CN105816414A - 一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用。本发明通过发酵酵母菌，固液分离，得到的上清液和吸附剂混合，加热反应，过滤，得到酵母水A；用水将得到的菌体洗涤，干燥，粉碎，再调整温度为‑25～‑20℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，于‑25～‑5℃粉碎至少60min，得到酵母细胞微粉；将酵母细胞微粉和纯化水混合，超声抽提，过滤，得到酵母水B；将酵母水A和酵母水B合并，加纯化水调整至有效浓度以上的含量，加入抗氧化剂和防腐剂，得到酵母水。该酵母水明显减轻酒糟气味或不良特殊发酵气味，且具有卓越的美容功效，适合用于制备具有抗衰、抗皱、美白、增白、淡斑功效的化妆品。

Description

一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用。

背景技术

酵母是人类利用最早、应用范围最广的微生物。酵母细胞是由约35％～50％的蛋白质、5％～10％的核酸、35％～40％的碳水化合物、2.8％～3.0％的脂质、3％～5％的水分和5.5％～6％的灰分组成，其中碳水化合物包含含有海藻糖、糖原、甘露聚糖、葡聚搪和木聚糖等，酵母菌体的营养物质及活性成分情况如下：

⑴酵母菌体蛋白质含量高且氨基酸组成合理：酵母细胞蛋白质含量为35％～50％，而其它动物性蛋白原料如牛肉、猪肉、鸡蛋、牛乳、干酪和金枪鱼的蛋白质含量分别为16.1％、21.5％、13.1％、33％、35.6％和17.1％，这说明酵母细胞蛋白质含量非常高。此外，酵母细胞还含有大量的人体必需氨基酸，共有天门冬氨酸在内的18种氨基酸，且其氨基酸组成合理，除了蛋氨酸含量不多以外，其它含量几乎与动物肌肉蛋白和牛乳蛋白相同，且氨基酸组成也相似，这说明酵母细胞有很高的利用价值；

⑵酵母细胞含有丰富的维生素和矿物质：众所周知维生素是维持人体健康不可缺少的物质，而酵母中则含有丰富的维生素，包括有环己六醇、VB1、VB2、烟酸、维生素H、胆碱，其含量分别为478、5.7、7.7、50、7.6，还含有海藻糖、辅酶A、辅酶I、细胞色素C、卵磷脂、RNA,凝血质、麦角甾醇等物质。此外，酵母细胞中还含有大量的矿物质，尤其以钙、镁、锰的含量非常高，这也说明酵母细胞有很高的利用价值；

⑶酵母细胞中含有大量的谷胱甘肽：酵母细胞中除了含有上述物质外，还含有大量的谷胱甘肽。谷胱甘肽是谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸构成的三肽，它是大量贮存在肝脏中的生理活性物质，不仅可提高肝功能活动能力并保护肝脏，而且还有一定的预防治疗致癌剂所导致的生理损伤和对放射线损伤的保护作用，同时谷胱甘肽还具有抗氧化和活化免疫作用的生理功能。另外，半胱氨酸是人体的必需氨基酸，当人一体缺乏半胱氨酸时，谷胱甘肽会分解成半胱氨酸而给予补充，说明谷胱甘肽可能是酵母细胞中的主要活性成分之一；

⑷酵母细胞中含有大量的萄聚糖和甘露聚糖：酵母细胞中含有大量的蛋白质，同时也含有大量的碳水化合物，主要是构成细胞壁的葡聚搪和甘露聚糖等多糖体，它们在人体的消化器官中难以被消化掉，作为膳食纤维发挥着如下各种重要的作用：①促进胃肠蠕动，吸收肠内有害物质；②促进肠内有用菌的活化性；③促进胆固醉代谢正常化并抑制血清胆固醇的上升；④增强细胞免疫力，提高巨噬细胞的活性和制癌作用，这说明了酵母细胞的其它利用价值。

近年来随着生物技术的发展，酵母的各种使用价值不断被挖掘出来。酵母除了可以被利用来酿酒、制作面包等发酵食品、作为细胞蛋白资源用来缓解蛋白质食品短缺、制作食品调味剂以及制作保健食品以外，酵母细胞在化妆品行业的开发与应用正日益受到重视。

但目前化妆品使用酵母提取物存在酵母提取利用率不高，酵母水气味不良难以掩盖，使用时添加剂量少等共性问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足与缺陷，提供一种酵母水的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的酵母水。该酵母水具有卓越的美容美肤功效，尤其是在抗皮肤老化及在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性、抑制多巴的自身氧化和加深。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害；促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老的功效。

本发明的再一目的在于提供所述的酵母水的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种酵母水的制备方法，包含以下步骤：

