CN102604915A - 从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，通过聚乙二醇8000分级沉淀蛋白质，然后采用Q Sepharose FF阴离子交换层析进行分离，可以一次性获得卵粘蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白，且蛋白质产品纯度高，回收率较好，该方法仅需常用层析填料即可进行，大幅度缩减了生产成本，为蛋清中蛋白质提取的大规模工业生产提供了有利条件。

Description

从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域，具体地指一种从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法。
背景技术
鸡蛋清来源广泛，价格低廉，干物质中蛋白质含量超过80％，是最理想的蛋白质资源之一。鸡蛋清蛋白质具有优良的功能特性，如凝胶性、起泡性和成膜性，已经广泛应用于食品加工业和其它制造业领域，取得了巨大的应用价值。然而鸡蛋清蛋白质所具有的生物活性具有更加广阔的应用前景。如溶菌酶的抗菌活性、卵转铁蛋白结合铁的特性、卵粘蛋白的抗病毒活性，以及卵黄素蛋白结合核黄素的活性，这些重要的生物活性已经引起广大科研工作者的强烈关注。在生命健康越来越受到关注的今天，鸡蛋清蛋白质的生物活性使其在保健食品和生物医学领域具有巨大的潜在应用价值。
现有国内鸡蛋清蛋白质的分离纯化技术主要为一种或两种蛋白质的分离纯化，更多种类的蛋白质联合提取技术鲜见报道。国外有少量使用液相层析技术联合提取多种鸡蛋清蛋白质的报道，但存在提取效率低、蛋白质纯度不高、需多种层析填料且填料价格高等问题，制备成本较高，在大规模工业生产应用上还存在很大的局限性。
发明内容
本发明的目的为了填补国内鸡蛋清中多种蛋白质联合提取的技术空白，提供一种提取效果好，产品纯度高，适于工业化生产的从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法。
为实现上述目的，本发明所设计的从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法包括以下步骤：
(1)新鲜鸡蛋清用等体积的20～100mM氯化钠溶液稀释后混匀，调节pH值至5.0～8.0，得到处理好的蛋清稀释液；
(2)向蛋清稀释液中，边搅拌边加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀释液中质量百分比浓度为2～6％，优选为2.7～4.5％，充分搅拌2～12小时后离心分离，得到沉淀A和上清A，在上清A中继续添加聚乙二醇8000至其质量百分比浓度为8～12％，优选为8.6～10.0％，充分搅拌2～12小时后离心，得到沉淀B和上清B，上清B中再继续添加聚乙二醇8000至其质量百分比浓度为14～18％，优选为14.8～16.3％，充分搅拌2～12小时后离心，得到沉淀C和上清D；该步骤中充分搅拌时间均优选为2～4小时；
(3)将沉淀A悬浮于200～800mM氯化钠溶液中，充分搅拌悬浮4～24小时后离心，所得新的沉淀悬浮于蒸馏水中，充分搅拌后离心，重复悬浮于蒸馏水中并离心一次，以洗去氯化钠，收集沉淀，即得卵粘蛋白；
(4)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF阴离子交换层析进行分离，然后用氯化钠溶液分步洗脱，所得各洗脱峰分别收集，透析后冷冻干燥得到多个待鉴定的蛋白质产品；
(5)多个待鉴定的蛋白质产品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，合并相同蛋白质产品，即得溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白。
其中，所述步骤(4)中的用氯化钠溶液分步洗脱优选为依次使用含有0.05～0.12M、0.15～0.25M和0.28～0.50M氯化钠的Tris-HCl缓冲液以相同流速进行分步洗脱，更优选为依次使用含有0.07～0.09M、0.16～0.21M和0.29～0.40M氯化钠的Tris-HCl缓冲液以相同流速进行分步洗脱。
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0～8.5，浓度为10～100mM，所述含氯化钠的Tris-HCl缓冲液的流速为2.0～3.0mL/min。
