CN103141298A

CN103141298A - 一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法

Info

Publication number: CN103141298A
Application number: CN2013100456289A
Authority: CN
Inventors: 程俊文; 付立忠; 贺亮; 魏海龙; 胡传久; 李海波
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-05
Also published as: CN103141298B

Abstract

本发明提供了一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法。该方法根据仿生学原理，模拟人体胃肠道酸碱环境，在近人体温度下，加以搅拌装置，模拟胃肠道蠕动方式，从而尽可能多地提取原药中的有效组分，使其更接近药物在体内达到平衡后的有效成分群。该方法反应温和，不仅大大节约了能量，而且避免了有机溶剂对环境的污染以及易燃、易爆和对生产环境的特殊要求，易于工业上生产。

Description

一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法

（一）技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法。

（二）背景技术

冬虫夏草菌是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属幼虫被中国被毛孢（Hirsutellasinensis）寄生后形成的虫菌复合体，是我国青藏高原的特色资源，属国家二级保护的名贵药材。

由于天然冬虫夏草具有严格的寄生性和特殊的地理生长环境，因而产量有限，加上近年采挖过度，使也是冬虫夏草资源锐减，根本无法满足保健和用药的需求。所以采用现代生物发酵技术深层发酵培养冬虫夏草菌丝体是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径和实现有用代谢产物开发利用的基础。冬虫夏草无性型发酵的菌丝体有与天然冬虫夏草具有相同或相似的化学成分和药理作用，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血压等功效。

冬虫夏草发酵菌丝体组成复杂，含有虫草素、虫草腺苷、D-甘露醇、虫草多糖等多种生物活性成分，生物利用价值高。目前报道的提取冬虫夏草菌丝体中活性成分的方法诸如热水浸提法、水提醇沉法、醇提法等，存在着提取方法和过程单一、提取温度高、有效成分活性破坏大、无法充分提取利用好冬虫夏草菌丝体中的有效成分。

申请号为201210000824.X的中国发明专利申请中公开了一种蛹虫草腺苷的提取方法，该工艺以蛹虫草子实体经低温超微粉碎后先进行反复冻融3~7次，再模拟人体胃肠道酸碱环境，应用半仿生提取工艺对蛹虫草中的腺苷进行3次连续微波加热提取，最后用高效液相色谱仪测定提取液中腺苷的含量。该半仿生提取法存在仅以其中的虫草腺苷含量为指标，同时仍然采用了微波加热提取方式，存在易破坏虫草中的活性成分的缺点。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的气升发酵培养及仿生提取方法。

本发明采用的技术方案是：

一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法，所述方法包括：

（1）种子液制备：液体种子培养基经灭菌后接入中国被毛孢菌株，50~300rpm、10~30℃下振荡培养2~35天，得到种子液；所述液体种子培养基组成如下：碳源0.5～4%，氮源0.1～2%，KH₂PO₄0.01~0.5%，MgSO₄0.01~0.5％，溶剂为水，pH6.0~7.0；所述碳源为下列之一或其中两种以上的混合物：葡萄糖、蔗糖、玉米粉、玉米淀粉；所述氮源为下列之一或其中两种以上的混合物：蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉、麦麸、豆饼粉；上述培养基中浓度为质量体积百分比（w/v），某组分浓度1%表示100mL培养基中含有该组分1g；

（2）发酵培养：液体发酵培养基以2～25%体积比接种量接入种子液，在气升式发酵罐中进行发酵，罐压0.02~0.07Mpa，发酵罐通气量为1:0.2V/V.min~1:3V/V.min（即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比），培养温度15～25℃，培养时间3~40天；所述液体发酵培养基组成同液体种子培养基；当发酵菌球经显微镜镜检发现大量菌丝，残糖降至1.0%以下，视为发酵终点，放罐；

（3）菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于5~30℃下进行低温粉碎2~20min，得到菌丝体超微粉；