(1)将酵母菌进行活化，然后逐级扩大培养，得到种子液；将种子液接入发酵培养基进行发酵；再将得到的发酵液进行固液分离，得到上清液和菌体；

(2)将步骤(1)得到的上清液和吸附剂混合，加热反应，过滤，得到酵母水A；

(3)用水将步骤(1)得到的菌体洗涤，然后进行固液分离，将得到的固体干燥，粉碎，得到粗粉；再将粗粉置于低温超微粉碎机中，调整温度为-25～-20℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，开启低温超微粉碎机粉碎至少60min，粉碎过程中调整并保持冷冻温度-25～-5℃，得到酵母细胞微粉；将酵母细胞微粉和纯化水混合，超声抽提，过滤，得到酵母水B；

(4)将酵母水A和酵母水B合并，测定混合酵母水中总氮、氨基酸态氮和还原型谷胱甘肽的含量，加纯化水调整至有效浓度以上的含量，加入抗氧化剂和防腐剂，得到酵母水。

步骤(1)中所述的酵母菌优选为鲁氏接合酵母或酿酒酵母。

所述的鲁氏接合酵母优选为鲁氏接合酵母CGMCC 2.1915。

所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母CGMCC 2.1。

步骤(1)中所述的活化的步骤优选为：将酵母菌涂布于YPD固体培养基上，于30℃培养48h活化。

步骤(1)中所述的逐级扩大培养的步骤优选为：将活化后的酵母菌接种到一级三角瓶中进行摇瓶培养，再扩接到二级三角瓶中进行摇瓶培养；培养后的酵母菌培养液依次移植到一级种子罐与二级种子罐中进行扩增发酵培养。

所述的摇瓶培养的条件优选为：30℃、200rpm培养24h。

所述的二级三角瓶培养后得到的种子液的菌体湿重>5％，优选为6～6.2％。

所述的一级种子罐的扩增发酵培养的条件优选为：30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速230～260r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h。

所述的二级种子罐的扩增发酵培养的条件优选为：30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速220～250r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h。

所述的二级种子罐培养后得到的种子液的菌体为湿重>5％，优选为5.8～6.3％；葡萄糖残糖含量为1.7～2.3％。

步骤(1)中所述的发酵培养基的组成为：在YPDA培养基中加入二氢硫辛酸或是二氢硫辛酸-谷胱甘肽混合物；其中，二氢硫辛酸的加入量按每升YPDA培养基中加入0.0013g二氢硫辛酸计，谷胱甘肽的加入量按每升YPDA培养基中加入0.003g谷胱甘肽计。

步骤(1)中所述的发酵的条件优选为：30℃发酵，通气量为0.7～0.8L/min·L，搅拌转速为160～180r/min，30℃时的pH值为5～5.5，发酵至残糖接近为0。

所述的发酵的时间优选为36～42h。

步骤(1)中所述的固液分离的方式优选为膜分离；更优选为通过陶瓷膜分离器分离。

步骤(2)中所述的吸附剂优选为白陶土或活性碳。

所述的白陶土的用量优选为按每升上清液中加入20g白陶土计。

所述的活性炭的用量优选为按每升上清液中加入5g活性炭计。

步骤(2)中所述的加热反应的条件优选为：于45～50℃反应40～60min。

步骤(3)中所述的固液分离的方式优选为离心。

步骤(3)中所述的干燥的条件优选为于45～50℃减压真空干燥。

步骤(3)中所述的粗粉优选为能过40目筛的粉。

步骤(3)中所述的低温超微粉碎机粉碎的时间优选为80～100min。

步骤(3)中所述的纯化水的用量按相当于粗粉10倍质量计。

步骤(3)中所述的超声抽提的条件优选为：于250～350Hz抽提40～60min。

步骤(4)中所述的有效浓度以上的含量具体如下：总氮含量为0.28～0.31％，氨基酸态氮含量为0.13～0.15％，还原型谷胱甘肽含量为0.2～0.22％。

所述的防腐剂和所述的抗氧化剂的用量符合相关的规定。

所述的防腐剂优选为山梨酸钾。

所述的抗氧化剂优选为维生素E。

一种酵母水，通过上述制备方法得到。

所述的酵母水可以制备化妆品的形式是水剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂、乳化体系和表面活性剂体系。

所述乳化体系和表面活性剂体系可以为洗面奶、沐浴露、化妆水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、眼霜、气雾或喷雾形式。这些形式可通过本领域技术人员熟知的方法制备。

所述的酵母水具有优良的抗衰老作用，可应用于制备抗衰、抗皱的美容护肤化妆品用品。

所述的酵母水具有独特的美白作用，可应用于制备美白、增白、淡斑的美容护肤化妆品用品。

本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：

1.本发明的包含破壁酵母抽提物的酵母水的制备，利用了发酵酵母水的上清液和酵母菌体的破壁抽提水二个部位，充分利用了发酵酵母液的资源，凸显了资源利用的效果。

2.本发明的包含破壁酵母抽提物的酵母水的制备，因酵母细胞壁坚硬，不易破碎，对酵母菌体的破壁，本发明对酵母菌体首次采用了低温超微粉碎破壁；通过破壁前冰晶化及在破壁过程中封闭避光、超低温控制，有效地保护了细胞中的生物活性成分，降低了其破壁后被氧化分解的保护剂；其酵母细胞的破壁率≥98％。

