CN109846051A

CN109846051A - 卵黏蛋白水解物在抑制幽门螺旋杆菌粘附中的应用

Info

Publication number: CN109846051A
Application number: CN201910121812.4A
Authority: CN
Inventors: 孙晓宏; 张凇源; 任健; 刘晓兰
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109846051B

Abstract

本发明提供了卵黏蛋白水解物在抑制幽门螺旋杆菌粘附中的应用，涉及蛋白质应用技术领域。本发明所述卵粘蛋白水解物在浓度为10g/L时，无论采用抗粘附样品与H.pylori优先混合的方式还是采用抗粘附样品与人胃粘膜上皮细胞(GES‑1)优先混合的方式测定，均具有良好的抗H.pylori粘附活性。本发明所述抑制剂是天然、安全、价格低廉、高效的抗H.pylori粘附的新产品，可以作为功能食品配料和营养品，具有替代抗生素的潜力。

Description

卵黏蛋白水解物在抑制幽门螺旋杆菌粘附中的应用

技术领域

本发明属于蛋白质分离与应用技术领域，具体涉及卵黏蛋白的提取方法、卵黏蛋白水解物的制备方法及其应用。

背景技术

我国是世界第一产蛋大国，蛋产量占世界总产量的40％。然而，我国蛋制品的深加工及综合利用程度极低，鸡蛋制品消费仍以鲜蛋为主，导致蛋品附加值低，禽蛋产业利润空间有限。具体地，世界平均蛋制品加工量占其产量10％，发达国家蛋制品加工量占鲜蛋总量的20％～30％。相比而言，我国的蛋品加工量不足产量的5％，主要以普通蛋粉为主，产品缺乏创新，用于深加工的仅占0.7％～1％(王芳，低磷鸡蛋蛋白粉的制备及功能特性研究.江南大学硕士学位论文，2016；姚冰冰，蛋制品深加工：前景虽好，问题多多.中国食品学报，2014，7,1-3；陈海英，鸡蛋卵黄高磷蛋白乳化特性研究.江南大学博士学位论文，2013)。另外，由于我国的某些饮食习惯和一些行业的特殊需求，蛋清被当成废弃物丢弃，没有对其进行综合开发利用，造成蛋清资源的浪费、环境的污染(黄群，S-卵白蛋白与鸡蛋鲜度相关性及其纯化、性质研究.华中农业大学博士学位论文，2012)。

目前还没有一类利用鸡蛋组分制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂以干扰致病菌粘附宿主细胞的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供卵黏蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用，可天然、安全、价格低廉、高效的抑制幽门螺旋杆菌粘附，可用于功能性食品配料或营养品。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了卵黏蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用。

优选的，所述卵黏蛋白水解物的制备方法，包括：将卵黏蛋白、水和蛋白酶混合后酶解3～5h，经灭酶后离心去除沉淀，取上清液冷冻干燥即得卵粘蛋白水解物；所述蛋白酶包括胰蛋白酶、链酶蛋白酶或蛋白酶N。

优选的，所述卵黏蛋白与水的质量体积比为(0.6～1.5)g：100mL，所述卵黏蛋白与所述蛋白酶的质量比为(45～53)：1。

优选的，所述卵黏蛋白的提取方法，包括：(1)将卵清与第一氯化钠溶液混合搅拌得第一浊液，调节所述第一浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第一氯化钠溶液的浓度为80～120mmol/L；

(2)将保藏后的第一浊液离心后收集第一沉淀，将所述第一沉淀与第二氯化钠溶液混合搅拌得第二浊液，调节所述第二浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第二氯化钠溶液的浓度为480～520mmol/L；