本发明所述的从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，可以一次性获得卵粘蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白五种蛋白质，和现有的从蛋清中分离一至两种蛋白质的方法相比提高了抽提效率和原料的利用率。
本方法采用聚乙二醇分级沉淀预分离、离子交换层析纯化的技术路线，聚乙二醇分级沉淀法与现有技术中常采用的硫酸铵盐析沉淀法相比，具有以下优势：其一、条件温和，有利于保持蛋白质的天然构象和生物活性；其二、沉淀所得蛋白质产品经溶解后即可直接进行离子交换层析，不需要脱盐处理，缩短了时间(约缩短24小时)，降低了大量蒸馏水消耗；其四、聚乙二醇性质稳定，无环境危害，不会导致水质富营养化等问题。在预分离过程中，通过优化聚乙二醇8000分级沉淀的浓度范围，使蛋清中几种主要的蛋白质成分有效分开，其中卵粘蛋白全部存在于沉淀A中，卵黄素蛋白主要存在于沉淀B中，溶菌酶和卵转铁蛋白主要存在于沉淀B和C中，而大部分的卵清蛋白存在于上清D中，每种蛋白质在其对应的沉淀中已经具有较好的纯度，从而使后续的Q Sepharose FF阴离子交换层析仅需采用一种层析填料即可获得高纯度的蛋白，无需更换填料，简化了操作步骤，进一步缩短了提取蛋白质的时间。本发明中的Q Sepharose FF阴离子交换层析可采用市售常用填料，价格低，性能稳定，且支持工业化应用，在生产规模从实验室扩大至中试和工业化的过程中，其相关技术参数不需再次优化。
本发明的有益效果：通过从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法可以在一次提取过程中同时获得五种蛋白质，且蛋白质产品纯度高，回收率较好，该方法仅需常用层析填料即可进行，大幅度缩减了生产成本，为蛋清中蛋白质提取的大规模工业生产提供了有利条件。
附图说明
图1为本发明的从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法的流程示意图；
图2为沉淀A、B、C和上清D的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3为沉淀B的阴离子交换层析图谱；
图4为沉淀C的阴离子交换层析图谱；
图5为上清D的阴离子交换层析图谱；
图6为沉淀B、C和上清D经阴离子交换层析所得各峰的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7为溶菌酶产品的HPLC图谱；
图8为卵转铁蛋白产品的HPLC图谱；
图9为卵清蛋白产品的HPLC图谱；
图10为卵黄素蛋白产品的HPLC图谱；
其中，OVM为卵粘蛋白、LYZ为溶菌酶、OVT为卵转铁蛋白、OVA为卵清蛋白、OVF为卵黄素蛋白、EW为鸡蛋清。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例
一、样品前处理：将新鲜的鸡蛋打蛋，使用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，收集蛋清。
二、蛋白质提取：
(1)取1.0L蛋清，边搅拌边向蛋清中加入等体积的50mM氯化钠溶液，搅拌2小时以混合均匀，然后用浓度为2Mol/L的盐酸调pH值到6.0，即得处理好的蛋清稀释液；
(2)向蛋清稀释液中，边搅拌边加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀释液中质量百分比浓度为2.7～4.5％，此时溶液中产生沉淀，利用磁力搅拌充分扩散2小时，得到悬浊液，然后在4℃、转速为15000×g的条件下离心10分钟，得到沉淀A和上清A；
(3)向上清A中继续添加聚乙二醇8000至其在上清A中质量百分比浓度为8.6～10.0％，充分搅拌2小时，然后在4℃、转速为12000×g条件下离心10分钟，得到沉淀B和上清B；
(4)向上清B中进一步添加聚乙二醇8000至其在上清B中质量百分比浓度为14.8～16.3％，充分搅拌2小时，然后在4℃、转速为12000×g条件下离心10分钟，得到沉淀C和上清D。将沉淀A、B、C和上清D取样，进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳，结果如图2所示，可以初步鉴定其中所含的蛋白质成分。
三、蛋白质分离与纯化：