3.本发明对酵母菌体的破壁方法与谱通的自溶法比较，通过对生物活性成分还原型谷胱甘肽的含量测定显示，本发明法抽提物的还原型谷胱甘肽的含量为普通的自溶法的近百倍，充分说明了本发明破壁方法的有利效果。

4.本发明的包含破壁酵母抽提物的酵母水的制备方法中，充分考虑了化妆品对气味的特殊要求，在酵母菌的发酵生产工艺中装料时，通过添加二氢硫辛酸、和/或谷胱甘肽抗氧剂，减少了酵母水不良气味，其制备的酵母水符合化妆品对气味的特殊要求，获得了较好的效果。

5.本发明在制备过程中使用了白陶土、活性碳吸附致敏成分及热原，取得了良好效果，经300人试用，未发生过敏人员；未经过此方法的酵母水约有3％的人员有轻微过敏。

6.本发明的包含破壁酵母抽提物的酵母水具有卓越的美容美肤功效，尤其是在抗皮肤老化及在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性、抑制多巴的自身氧化和加深。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害，促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老。

7.采用本发明所提供的方法，工艺流程简单，操作方便，产品质量控制方便，有可操作性，是适合于工业生产的安全可靠的制备方法。

附图说明

图1是检测破壁率的视野区域选取分布图。

图2是酵母菌体细胞破壁前后的显微结构图；其中，图(A)为破壁前，图(B)为破壁后。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)取-40℃甘油管保藏的鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii，CGMCCAS 2.1915，中国普通微生物菌种保藏管理中心)100μl，涂布于9cm平板，所用的活化培养基为YPD固体培养基，30℃恒温培养箱内培养48h，至菌株活化完全。刮取平板活化培养基上的培养酵母菌制成菌悬液，接种到酵母菌一级三角瓶培养基(BMGY培养基)中，30℃、200rpm培养24h；取一级三角瓶培养的酵母菌培养液10％(v/v)，扩接到10份二级三角瓶培养基(BMGY培养基)中，30℃、200rpm培养24h，合瓶后种子液总体积1.08L，菌体湿重6％；取容积为20L的一级种子罐，装入14升发酵料(酵母完全培养基，YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入二级三角瓶培养基培养的菌种，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速260r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到一级种子罐菌种液。取10ml的一级种子罐菌种液进行检测，得到一级种子罐菌种液中菌体湿重为5.8％，葡萄糖残糖为1.9％。取容积为200L的二级种子罐，装入140升发酵料(YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入一级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速250r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到二级种子罐菌种液。二级种子罐菌种液中菌体湿重为5.9％，葡萄糖残糖为1.8％。取容积为2000L的发酵罐，装入1260L发酵料(YPDA培养基)，加热升温100℃煮沸5min，降温，待温度降到30℃后，加入1.68g二氢硫辛酸，移入二级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.7L/min·L，搅拌转速180r/min，30℃时pH5～5.5培养，在培养24h后开始测残糖，以后每6h测定一次，36h时葡萄糖残糖降到近0，结束发酵，得到发酵液。

(2)测得发酵液中菌体湿重(6000rpm离心10min后的固体物)为8.1％，上清液的干固物含量为2.3％。发酵结束后，发酵液输入陶瓷膜分离器进行酵母水上清液和酵母菌体分离，获得酵母水上清液约1300L，酵母菌体(湿重)约113.4kg备用；取酵母水上清液加入60目的活性碳粉6.5kg，搅拌，50℃保温40min，然后过滤，得到酵母水A。

(3)取酵母菌体，加入约1130L纯化水洗涤，然后离心(6000rpm离心10min)，离心上清液弃去，得到的离心滤饼于50℃减压真空干燥，用万能粉碎机粉碎成40目粗粉，得粗粉约35kg，再将粗粉置于低温超微粉碎机中，调整温度为-25℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，开启粉碎机械粉碎80min，粉碎过程中调整并保持冷冻温度-25～-5℃，破壁后，通过显微观察法测得破壁率为99％。取破壁后酵母细胞微粉，加入纯化水350L、250Hz超声复溶抽提40min，过滤，得酵母水B。

(4)将上述酵母水A与酵母水B混合，测定混合酵母水中总氮(凯氏定氮法)、氨基酸态氮(氨基酸检测仪)、还原型谷胱甘肽(通过HPLC检测)的含量，加纯化水调整至1800L，其中总氮含量为0.31％，氨基酸态氮含量为0.15％，还原型谷胱甘肽含量为0.22％；加入抗氧剂维生素E(终浓度为0.1％w/w)和防腐剂山梨酸钾(终浓度为0.4％w/w)，得到可用于制备化妆品的酵母水1，该酵母水无明显酒糟气味或不良特殊发酵气味。