(3)将保藏后的第二浊液离心后收集第二沉淀，将所述第二沉淀透析68～75h后冷冻干燥，得卵黏蛋白；所述透析通过分子量为10000Da。

优选的，步骤(1)所述卵清在所述混合前还包括搅拌至均一态，所述搅拌的转速为320～380rpm。

优选的，步骤(1)所述卵清与第一氯化钠溶液的体积比1：(2～5)。

优选的，步骤(2)所述保藏前还包括搅拌，所述搅拌的转速为320～380rpm，所述搅拌的时间为3～5h。

优选的，步骤(2)和步骤(3)所述离心的转速独立地为8000～12000rpm，所述离心的时间独立地为8～12min。

优选的，步骤(2)所述第二氯化钠溶液与卵清的体积比为(2～5)：1。

优选的，步骤(4)所述混合搅拌的转速为320～380rpm，所述混合搅拌的时间为25～40min。

本发明提供了卵黏蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用，在本发明实施例中，所述卵粘蛋白水解物在浓度为10g/L时，采用抗粘附样品与幽门螺旋杆菌优先混合及抗粘附样品与人胃粘膜上皮细胞优先混合的方式共同测定其抗粘附活性，表明所述卵粘蛋白水解物具有良好的抗幽门螺线杆菌粘附活性。

附图说明

图1为菌落浓度与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线；

图2为FITC荧光强度值与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了卵黏蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用。本发明所述应用表现在抗幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞(GES-1)。

本发明所述卵黏蛋白水解物的制备方法，优选包括以下步骤：将卵黏蛋白、水和蛋白酶混合后酶解3～5h，经灭酶后离心去除沉淀，取上清液冷冻干燥即得卵粘蛋白水解物；所述蛋白酶包括链酶蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶N。

在本发明所述制备方法中，将所述卵黏蛋白、水和蛋白酶混合后酶解3～5h，所述混合优选为先将所述卵黏蛋白与所述水混合形成卵黏蛋白水溶液，调节所述卵黏蛋白水溶液的温度和pH值至所述蛋白酶的最适温度和pH值时，再添加所述蛋白酶。本发明所述卵黏蛋白与水的质量体积比优选为0.6～1.5g：100mL，更优选为0.8～1.2g：100mL，最优选为1g：100mL。本发明对所述温度和pH值的调节方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。本发明所述蛋白酶与所述卵黏蛋白的质量比优选为1：(45～53)，更优选为1：(48～52)，最优选为1:50。本发明在所述蛋白酶的最适条件下进行酶解，所述酶解的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。

本发明在所述酶解完成后，经灭酶后离心去除沉淀，取上清液冷冻干燥即得卵粘蛋白水解物。本发明所述灭酶优选为90～100℃条件下加热10～18min，所述灭酶的温度更优选为92～96℃，最优选为95℃。本发明所述灭酶的加热时间优选为12～16min，更优选为15min。本发明所述离心的转速优选为9000～11000rpm，最优选为9500～10000rpm。本发明所述离心的时间优选为12～16min，更优选为13～15min。本发明取所述离心后的上清液冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-60～-70℃，更优选为-64～-68℃。本发明所述冷冻干燥的蒸汽压力优选为0.2～1.0Pa，更优选为0.25～0.6Pa，最优选为0.3Pa。本发明所述冷冻干燥的时间优选为46～50h，最优选为48h。

本发明对所述卵黏蛋白的提取方法，并没有特殊限定，优选包括以下步骤：(1)将卵清与第一氯化钠溶液混合搅拌得第一浊液，调节所述第一浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第一氯化钠溶液的浓度为80～120mmol/L；

在本发明所述提取方法中，将卵清与第一氯化钠溶液混合搅拌得第一浊液，调节所述第一浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第一氯化钠溶液的浓度为80～120mmol/L。本发明对所述卵清的来源并没有特殊限定，优选的用70％酒精擦鸡蛋壳清洗消毒后破碎，将蛋清和蛋黄分离，同时去除卵黄系带，得蛋清。本发明所述卵清在所述混合前优选还包括搅拌至均一态，所述搅拌优选为磁力搅拌。本发明所述搅拌的转速优选为320～380rpm，更优选为330～360rpm，最优选为350rpm。本发明将所述卵清与第一氯化钠溶液混合搅拌得第一浊液，所述卵清与第一氯化钠溶液的体积比优选为1：(2～5)，更优选为1：(2.5～4)，最优选为1:3。本发明所述第一氯化钠溶液的浓度优选为85～110mmol/L，更优选为90～105mmol/L，最优选为100mmol/L。本发明所述混合搅拌的转速优选为320～380rpm，更优选为330～360rpm，最优选为350rpm。本发明所述混合搅拌的时间优选为25～40min，更优选为28～35min，最优选为30min。