(1)将沉淀A悬浮于500mM氯化钠溶液中，4℃下搅拌4小时，然后在4℃、15000×g下离心10分钟，除去大部分的溶菌酶、卵清蛋白、卵转铁蛋白，收集所得的沉淀A1，再将沉淀A1在蒸馏水中悬浮2小时，并于同样条件下离心分离，再悬浮于蒸馏水中并离心一次，以洗去氯化钠，收集沉淀，真空冷冻干燥后得到3.38g卵粘蛋白产品，其SDS-聚丙酰胺凝胶电泳显示如图2中的OVM，使用凝胶成像分析软件计算其纯度为82.40％，将卵粘蛋白产品于零下20℃下贮存。
(2)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF阴离子交换层析进行分离：将Q Sepharose FF阴离子交换填料装填入层析柱(50×5cm)中，用Tris-HCl缓冲液(pH8.0，20mM)，以2mL/min的流速平衡层析柱2小时。
取沉淀B，溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0，20mM)中，4℃下12000×g离心10分钟以除去少量不溶物，然后注入到阴离子交换层析柱中。先用Tris-HCl缓冲液(pH8.0，20mM)以2mL/min的流速冲洗层析柱，随后分别用含有0.07、0.16和0.40M氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，20mM)以相同流速进行分步洗脱。分别收集洗脱过程中产生的各个峰，将各峰收集液用蒸馏水透析四次，然后冷冻干燥。沉淀C和上清D也使用相同的方法进行分离，如图3～5所示，得到和沉淀B、C和上清D中各个峰相对应的多个待鉴定的蛋白质产品的冻干粉B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、D1、D2、D3。
(3)SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定：采用12％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
将上述待鉴定的蛋白质产品的冻干粉称取约10毫克，溶解于5毫升的双蒸水中，充分溶解后取80微升溶液，加入20微升的蛋白上样缓冲液(5倍浓度)，混匀后沸水浴加热约5分钟，冷却后取5微升注入到点样孔中，恒定电压100V进行电泳。电泳完成后，首先使用固定液(50％乙醇，10％乙酸)对凝胶进行固定30分钟，然后用考马斯亮蓝R-250溶液(R-250含量0.1％，同时含有25％乙醇、8％乙酸)在45℃下染色30分钟，染色完成后转移至脱色液(25％乙醇和8％乙酸)中脱色，至背景颜色褪去、条带清晰为止。使用软件对电泳条带进行分析，计算相对分子量。所得的电泳图如图6所示，B1中所含的蛋白质为溶菌酶，B2中所含的蛋白质为卵转铁蛋白，B3中所含的蛋白质为卵清蛋白，B4中所含的蛋白质为卵黄素蛋白，C1中所含的蛋白质为溶菌酶，C2中所含的蛋白质为卵转铁蛋白，C3中所含的蛋白质为卵清蛋白，D1和D2中未含目的蛋白质，D3中所含的蛋白质为卵清蛋白。将相同蛋白组分合并，B1、C1混合为1.57g溶菌酶产品，B2、C2混合为15.51g卵转铁蛋白产品，B3、C3和D3混合为138.46g卵清蛋白产品，B4为2.10g卵黄素蛋白产品。
四、纯度测定及回收率计算
(1)蛋白质产品中的蛋白质含量测定
卵粘蛋白产品采用凯氏定氮法测定蛋白含量。溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白产品采用考马斯亮蓝试剂盒法测定蛋白含量。各蛋白质产品中的蛋白含量测定结果如下：
Figure BDA0000147216820000061
(2)蛋白质产品纯度测定：卵粘蛋白产品的纯度已在沉淀A的分离纯化步骤中用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定。溶菌酶产品、卵转铁蛋白产品、卵清蛋白产品和卵黄素蛋白产品的纯度使用Grace Vydac C4(214TP，5μm，250×4.6mm)反相高效液相色谱柱进行测定。用含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液以1.0mL/min的流速进行线性梯度洗脱，首先用5％乙腈溶液平衡色谱柱5分钟，然后在15分钟内乙腈浓度由5％升高至80％，再在1分钟内降至5％，并维持4分钟。柱温度维持在35℃。用Waters e2695光电二极管检测器在280nm下进行检测。由软件对峰面积进行积分，根据峰面积比对各蛋白质产品纯度进行定量计算。各蛋白质产品纯度测定结果如下(图7～10)：