实施例2

(1)取-40℃甘油管保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CGMCC 2.1，中国普通微生物菌种保藏管理中心)100μl，涂布于9cm平板，所使用的活化培养基为YPD固体培养基，30℃恒温培养箱内培养48h，至菌株活化完全；刮取平板活化培养基上的培养酵母菌制成菌悬液，接种到酵母菌一级三角瓶培养基(BMGY培养基)中，30℃、200rpm培养24h；取一级三角瓶培养的酵母菌培养液10％(v/v)，扩接到10份二级三角瓶培养基(BMGY培养基)中，30℃、200rpm培养24h，合瓶后种子液总体积0.53L，菌体湿重6.2％；取容积为10L的一级种子罐，装入7升发酵料(YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入二级三角瓶培养基培养的菌种，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速230r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到一级种子罐菌种液。取10ml的一级种子罐菌种液进行检测，得到一级种子罐菌种液中菌体湿重为6.1％，葡萄糖残糖为2.1％。取容积为100L的二级种子罐，装入70升发酵料(YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入一级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速220r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到二级种子罐菌种液。二级种子罐菌种液中菌体湿重为5.8％，葡萄糖残糖为2.3％。取容积为1000L的发酵罐，装入630L发酵料(YPDA培养基)，加热升温100℃煮沸5min，降温，待温度降到30℃后，加入0.84g二氢硫辛酸以及2g谷胱甘肽，移入二级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.8L/min·L，搅拌转速160r/min，30℃时pH5～5.5培养，在培养24h后开始测残糖，以后每6h测定一次，42h时葡萄糖残糖降到近0，结束发酵，得到发酵液。

(2)测得发酵液中菌体湿重(6000rpm离心10min后的固体物)为8.3％，上清液的干固物含量为2.5％。发酵结束后，发酵液输入陶瓷膜分离器进行酵母水上清液和酵母菌体分离，获得酵母水上清液约645L，酵母菌体(湿重)约58.1kg备用；取酵母水上清液加入60目的白陶土粉12.9kg，搅拌，45℃保温60min，然后过滤，得到酵母水A。

(3)取酵母菌体，加入约580L纯化水洗涤，然后离心，离心上清液弃去，得到的离心滤饼于50℃减压真空干燥，用万能粉碎机粉碎成40目粗粉，得粗粉约18kg，再将粗粉置于低温超微粉碎机中，调整温度为-25℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，开启粉碎机械粉碎90min，粉碎过程中调整并保持冷冻温度-25～-5℃，破壁后，测得破壁率为99％。取破壁后酵母细胞微粉，加入纯化水180L、350Hz超声复溶抽提50min，过滤，得酵母水B。

(4)将上述酵母水A与酵母水B混合，测定混合酵母水中总氮、氨基酸态氮、还原型谷胱甘肽的含量，加纯化水调整至900L，其中总氮含量为0.29％，氨基酸态氮含量为0.13％，还原型谷胱甘肽含量为0.20％；加入抗氧剂维生素E(终浓度为0.1％)、防腐剂山梨酸钾(终浓度为0.4％)，得到可用于制备化妆品的酵母水2，该酵母水无明显酒糟气味或不良特殊发酵气味。

实施例3

(1)取-40℃甘油管保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CGMCC 2.1，中国普通微生物菌种保藏管理中心)100μl，涂布于9cm平板，所使用的活化培养基为YPD固体培养基，30℃恒温培养箱内培养48h，至菌株活化完全；刮取平板活化培养基上的培养酵母菌制成菌悬液，接种到酵母菌一级三角瓶培养基(YPDA培养基)中，30℃、200rpm培养24h；取一级三角瓶培养的酵母菌培养液10％(v/v)，扩接到10份二级三角瓶培养基(YPDA培养基)中，30℃、200rpm培养24h，合瓶后种子液总体积0.75L，菌体湿重6.1％；取容积为15L的一级种子罐，装入10.5升发酵料(YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入二级三角瓶培养基培养的菌种，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速250r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到一级种子罐菌种液。取10ml一级种子罐菌种液进行检测，得到一级种子罐菌种液中菌体湿重为6.2％，葡萄糖残糖为1.8％。取容积为150L的二级种子罐，装入105升发酵料(YPDA培养基)，加热升温115℃灭菌15min，降温，待温度降到30℃后，移入一级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速230r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h，得到二级种子罐菌种液。二级种子罐菌种液中菌体湿重为6.3％，葡萄糖残糖为1.7％。取容积为1500L的发酵罐，装入945L发酵料(YPDA培养基)，加热升温100℃煮沸5min，降温，待温度降到30℃后，加入1.26g二氢硫辛酸以及3g谷胱甘肽，移入二级种子罐菌种液，30℃发酵，通气量0.7L/min·L，搅拌转速180r/min，30℃时pH5～5.5培养，在培养24h后开始测残糖，以后每6h测定一次，42h时葡萄糖残糖降到近0，结束发酵，得到发酵液。