本发明调节所述第一浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h，所述第一浊液的pH值优选为5.9～6.1，更优选为6.0。本发明对所述pH值的调节并没有特殊限定，优选在搅拌的状态下用1mol/L的盐酸调节。

本发明将保藏后的第一浊液离心后收集第一沉淀，将所述第一沉淀与第二氯化钠溶液混合搅拌得第二浊液，调节所述第二浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第二氯化钠溶液的浓度为480～520mmol/L。本发明所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为8500～10500rpm，最优选为10000rpm。本发明所述离心的温度优选为4℃。本发明所述离心的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。

本发明将所述第一沉淀与第二氯化钠溶液混合搅拌得第二浊液，所述第二氯化钠溶液的浓度优选为485～515mmol/L，更优选为490～510mmol/L，最优选为500mmol/L。本发明所述第二氯化钠溶液与卵清的体积比优选为(2～5)：1，更优选为(2.5～4)：1，最优选为3:1。本发明所述混合搅拌时的转速优选为320～380rpm，更优选为330～360rpm，最优选为350rpm。本发明优选调节所述第二浊液的pH值为5.9～6.1，更优选为6。本发明对所述pH值的调节并没有特殊限定，优选在搅拌的状态下用1mol/L的盐酸调节。本发明在所述调节pH值时，优选还包括搅拌，所述搅拌的转速优选为320～380rpm，更优选为330～360rpm，最优选为350rpm。本发明所述搅拌的时间优选为3～5h，更优选为3.5～4.5h，最优选为4h。

本发明将保藏后的第二浊液离心后收集第二沉淀，将所述第二沉淀透析68～75h后冷冻干燥，得卵黏蛋白；所述透析通过分子量为10000Da。本发明所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为8500～10500rpm，最优选为10000rpm。本发明所述离心的温度优选为4℃。本发明所述离心的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。本发明所述透析优选为将所述第二沉淀置于10,000Da的透析袋内，在清水中进行透析，所述透析的时间优选为70～74h，更优选为71～73h，最优选为72h。本发明优选将透析袋中的物质收集并进行冷冻干燥，干燥后的白色雪花状物质即为卵粘蛋白。

下面结合实施例对本发明提供的卵黏蛋白提取方法，卵黏蛋白水解物的制备方法以及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

第一天，用70％酒精擦鸡蛋壳并破碎，将蛋清和蛋黄分离，随后，将收集的去除卵黄系带的蛋清置于冰上，记录蛋清体积。用磁力搅拌器在350rpm转速下搅拌至蛋清呈均一状态，加入3倍记录的蛋清体积的100mM氯化钠溶液，350rpm转速下搅拌30min，在搅拌的状态下用1M盐酸调节pH至6.0，4℃冷藏过夜。

次日，将蛋清溶液在10,000rmp的转速下4℃离心10min，沉淀收集在烧杯中。然后加入3倍记录的蛋清体积的500mM氯化钠溶液，在350rpm转速搅拌的状态下用1M盐酸调节溶液pH至6.0，随后继续搅拌4h，搅拌结束后，4℃冷藏过夜。

第三天，将冷藏过夜的溶液在10,000rmp的转速下4℃离心10min，沉淀收集在烧杯中，使用10,000Da的透析袋在清水中透析三天，最后将透析袋中的物质收集并进行冷冻干燥，干燥后的白色雪花状物质即为卵粘蛋白。