（4）发酵菌丝体仿生提取：菌丝体超微粉加入至10~50倍质量的水中，加入足量酶1，调pH值为1.0~3.0，35~37℃、40~300rpm下搅拌提取20min~150min，离心，得上清液1，取沉淀加入至10~50倍质量的水，加入足量酶2，调pH值为8.0~10.0，35~37℃、50~250rpm下搅拌提取10min~120min，离心，得上清液2；合并上清液1和上清液2，调pH值为中性，即得冬虫夏草发酵菌丝体活性组分；经检测，该组分中含有虫草素、虫草腺苷、甘露醇、多糖、SOD等活性成分；

所述酶1为下酶中的一种或多种：①胃蛋白酶、②木瓜蛋白酶、③α-淀粉酶、④凝乳酶；

所述酶2为下列中的一种或多种：①肠肽酶、②胰蛋白酶、③凝乳酶、④碱性蛋白酶。

所用酶均采用市购商品酶，通常的，胃蛋白酶酶活为10000U/g~200000U/g，凝乳酶酶活为3000U/g~30000U/g，胰蛋白酶酶活为20000U/g~1000000U/g，木瓜蛋白酶酶活为50000U/g~800000U/g，碱性蛋白酶酶活为20000U/g~400000U/g，肠肽酶500U/g~2000U/g，α-淀粉酶酶活为50000U/g~1000000U/g。

优选的，所述酶1为胃蛋白酶，或者为胃蛋白酶与木瓜蛋白酶、α-淀粉酶或凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量为2000~10000U/g菌丝体超微粉，木瓜蛋白酶用量为1000~5000U/g菌丝体超微粉，α-淀粉酶用量为1000~3000U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为50~200U/g菌丝体超微粉。

优选的，所述酶2为肠肽酶与胰蛋白酶、凝乳酶、碱性蛋白酶中一种或多种的混合物；肠肽酶用量为1~20U/g菌丝体超微粉，胰蛋白酶用量为100~500U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为200~500U/g菌丝体超微粉，碱性蛋白酶用量为300~800U/g菌丝体超微粉。

更为优选的，所述酶1为胃蛋白酶与凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量为5000~6000U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为80~100U/g菌丝体超微粉；所述酶2为肠肽酶与胰蛋白酶的混合物，肠肽酶用量为5~10U/g菌丝体超微粉，胰蛋白酶用量为300~500U/g菌丝体超微粉。

本发明方法是根据仿生学原理，模拟人体胃肠道酸碱环境，在近人体温度下，加以搅拌装置，模拟胃肠道蠕动方式，从而尽可能多地提取原药中的有效组分，使其更接近药物在体内达到平衡后的有效成分群。该工艺打破了以往只提取单一有效成分的西医西药模式，体现了中医药多种成分复合作用的特点，避免了传统的水煎工艺和水煎醇沉提取工艺仅适合提取单一成分，易造成活性组分破坏和损失的弊端。同时又克服了半仿生提取法的高温煎煮易破坏有效成分的缺点。由于反应温和，不仅大大节约了能量，而且避免了有机溶剂对环境的污染以及易燃、易爆和对生产环境的特殊要求，易于工业上生产。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明采用气升式发酵罐液体培养中国被毛孢菌株，具有气液混合均匀﹑对菌丝体剪切力小等优点，避免了通用型搅拌桨式发酵罐由于其强烈的机械搅拌产生剪切作用力，对中国被毛孢菌丝生长及其次生代谢产物的影响。

2、本发明对冬虫夏草菌丝体采用低温超微粉碎，在保护菌丝体中活性组分的同时，使其有效组分更易在提取中溶出和释放。

3、本发明采用仿生提取方法，在近人体温度下，模拟人体胃肠道酸碱环境和胃肠道蠕动方式，使所得提取物更接近药材在体内达到平衡后的有效成分群。避免了传统的水煎工艺和有机溶剂提取工艺易造成活性成分破坏及对环境的污染。与常规提取工艺相比，采用仿生提取，冬虫夏草菌丝体中有效成分的提取得率和活性得以提高。

4、本发明方法还适用其他药用真菌发酵菌丝体及相关中药材中活性组分的提取。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明使用的菌株：是从天然冬虫夏草子座分离出的中国被毛孢菌株（Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu&Zeng），且已用分子生物学方法确认为冬虫夏草的无性型，由中国科学院微生物研究所提供。