(2)测得发酵液中菌体湿重(6000rpm离心10min后的固体物)为7.9％，上清液的干固物含量为2.3％。发酵结束后，发酵液输入陶瓷膜分离器进行酵母水上清液和酵母菌体分离，获得酵母水上清液约960L，酵母菌体(湿重)约86.8kg备用；取酵母水上清液加入60目的白陶土粉19.35kg，搅拌，48℃保温50min，然后过滤，得到酵母水A。

(3)取酵母菌体，加入约860L纯化水洗涤，然后离心，离心上清液弃去，得到的离心滤饼于45℃减压真空干燥，用万能粉碎机粉碎成40目粗粉，得粗粉约27kg，再将粗粉置于低温超微粉碎机中，调整温度为-20℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，开启粉碎机械粉碎100min，粉碎过程中调整并保持冷冻温度-25～-5℃，破壁后，测得破壁率为99.9％。取破壁后酵母细胞微粉，加入纯化水270L、350Hz超声复溶抽提60min，过滤，得酵母水B。

(4)将上述酵母水A与酵母水B混合，测定混合酵母水中总氮、氨基酸态氮、还原型谷胱甘肽的含量，加纯化水调整至1350L，其中总氮含量为0.28％，氨基酸态氮含量为0.14％，还原型谷胱甘肽含量为0.21％；加入抗氧剂维生素E(终浓度为0.1％)、防腐剂山梨酸钾(终浓度为0.4％)，得到可用于制备化妆品的酵母水3，该酵母水无明显酒糟气味或不良特殊发酵气味。

实施例4酵母菌体细胞破壁研究

1.实验目的

⑴考察酵母菌体细胞破壁的工艺参数；⑵考察不同破壁率的酵母菌体细胞中有效成分的含量；⑶确定酵母菌体细胞破壁的工艺方法。

2.材料与设备

按实施例1分别得到酵母菌体(广州市娇兰化妆品有限公司生产，批号：20150723、20150815、20151021)；安琪酵母批号：20151107、20151212(市场购买，商品名为面包高活性干酵母)；水合氯醛溶液(取水合氯醛50g，加水15ml和甘油10ml混溶即得)；谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成)；L1100生物显微镜(广州光学仪器厂)；ME104万分之一天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SBA-40D生物传感分析仪(山东省生物传感器重点实验室)；GB25-12DT超声波清洗器(新芝生物股份有限公司)；冷冻超微粉碎机(BFM-T6BI型，济南倍力粉技术工程有限公司)。

3.实验方法

3.1破壁方法

3.1.1：取酵母菌体细胞约250g，均分为6份，首先固定温度为-5～5℃，分别以30min、60min和90min的粉碎时间破壁(分别为1、2、3号)；固定粉碎时间为60min，分别以5～15℃和-15～-5℃的粉碎温度破壁(为4、5号)；将酵母菌体细胞先以温度-25℃冷冻冰晶化，固定温度为-25～-5℃以60min的粉碎时间破壁(6号)；观察不同方案(1～6号)下的破壁结果，并于显微镜下细致观察，测定破壁率。

3.1.2显微观察：

精密称取未破壁酵母菌体细胞(对照酵母菌体细胞)和1～6号已破壁酵母菌体细胞各约1mg，分别置于干燥洁净的乳钵中，精密加入1ml水合氯醛溶液，轻轻研磨至分散均匀，得酵母菌体细胞混悬液，立即装片或装片前再研磨。以微量进样器精密吸取5μl酵母菌体细胞混悬液直接装片，用18×18mm盖玻片覆盖，使混悬液分布均匀，无气泡，无外溢。每个试样同法制作两张样片。

使用同一显微镜，以相同的放大倍数(目镜×10，物镜×40)，按图1选取9个视野区域，记录完整酵母菌体细胞的个数。并计算不同破壁方案下酵母菌体细胞(1～6号)的破壁率。

破壁率的计算公式为：

3.2谷胱甘肽(GSH)检测方法

3.2.1测定原理：二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可进行比色定量测定。

3.2.1测定方法：

⑴配制GSH标准品系列溶液浓度(0-100μmol/L)，GSH的分子量为307；

⑵GSH标准品与二硫代二硝基苯甲酸反应(显色反应)；

⑶用分光光度计测定吸光度值(OD值)，波长420nm；

⑷以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，做标准曲线；

⑸将样品测得的吸光度值对应查曲线上的相对应的浓度，计算活性成分GSH的含量。

4.实验结果

4.1酵母菌体细胞破壁后的性状观察，如表1所示。

表1不同破壁方案所得酵母菌体细胞的性状

4.2破壁情况显微观察，如表2所示。

表2酵母菌体细胞破壁率(9个视野区域中完整酵母细胞数)

酵母菌体细胞破壁前后的显微结构见图2。

4.3含量测定

4.3.1不同破壁方案下破壁酵母菌体细胞中有效成分(GSH)的含量如表3所示：

表3不同方案破壁酵母菌体细胞中GSH的含量

4.3.2不同批次酵母菌体细胞以6号方案破壁后，所含的有效成分(GSH)含量如表4所示：

表4不同批次酵母菌体细胞GSH成分的含量

5.结论

5.1酵母菌体细胞中活性成分的含量随破壁时间的增加而增加。

5.2破壁时间应选择60min左右比较合适，即能达到满意的破壁率，又能显著减少结块与粘壁。

5.3破壁温度的降低有利于保留更多的可测成分。由同样破壁60min，但三个不同温度区域实验的含量测定结果说明在-15℃～-5℃破壁效果更好.