测定实施例提取得到的卵黏蛋白的纯度：

利用高负载16/60凝胶过滤柱(Superdex 200，制备级)结合高效液相色谱(FPLC，GE Healthcare Bio-Sciences AB)测定提取的卵粘蛋白的纯度：首先配制5g/L的卵粘蛋白溶液，溶剂组成包括：100mM的pH7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液中含有50g/L的十二烷基磺酸钠(SDS)和10mL/L的β-巯基乙醇。进样体积为3mL，洗脱溶剂为100mM的pH 7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液中含有5g/L的十二烷基磺酸钠(SDS)和1mL/L的β-巯基乙醇，洗脱速率为1mL/min，在280nm下检测蛋白含量。由于没有商业的卵粘蛋白标准品，因此卵粘蛋白的纯度需要通过减去鸡蛋清中的其它蛋白含量来计算，包括：9％卵白蛋白和2％溶菌酶。因此，卵黏蛋白的纯度为89％。

实施例2

称取卵粘蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至链酶蛋白酶的最适作用pH值7.5，于恒温水浴锅中加热至链酶蛋白酶的最适作用温度50℃。然后，加入20mg链酶蛋白酶，在50℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1M NaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g,10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物。

实施例3

称取卵粘蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至胰蛋白酶的最适作用pH值8.0，于恒温水浴锅中加热至胰蛋白酶的最适作用温度37℃。然后，加入20mg胰蛋白酶，在37℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1M NaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g,10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到胰蛋白酶卵粘蛋白水解物。

实施例4

称取卵粘蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至蛋白酶N的最适作用pH值7.5，于恒温水浴锅中加热至蛋白酶N的最适作用温度55℃。然后，加入20mg蛋白酶N，在55℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1M NaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g,10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到蛋白酶N卵粘蛋白水解物。

利用实施例2～4制备得到的卵黏蛋白水解物进行抗幽门螺旋杆菌(H.pylori)粘附人胃粘膜上皮细胞(GES-1)细胞的活性测定实验：

实验1

幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)的培养

利用H.pylori(43504^TM)菌株作为抗粘附活性实验菌株。冻存的H.pylori菌株37℃解冻后首先与#18液体培养基混合，此菌液随后接种到添加5％脱纤维绵羊血的#260斜面培养基上，在微需氧环境(5％O₂,10％CO₂,85％N₂)37℃条件下培养48～72h，此菌液可用于抗粘附活性检测和菌种传代。

#18液体培养基的配制方法为：称取17g胰蛋白胨、3g大豆蛋白胨、5g氯化钠和2.5g磷酸氢二钾，加入1L蒸馏水，搅拌溶解后调节pH至7.2，121℃灭菌1h。

添加5％去纤维绵羊血的#260斜面培养基配制方法：称取15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂和950mL蒸馏水，搅拌溶解后调节pH至7.2，121℃灭菌1h。当培养基冷却到约47℃时，加入50mL无菌的脱纤维绵羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基。

将上步中用于传代的H.pylori菌液进行4次10倍梯度稀释获得5种不同浓度的菌液，其中用于传代的H.pylori菌液的OD₆₀₀值为1.728，稀释倍数依次递增的菌液的OD₆₀₀值分别为0.5027、0.0537、0.0043和0.0003，同时通过平板涂布法计算其相对应的菌落浓度为3.63×10⁹cfu/mL、3.63×10⁸cfu/mL、3.63×10⁷cfu/mL和3.63×10⁶cfu/mL，建立菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线如图1所示。

实验2

人胃粘膜上皮细胞(GES-1)的培养

将购买于南京科佰生物科技有限公司的GES-1细胞冻存细胞解冻后，1mL首先加入到10mL培养基(包括90％DMEM、10％胎牛血清和1％青链霉素混合液)中，混匀后在1,000rmp转速下离心4min，弃掉上清液，重新加入4～5mL新鲜的培养基后轻轻吹打细胞，细胞分散均匀后，移入T25细胞培养瓶中。在37℃、5％CO₂条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代。消化细胞悬液，以每孔200μL接种到96孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜后，吸出旧培养基，再加入200μL不含抗生素的细胞培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续孵育24h后用于抗H.pylori粘附活性测定实验。