斜面菌种的制备与处理：斜面菌种培养基采用加富PDA培养基，接种后于10~30℃下培养10~60天。

实施例1：

1、一级液体种子的制备：培养基为：1%葡萄糖、1%蔗糖、1.0%蛋白胨、0.2%酵母粉、0.05%KH₂PO₄、0.05%MgSO₄，pH值6.0。接入中国被毛孢斜面菌种，置于摇床上120rpm，17℃下振荡培养25天。

2、气升式发酵罐培养：液体发酵培养基接种10%的液体种子液于气升式发酵罐中，罐压0.05Mpa，发酵罐通气量为1:0.5V/V.min；培养温度17℃，培养至发酵终点，放罐。

3、菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于5℃下进行低温粉碎10min，得到菌丝体超微粉；

4、发酵菌丝体仿生提取：

模拟人工胃液，取10.0g发酵菌丝体超微粉，加入300ml蒸馏水混合，再加入0.05g胃蛋白酶（酶活1000000U/g，sigma公司）、0.08g凝乳酶（酶活10000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），用1mol/L的HCl将体系pH值调为1.5，在37℃下按100rpmrpm搅拌提取60min后，6000rpm离心20min，得上清液1。

模拟人工肠液，向上述提取离心后的残渣中加入300ml蒸馏水，再加入0.03g胰蛋白酶（酶活100000U/g，sigma公司）、0.06g肠肽酶（酶活800U/g，sigma公司），用5%（w/w）NaOH将pH值调为8.0，在37℃下按120rpm搅拌提取45min后，6000rpm离心20min后，得上清液2。

合并上清液1和2，用5%NaOH或1mol/L的HCl调至中性，即得中国被毛孢发酵菌丝体活性组分，经检测，该组分中含有虫草素20.5mg、虫草腺苷0.4mg、甘露醇721.5mg、虫草多糖831.6mg。

目前虫草中的活性组分虫草多糖采用热水浸提法、甘露醇一般采用热水回流提取法（陈京津等，2009）、虫草素和虫草腺苷一般采用醇热回流法或热水回流法（牛双等，2009；韩建华等，2011），易造成活性组分破坏和损失。与上述常规提取方法相比，采用本发明仿生提取，冬虫夏草菌丝体中有效成分的提取得率和活性得以提高。（见表1）

表1：仿生提取与常规提取法的各有效成分效果

有效成分	常规提取法	本发明仿生提取法
			虫草素	1.24mg/g	2.05mg/g
虫草腺苷	0.024mg/g	0.04mg/g
			D-甘露醇	72.53mg/g	72.15mg/g
虫草多糖	62.14mg/g	83.16mg/g

实施例2：

1、一级液体种子的制备：培养基为：3％葡萄糖、0.5%玉米淀粉、0.6%的蛋白胨、0.5%麦麸、0.15%KH₂PO₄、0.02%MgSO₄，pH值7.0。接入中国被毛孢斜面菌种，置于摇床上90rpm，17℃下振荡培养20天。

2、气升式发酵罐培养：接种15％的液体种子液于气升式发酵罐中，罐压0.03Mpa，发酵罐通气量为1:0.4V/V.min；培养温度18℃，培养至发酵终点，放罐。

3、菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于15℃下进行低温粉碎4min，得到菌丝体超微粉；

4、发酵菌丝体仿生提取：

模拟人工胃液，取10.0g发酵菌丝体超微粉，加入350ml蒸馏水混合，再加入0.02g胃蛋白酶（酶活1000000U/g，sigma公司）、0.06g凝乳酶（酶活10000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），用1mol/L的HCl将pH值调为2.0，在37℃下按120rpm搅拌提取40min后，6000rpm离心20min，得上清液1。

模拟人工肠液，向上述提取离心后的残渣中加入350ml蒸馏水，再加入0.08g肠肽酶（酶活800U/g，sigma公司)、0.3g凝乳酶(酶活为10000U/g，南宁庞博生物工程有限公司)，，用5%NaOH将pH值调为8.5，在37℃下按160rpm搅拌提取60min后，6000rpm离心20min后，得上清液2。