5.4从6号的破壁率与活性成分的含量来看，以破壁前先冷冻冰晶化的破壁效果为佳。

6.酵母菌体细胞破壁的工艺方法

综合上述实验结果，酵母菌体细胞破壁的工艺方法确定为：

6.1采用低温冷冻超微破壁法破壁，取酵母菌体细胞，置冷冻超微粉碎机中调整温度为-25～-15℃冷冻冰晶化，在超微粉碎机中，调整温度至-25℃冷冻，开启粉碎机粉碎，粉碎60～120min，并保持温度在-25～-5℃范围，即可。

6.2显微测定法测定破壁率，具体步骤同3.1.2。

实施例5酵母水对酪氨酸酶活性抑制实验

1.实验原理

在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸缓冲液中，可催化多巴转化成多巴醌(呈肾上腺素红色)，多巴醌最大吸收波长在475nm，通过测量475nm波长的吸光率，可以反映出生成多巴醌的浓度的大小。当酪氨酸酶与美白活性成分同时存在溶液中时，酪氨酸酶的催化活性会受到一定程度的抑制，从而减少多巴醌的生成。根据前后吸光度对比，可判定美白活性成分对酪氨酸酶活性的抑制程度，从而评估该种美白成分在体外的美白功效。

2.仪器与试药

THERMO MULTISKAN酶标仪(山东省科学院生物研究所)；DY6000Ⅱ恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；酵母水(实施例1～3制备的酵母水1～3；酵母水B为实施例1中酵母水B；批号20151107、20151212安琪酵母水(取实施例4中批号20151107、20151212安琪酵母粉分别置冷冻超微粉碎机中调整温度为-25～-15℃冷冻冰晶化，在超微粉碎机中，调整温度至-25℃冷冻，开启粉碎机粉碎，粉碎60min，并保持温度在-25～-5℃范围；破壁后得到安琪酵母细胞微粉各1Kg，各加入纯化水10L、350Hz超声复溶抽提60min，过滤，得批号20151107、20151212安琪酵母水)；多巴(L-DOPA，购自Sigma公司)；酪氨酸酶(购自Sigma公司)。

3.实验方法

3.1试剂配制：试剂1—PBS(磷酸盐标准缓冲溶液)，pH值6.86；试剂2——多巴溶液(用PBS配制，浓度为5mM)；试剂3—酪氨酸酶溶液(用PBS配制，浓度200U/ml，现配现用)；试剂4—样品溶液用PBS配制。

3.2实验方法与步聚

⑴将100μl样品加入96孔板中，每个样品浓度设置2个平行孔；

⑵按照下列表5准确一次加入相应试剂，混匀，恒温培养箱37℃孵育14min，475nm检测OD值。

表5酵母水对酪氨酸酶活性抑制实验试剂加入表

⑶计算对酪氨酸酶活性的抑制率：

酪氨酸酶抑制率(％)＝[1–(A₀–A₁)/(B₀–B₁)]×100％

式中：A₀—实验组OD值；A₁—实验空白对照组OD值；B₀—阴性组OD值；B₁—阴性空白对照组OD值；

4.实验结果

多批酵母水对酪氨酸酶的抑制作用实验结果见表6。

表6不同批次酵母水对酪氨酸酶的抑制作用结果

结论：实验证明，本发明制备的酵母水具有显著的美白、增白的功效。本发明提供的酵母水产量大幅提高，从而大幅降低工业生产酵母水成本。

实施例6酵母水对人体皮肤成纤维细胞增殖作用实验

1.实验原理

人体皮肤成纤维细胞(HSF)是重要的修复细胞之一，在创伤愈合过程中，多种生长因子：如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，均可调节成纤维细胞的增殖，被认为是调节各种类型细胞有序迁移入创面及细胞激活的重要因素。VEGF可激活成纤维细胞浸润,完成创面愈合重建；而IGF-Ⅰ是强效成纤维细胞有丝分裂源，能减少胶原酶mRNA的表达，增加Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，从而促进成纤维细胞增殖。酵母水通过影响HSF生长悬液中的VEGF、IGF-Ⅰ生成，从而影响HSF的增殖。本实验通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定HSF生长悬液中VEGF、IGF-Ⅰ的生成浓度检测酵母水的增殖活性。取7组细胞，严格按照说明书(VEGF-ELISA试剂盒、IGF-Ⅰ-ELISA试剂盒)操作，终止反应后，应用THERMO MULTISKAN酶标仪在492nm处测定吸光度(OD)值，VEGF、IGF-Ⅰ浓度分别与OD值成正比，可通过标准曲线分别求出标本中VEGF、IGF-Ⅰ浓度。

