中干燥过夜，得GMA-DVB微球。
(2)将5g GMA-DVB微球分散于40mL磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1mol/L，pH 8.0)中，于30℃下震荡15min后静置1h，过滤后加入40mL磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01mol/L，pH 8.0)；
(3)将5g鸡蛋清溶解于40mL质量浓度为0.9％的氯化钠溶液中，过滤残渣，待步骤(2)中聚合物微球与缓冲溶液平衡1h，将配制好的蛋清溶液加入其中，在30℃下，以200r/min速率震荡20h；
(4)用质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液清洗掉未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤5次后，产物于60℃干燥12h，得到蛋白分离专用固定相。
实施例2:
(1)将2.5g实施例1中制备的GMA-DVB微球分散于50mL磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1mol/L，pH 8.0)中，于25℃下震荡20min后静置2h，过滤后加入50mL磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01mol/L，pH 8.0)；
(2)将5g鸭蛋清溶解于50mL质量浓度为0.9％的氯化钠溶液中，过滤残渣，待步骤(1)中聚合物微球与缓冲溶液平衡0.5h，将配制好的蛋清溶液加入其中，在25℃下，以150r/min速率震荡24h；
(3)用质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液清洗掉未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤5次后，产物于60℃干燥12h，得到蛋白分离专用固定相。
应用实施例1：
取实施例1所述蛋白分离专用固定相2.3g，在150kg/cm3压力下用浆液法装入内径4.6mm，长150mm的不锈钢色谱柱中，在高效液相色谱上，以水(含5mmol/L磷酸氢二钾，pH＝8.0)：乙腈＝30：70(V/V)作流动相，流速为1mL/min，柱温：30℃，检测波长为：290nm，对卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白三种蛋白的混合标准溶液(浓度均为50μg/mL)进行分离，得到如图2所示色谱图。卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白基本完全基线分离，说明本发明制备出的色谱固定相对蛋白质具有特殊的选择性和良好的分离效果。
应用对比例1：
取实施例1中步骤(1)所述GMA-DVB微球2.3g，在150kg/cm3压力下用浆液法装入内径4.6mm，长150mm的不锈钢色谱柱中，在高效液相色谱上，以水(含5mmol/L磷酸氢二钾，pH＝8.0)：乙腈＝30：70(V/V)作流动相，流速为1mL/min，柱温：30℃，检测波长为：290nm，对卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白三种蛋白的混合标准溶液(浓度均为50μg/mL)进行分离，得到如图3所示色谱图。卵清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白无法达到基线分离，说明直接采用甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物(GMA-DVB)微球进行蛋白分离无法产生良好的分离效果。
应用实施例2：
取实施例2所述蛋白分离专用固定相2.7g，在150kg/cm3压力下用浆液法装入内径4.6mm，长250mm的不锈钢色谱柱中，在高效液相色谱上，以水(含5mmol/L磷酸氢二钾，pH＝8.0)-乙腈作流动相，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温：30℃，检测波长为：290nm，对新鲜牛乳进行分离，进样量20μL，进样前牛乳过孔径0.45μmPES滤膜(聚醚砜，天津市津腾实验设备有限公司)，得到如图4所示色谱图。β-乳球蛋白和α-乳白蛋白与牛乳中其他组分基线分离，分离度良好，满足制备的要求，说明本发明制备出的色谱固定相能够实现牛乳中的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白规模化制备。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种蛋白分离分离专用固定相的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
(1)将0.1～10g聚合物微球分散于10～50mL(优选范围为20～40mL)的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1～0.5mol/L(优选范围为0.1～0.3mol/L)，pH 7.0～8.0)中，于20～40℃下震荡10～20min后静置0.5～4h(优选范围为1～2h)，过滤后固体产物中加入10～50mL(优选范围为20～40mL)磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01～0.1mol/L(优选范围为0.01～0.05mol/L)，pH 7.0～8.0)；
(2)将1～10g(优选范围为2～7g)蛋清溶解于10～50mL(优选范围为20～40mL)质量浓度为0.5～1.5％(优选范围为0.7～1.0％)的氯化钠溶液中，过滤除去固体残渣，得蛋清溶液；待步骤(1)中聚合物微球与缓冲溶液平衡0.5～2h(优选范围为0.5～1h)后，将配制好的蛋清溶液加入其中，在20～30℃(优选范围为25～30℃)，以100～200r/min速率震荡12～24h；
(3)用质量浓度为0.5～1.5％氯化钠水溶液清洗掉聚合物微球上未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤1～5次后，产物于50～60℃干燥12～24h，得到蛋白分离专用固定相。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物(GMA-DVB)微球。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，GMA-DVB聚合物微球的制备：于三口烧瓶中加入1.0～2.0g的聚苯乙烯乳液和20～30mL质量浓度0.1～0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，同时于一烧杯中加入20～50mL的质量浓度0.1～0.5％的SDS溶液和5～10mL的邻苯二甲酸丁酯(DBP)，将烧杯中的溶液超声乳化至表面无油滴后加入到三口烧瓶中，于机械搅拌50～100rpm，水浴20～50℃条件下反应20～24h；
称取1.0～5.0g过氧化苯甲酰(BPO)、10～20mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、10～20mL二乙烯基苯(DVB)和20～50mL甲苯于第一个烧杯中，于另一个烧杯中加入1～3g的SDS和200～500mL的聚乙烯醇(PVA,wt％,1～5％)，搅拌溶解，将第一个烧杯中的溶液倒入另一个烧杯中进行超声乳化，继续在水浴20～50℃条件下反应20～24h；将反应体系的温度升至70～90℃，氮气保护下继续反应20～24h；反应溶液抽滤，残余固体用温度为50～70℃的水洗涤后转移至20～40mL无水乙醇中，超声分散后抽滤，得到GMA-DVB的基球粗品；将GMA-DVB的基球粗品分散于20～40mL二氯甲烷溶液中，搅拌20～24h后抽滤，残余固体重新分散于20～40mL无水乙醇中沉降，重复沉降1～3次后于50～60℃的烘箱中干燥12～24h，得GMA-DVB微球。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述蛋清为鸡蛋清、鸭蛋清中的一种或者是两者的混合溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述蛋清和聚合物微球的质量比为1:0.1～1:5，优选范围为1:0.1～1:1。
6.一种权利要求1-5任一所述制备方法制备获得的固定相。
7.一种权利要求6所述固定相在蛋白分离过程中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，分离的蛋白样品为哺乳动物乳汁(如：牛奶)，用于其中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白中一种或二种以上的分离。
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