实验3

异硫氰酸荧光素(FITC)标记H.pylori

首先，配制浓度为2mg/mL FITC的DMSO溶液，尼龙膜过滤。与浓度约为2.2×10¹⁰cfu/mL(OD₆₀₀值为1.2)的H.pylori菌液1:1混合，在生化摇摆台上避光混合30min后，4,500g离心3min，弃掉上清液后，用1×PBS缓冲液洗涤三次去除多余的FITC，最后用#18液体培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.2左右(约2×10⁹cfu/mL)，待用。

将FITC标记的H.pylori菌液梯度稀释六个浓度，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值，分别为12511、6990、4012、2020和1046，同时在600nm下测定OD值，分别为0.0127、0.0087、0.0050、0.0017、0.0013，进而建立如图2所示的FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线。

实验4

利用实施例2制备得到的链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物分别以与H.pylori优先混合、与GES-1细胞优先混合的方式进行抗H.pylori粘附活性实验

①卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合

将链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物溶解于不含抗生素的细胞培养基中，浓度分别为0.16g/L、0.31g/L、0.63g/L、1.25g/L、2.50g/L、5.00g/L和10.00g/L，PVDF膜过滤。然后，将链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物溶液(实验组)或细胞培养基(阴性对照组)与FITC标记的菌液1：1(v/v)混合，混匀后避光室温静置30min。随后，将实验2中准备好的96孔板中的细胞用200μL 1×PBS缓冲液冲洗一次，每孔加入100μL链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物与FITC标记的菌液混合液，在微需氧环境(5％O₂,10％CO₂,85％N₂)37℃条件下培养90min，弃掉上清液，用200μL 1×PBS缓冲液冲洗三次。最后，每孔加入100μL PBS缓冲液，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值。根据图2所示标准曲线，通过荧光强度值计算OD₆₀₀值，再根据图1所示标准曲线，求出粘附于GES-1细胞表面的H.pylori菌落浓度，结果如表1所示：

表1不同浓度链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

粘附抑制率用下列公式计算：

粘附抑制率(％)＝(阴性对照组细胞粘附的菌落浓度-实验组细胞粘附的菌落浓度)/阴性对照组细胞粘附的菌落浓度×100

结果表明，10.00g/L的链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为28.6±0.8％。

②卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合

将链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物溶解于不含抗生素的细胞培养基中，浓度分别为0.16g/L、0.31g/L、0.63g/L、1.25g/L、2.50g/L、5.00g/L和10.00g/L，PVDF膜过滤。然后，将实验2中准备好的96孔板中的细胞用200μL 1×PBS缓冲液冲洗一次，每孔加入100μL链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物，在微需氧环境(5％O₂,10％CO₂,85％N₂)37℃条件下培养30min，吸出液体，每孔再加入100μLFITC标记的菌液，微需氧环境(5％O₂,10％CO₂,85％N₂)37℃条件下培养90min，弃掉上清液，用200μL 1×PBS缓冲液冲洗三次。最后，每孔加入100μLPBS缓冲液，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值。根据图2所示标准曲线，通过荧光强度值计算OD₆₀₀值，再根据图1所示标准曲线，求出粘附于GES-1细胞表面的H.pylori菌落浓度。粘附抑制率用下列公式计算：

测算结果如表2所示：

表2不同浓度链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

结果表明，10.00g/L的链酶蛋白酶卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为45.4±2.2％。

实验5

利用实施例3得到的胰蛋白酶卵粘蛋白水解物进行与实验4相同的抗H.pylori粘附活性检测

①卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合

测定的不同浓度胰蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性如表3所示：

表3不同浓度胰蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

结果显示：10.00g/L的胰蛋白酶卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为29.4±4.7％。

②卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合

测定的不同浓度胰蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性如表4所示：

表4不同浓度胰蛋白酶卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

结果显示，10.00g/L的胰蛋白酶卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为44.2±0.8％。

实验6

利用实施例4得到的蛋白酶N卵粘蛋白水解物进行与实验4相同的抗H.pylori粘附活性检测

①卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合

测定的不同浓度蛋白酶N卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性如表5所示：

表5不同浓度蛋白酶N卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

结果显示：10.00g/L的蛋白酶N卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为43.4±1.2％。

②卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合

测定的不同浓度蛋白酶N卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性如表6所示：

表6不同浓度蛋白酶N卵粘蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

结果显示，10.00g/L的蛋白酶N卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合显示了可重复地抗H.pylori粘附活性，粘附抑制率为35.4±8.0％。

对比实验1

1、蛋白酶P卵粘蛋白水解物的制备

称取卵粘蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至蛋白酶P的最适作用pH值7.0，于恒温水浴锅中加热至蛋白酶P的最适作用温度45℃。然后，加入20mg蛋白酶P，在45℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1M NaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g,10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到蛋白酶P卵粘蛋白水解物。

2、利用蛋白酶P卵粘蛋白水解物进行与实验4相同的抗H.pylori粘附活性检测

结果显示，无论是蛋白酶P卵粘蛋白水解物与H.pylori优先混合还是蛋白酶P卵粘蛋白水解物与GES-1细胞优先混合，所有检测浓度的蛋白酶P卵粘蛋白水解物均不具有抗H.pylori粘附活性。

对比实验2

以瑞巴派特作为阳性对照组，使用100μg/mL的浓度进行实验，当抗粘附样品与H.pylori优先混合时，粘附抑制率为23.1±3.6％；当抗粘附样品与GES-1细胞优先混合时，粘附抑制率为21.9±3.3％。

本发明提供了卵黏蛋白水解物在制备幽门螺杆菌粘附抑制剂中的应用，在浓度为10g/L时，采用抗粘附样品与H.pylori优先混合的方式测定其抗粘附活性分别为28.7±2.2％、25.7±2.5％和44.8±0.6％；采用抗粘附样品与GES-1细胞优先混合的方式测定其抗粘附活性分别为45.4±2.2％、44.2±0.8％和35.4±8％，具有良好的抗H.pylori粘附活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.卵黏蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述卵黏蛋白水解物的制备方法，包括：将卵黏蛋白、水和蛋白酶混合后酶解3～5h，经灭酶后离心去除沉淀，取上清液冷冻干燥即得卵粘蛋白水解物；所述蛋白酶包括胰蛋白酶、链酶蛋白酶或蛋白酶N。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述卵黏蛋白与水的质量体积比为(0.6～1.5)g：100mL，所述卵黏蛋白与所述蛋白酶的质量比为(45～53)：1。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述卵黏蛋白的提取方法，包括：(1)将卵清与第一氯化钠溶液混合搅拌得第一浊液，调节所述第一浊液pH值为5.8～6.2，4℃保藏10～16h；所述第一氯化钠溶液的浓度为80～120mmol/L；

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)所述卵清在所述混合前还包括搅拌至均一态，所述搅拌的转速为320～380rpm。

6.根据权利要求5所述提取方法，其特征在于，步骤(1)所述卵清与第一氯化钠溶液的体积比1：(2～5)。

7.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(2)所述保藏前还包括搅拌，所述搅拌的转速为320～380rpm，所述搅拌的时间为3～5h。

8.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述离心的转速独立地为8000～12000rpm，所述离心的时间独立地为8～12min。

9.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，步骤(2)所述第二氯化钠溶液与卵清的体积比为(2～5)：1。

10.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(4)所述混合搅拌的转速为320～380rpm，所述混合搅拌的时间为25～40min。