2.仪器与试药

THERMO MULTISKAN酶标仪(山东省科学院生物研究所)；DY6000Ⅱ恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；酵母水(实施例1～3制备的酵母水1～3；酵母水B为实施例1中酵母水B；批号20151107、20151212安琪酵母水(取实施例4中批号20151107、20151212安琪酵母粉分别置冷冻超微粉碎机中调整温度为-25～-15℃冷冻冰晶化，在超微粉碎机中，调整温度至-25℃冷冻，开启粉碎机粉碎，粉碎60min，并保持温度在-25～-5℃范围；破壁后得到安琪酵母细胞微粉各1Kg，各加入纯化水10L、350Hz超声复溶抽提60min，过滤，得批号20151107、20151212安琪酵母水))；HSF(上海肯强贸易有限公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)，VEGF-ELISA试剂盒、IGF-Ⅰ-ELISA试剂盒(为武汉博士德生物工程有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，二氨基联苯胺(DMEM，美国Gibco公司)，完全培养基(DMEM培养基中含15％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)，胰蛋白酶(Sigma公司)，TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)。

3.实验方法

酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定HSF生长悬液中VEGF、IGF-Ⅰ的生成浓度：取7组细胞，严格按照说明书操作，终止反应后，应用THERMOMULTISKAN酶标仪在492nm处测定吸光度(OD)值，VEGF、IGF-Ⅰ浓度分别与吸光度(OD)值值成正比,通过标准曲线分别求出标本中VEGF、IGF-Ⅰ浓度。

4.实验结果

多批酵母水对HSF生长悬液中VEGF、IGF-Ⅰ作用实验结果见表7。

表7不同批次酵母水各组细胞培养液中VEGF、IGF-Ⅰ含量测定结果(n＝8)

^＊P＜0.05对纯化水组

5结论：细胞培养液中VEGF、IGF-Ⅰ含量测定结果：实施例1～3与酵母水B对比时HSF的VEGF、IGF-Ⅰ含量随着酵母水中GSH浓度的增加而升高；与不含GSH的纯化水比较差异有统计学意义(P＜0.05)；实验结果证明，本发明制备的娇兰酵母水具有具有优良的调节人体皮肤成纤维细胞的增殖作用，可应用于抗衰、抗皱的美容护肤化妆品用品中。

实施例7：酵母水化妆品制备实例

(1)酵母精华水的制备，组方如表8所示。

表8

制备工艺：取实施例1制备的酵母水1，加热至50℃，加入甘油、1,3-丁二醇、苯氧乙醇、香兰素，分散均匀，搅拌直至清澈，冷却到35℃即得。所得酵母精华水气味芳香，质地清澈外观微黄，涂抹后感觉润滑无粘腻感。

⑵面霜的制备，组方如表9所示。

表9

制备工艺：取鲸蜡硬脂基葡糖苷、十六-十八醇、辛酸/癸酸三甘油酯、霍霍巴油、棕榈酸异丙酯、甘油混合加热至80℃，作为A相，保温备用；取实施例1制备的酵母水1，加入汉生胶、卡波940、透明质酸钠、去离子水，混合加热至80℃，分散均匀，作为B相，保温备用；将A相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的B相中，加入环二甲基硅油345均质3分钟，加入氢氧化钠调节pH6-7，搅拌冷却到50℃，加入香精，搅拌、冷却到35℃即得。所得酵母面霜无酵母发酵气味，涂抹后感觉润滑，吸收好。

⑶乳液的制备，组方如表10所示。

表10

制备工艺：取环戊硅氧烷995、凡士林、吐温-80、维生素E醋酸酯、甘油混合加热至80℃，作为A相，保温备用；取美实施例1制备的酵母水1，加入汉生胶、Carbopol Ultrez 10、1,3-丁二醇、去离子水，混合加热至80℃，分散均匀，作为B相，保温备用；将A相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的B相中，均质3分钟，加入三乙醇胺调节pH6-7，搅拌冷却到50℃，加入香精，搅拌、冷却到35℃即得。所得酵母乳液无酵母发酵气味，涂抹后感觉润滑舒适。

⑷眼霜的制备，组方如表11所示。

表11

制备工艺：取实施例1制备的酵母水，加热至50℃，加入1,3-丁二醇、绿茶提取物、乙二胺四乙酸二钠、去离子水，分散均匀，搅拌直至清澈；在搅拌下缓慢加入自乳化硅弹性体凝胶，作为A相，备用；取DC 245、霍霍巴油、维生素E醋酸酯、维生素A棕桐酸酯混合加热至80℃，作为B相，保温备用；将A相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的B相中，均质3分钟，冷却到35℃即得。所得酵母眼霜涂抹后肤感滋润清凉，无眼部刺激感。