Figure BDA0000147216820000071
(3)回收率计算
根据从250g鸡蛋清中纯化所得各种蛋白质产品的质量、蛋白含量和纯度，使用以下公式计算所得的各个蛋白质的回收率，
Figure BDA0000147216820000072
需要说明的是，根据文献报道，新鲜蛋清中蛋白质含量以10.2％计算，卵粘蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白占蛋清总蛋白质的比例分别以3.4％、3.5％、12％、54％和0.5％计算，将其作为理论数值与本实施例所得的各蛋白质产品进行对比，结果见下表：
Figure BDA0000147216820000073
Figure BDA0000147216820000081
上表显示，采用本发明所述的从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，获得了较好的回收率，产品纯度高。

Claims (5)

1.一种从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)新鲜鸡蛋清用等体积20～100mM氯化钠溶液稀释后混匀，调节pH值至5.0～8.0，得到处理好的蛋清稀释液；
(2)向蛋清稀释液中，边搅拌边加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀释液中质量百分比浓度为2～6％，充分搅拌2～12小时后离心分离，得到沉淀A和上清A，在上清A中继续添加聚乙二醇8000至其在上清A中质量百分比浓度为8～12％，充分搅拌2～12小时后离心，得到沉淀B和上清B，上清B中再继续添加聚乙二醇8000至其在上清B中质量百分比浓度为14～18％，充分搅拌2～12小时后离心，得到沉淀C和上清D；
(3)将沉淀A悬浮于200～800mM氯化钠溶液中，充分搅拌悬浮4～24小时后离心，所得沉淀A1悬浮于蒸馏水中，充分搅拌后离心，再悬浮于蒸馏水中并离心一次，以洗去氯化钠，收集沉淀，即得卵粘蛋白；
(4)沉淀B、C和上清D分别使用Q Sepharose FF阴离子交换层析进行分离，然后分别用氯化钠溶液分步洗脱，所得各洗脱峰分别收集，透析后冷冻干燥得到多个待鉴定的蛋白质产品；
(5)对多个待鉴定的蛋白质产品进行取样，并经SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，合并相同蛋白质产品，即得溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白和卵黄素蛋白。
2.根据权利要求1所述从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的用氯化钠溶液分步洗脱为用含有0.05～0.12M、0.15～0.25M和0.28～0.50M氯化钠的Tris-HCl缓冲液以相同流速进行分步洗脱。
3.根据权利要求2所述从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0～8.5，浓度为10～100mM，所述含氯化钠的Tris-HCl缓冲液的流速为2.0～3.0mL/min。
4.根据权利要求1或2或3所述从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤(2)向蛋清稀释液中，边搅拌边加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀释液中质量百分比浓度为2.7～4.5％，充分搅拌2～4小时后离心分离，得到沉淀A和上清A，在上清A中继续添加聚乙二醇8000至其在上清A中质量百分比浓度为8.6～10.0％，充分搅拌2～4小时后离心，得到沉淀B和上清B，上清B中再继续添加聚乙二醇8000至其在上清B中质量百分比浓度为14.8～16.3％，充分搅拌2～4小时后离心，得到沉淀C和上清D。
5.根据权利要求2所述从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的用氯化钠溶液分步洗脱为用含有0.07～0.09M、0.16～0.21M和0.29～0.40M氯化钠的Tris-HCl缓冲液以相同流速进行分步洗脱。
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