⑸啫喱的制备，组方如表12所示。

表12

制备工艺：取实施例1制备的酵母水1，加热至80℃，加入聚丙烯酸、甘油、1,3-丁二醇、岩藻糖、透明质酸钠，搅拌分散均匀，作为A相，备用；取去离子水加入A相、分散均匀，加入三乙醇胺调节pH6-7，搅拌，冷却到50℃加入香精、甲基异噻唑琳酮，搅拌、冷却到35℃即得。所得酵母啫喱涂抹后感觉湿润，无酵母特有气味。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酵母水的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将酵母菌进行活化，然后逐级扩大培养，得到种子液；将种子液接入发酵培养基进行发酵；再将得到的发酵液进行固液分离，得到上清液和菌体；

(2)将步骤(1)得到的上清液和吸附剂混合，加热反应，过滤，得到酵母水A；

(3)用水将步骤(1)得到的菌体洗涤，然后进行固液分离，将得到的固体干燥，粉碎，得到粗粉；再将粗粉置于低温超微粉碎机中，调整温度为-25～-20℃，待酵母细胞冷冻冰晶化后，开启低温超微粉碎机粉碎至少60min，粉碎过程中调整并保持冷冻温度-25～-5℃，得到酵母细胞微粉；将酵母细胞微粉和纯化水混合，超声抽提，过滤，得到酵母水B；

(4)将酵母水A和酵母水B合并，测定混合酵母水中总氮、氨基酸态氮和还原型谷胱甘肽的含量，加纯化水调整至有效浓度以上的含量，加入抗氧化剂和防腐剂，得到酵母水。

2.根据权利要求1所述酵母水的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的酵母菌为鲁氏接合酵母或酿酒酵母；

步骤(1)中所述的发酵培养基的组成为：在YPDA培养基中加入二氢硫辛酸或是二氢硫辛酸-谷胱甘肽混合物；其中，二氢硫辛酸的加入量按每升YPDA培养基中加入0.0013g二氢硫辛酸计，谷胱甘肽的加入量按每升YPDA培养基中加入0.003g谷胱甘肽计；

步骤(1)中所述的发酵的条件为：30℃发酵，通气量为0.7～0.8L/min·L，搅拌转速为160～180r/min，30℃时的pH值为5～5.5，发酵至残糖接近为0；

步骤(2)中所述的吸附剂为白陶土或活性碳；

步骤(2)中所述的加热反应的条件为：于45～50℃反应40～60min；

步骤(3)中所述的超声抽提的条件为：于250～350Hz抽提40～60min；

步骤(4)中所述的有效浓度以上的含量具体如下：总氮含量为0.28～0.31％，氨基酸态氮含量为0.13～0.15％，还原型谷胱甘肽含量为0.2～0.22％；

所述的防腐剂为山梨酸钾；

所述的抗氧化剂为维生素E。

3.根据权利要求2所述酵母水的制备方法，其特征在于：

所述的发酵的时间为36～42h；

所述的白陶土的用量为按每升上清液中加入20g白陶土计；

所述的活性炭的用量为按每升上清液中加入5g活性炭计。

4.根据权利要求1所述酵母水的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的活化的步骤为：将酵母菌涂布于YPD固体培养基上，于30℃培养48h活化；

步骤(1)中所述的逐级扩大培养的步骤为：将活化后的酵母菌接种到一级三角瓶中进行摇瓶培养，再扩接到二级三角瓶中进行摇瓶培养；培养后的酵母菌培养液依次移植到一级种子罐与二级种子罐中进行扩增发酵培养。

5.根据权利要求4所述酵母水的制备方法，其特征在于：

所述的摇瓶培养的条件为：30℃、200rpm培养24h；

所述的二级三角瓶培养后得到的种子液的菌体湿重>5％；

所述的一级种子罐的扩增发酵培养的条件为：30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速230～260r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h；

所述的二级种子罐的扩增发酵培养的条件为：30℃发酵，通气量0.6L/min·L，搅拌转速220～250r/min，30℃时pH5～5.5，培养24h；

所述的二级种子罐培养后得到的种子液的菌体湿重>5％，葡萄糖残糖含量为1.7～2.3％。

6.根据权利要求5所述酵母水的制备方法，其特征在于：

所述的二级三角瓶培养后得到的种子液的菌体湿重为6～6.2％；

所述的二级种子罐培养后得到的种子液的菌体湿重为5.8～6.3％。

7.根据权利要求1所述酵母水的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的固液分离的方式为膜分离；

步骤(3)中所述的固液分离的方式为离心；

步骤(3)中所述的干燥的条件为于45～50℃减压真空干燥；

步骤(3)中所述的粗粉为能过40目筛的粉；

步骤(3)中所述的低温超微粉碎机粉碎的时间为80～100min；

步骤(3)中所述的纯化水的用量按相当于粗粉10倍质量计。

8.一种酵母水，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。

9.权利要求8所述的酵母水在制备化妆品中的应用。

10.根据权利要求9所述的酵母水在制备化妆品中的应用，其特征在于：

所述的酵母水制备化妆品的形式是水剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂、乳化体系和表面活性剂体系；

所述化妆品为具有如下功效一种以上的化妆品：抗衰、抗皱、美白、增白、淡斑。