合并上清液1和2，用5%NaOH或1mol/L的HCl调至中性，即得中国被毛孢发酵菌丝体活性组分，经检测，该组分中含有虫草素12mg、虫草腺苷0.3mg、甘露醇680mg、虫草多糖740mg。

实施例3：

1、一级液体种子的制备：培养基为：0.5％葡萄糖、1.5%玉米粉、0.6%的酵母粉、0.4%蚕蛹粉，0.08%KH₂PO₄、0.03%MgSO₄，pH值6.5。接入中国被毛孢斜面菌种，置于摇床上100rpm，16℃下振荡培养30天。

2、气升式发酵罐培养：接种10％的液体种子液于气升式发酵罐中，罐压0.04Mpa，发酵罐通气量为1∶1V/V.min；培养温度16℃，培养至发酵终点，放罐。

3、菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于8℃下进行低温粉碎15min，得到菌丝体超微粉；

4、发酵菌丝体仿生提取：

模拟人工胃液，取10.0g发酵菌丝体超微粉，加入400ml蒸馏水混合，再加入0.05g胃蛋白酶（酶活1000000U/g，sigma公司）、0.2g木瓜蛋白酶（酶活为100000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），用1mol/L的HCl将pH值调为2.5，在37℃下按150rpm搅拌提取40min后，6000rpm离心20min，得上清液1。

模拟人工肠液，向上述提取离心后的残渣中加入400ml蒸馏水，再加入0.05g肠肽酶（酶活800U/g，sigma公司)、0.1g碱性蛋白酶（酶活为60000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），用5%NaOH将pH值调为9.0，在37℃下按150rpm搅拌提取50min后，6000rpm离心20min后，得上清液2。

合并上清液1和2，用5%NaOH或1mol/L的HCl调至中性，即得中国被毛孢发酵菌丝体活性组分，经检测，该组分中含有虫草素14mg、虫草腺苷0.6mg、甘露醇580mg、虫草多糖790mg。

实施例4：

1、一级液体种子的制备：培养基为：1.5％葡萄糖、1.0%玉米粉、0.6%的酵母粉、0.4%麦麸，0.07%KH₂PO₄、0.02%MgSO₄，pH值6.0。接入中国被毛孢斜面菌种，置于摇床上80rpm，17℃下振荡培养18天。

2、气升式发酵罐培养：接种12％的液体种子液于气升式发酵罐中，罐压0.03Mpa，发酵罐通气量为1:0.6V/V.min；培养温度19℃，培养至发酵终点，放罐。

3、菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于15℃下进行低温粉碎5min，得到菌丝体超微粉；

4、发酵菌丝体仿生提取：

模拟人工胃液，取10.0g发酵菌丝体超微粉，加入250ml蒸馏水混合，再加入0.1g胃蛋白酶(酶活1000000U/g，sigma公司)，用1mol/L的HCl将pH值调为2.3，在37℃下按180rpm搅拌提取40min后，6000rpm离心20min，得上清液1。

模拟人工肠液，向上述提取离心后的残渣中加入250ml蒸馏水，再加入0.08g肠肽酶（酶活800U/g，sigma公司)、0.05g碱性蛋白酶（酶活为60000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），0.01g胰蛋白酶（酶活100000U/g，sigma公司)、用5%NaOH将pH值调为9.2，在37℃下按180rpm搅拌提取40min后，6000rpm离心20min后，得上清液2。

合并上清液1和2，用5%NaOH或1mol/L的HCl调至中性，即得中国被毛孢发酵菌丝体活性组分，经检测，该组分中含有虫草素19mg、虫草腺苷0.8mg、甘露醇520mg、虫草多糖730mg。

实施例5：

1、一级液体种子的制备：培养基为：1.0％蔗糖、0.5%玉米粉、0.7%的蛋白胨、0.5%豆饼粉，0.12%KH₂PO₄、0.05%MgSO₄，pH值6.5。接入中国被毛孢斜面菌种，置于摇床上100rpm，17℃下振荡培养15天。

2、气升式发酵罐培养：接种15％的液体种子液于气升式发酵罐中，罐压0.06Mpa，发酵罐通气量为1:0.3V/V.min）；培养温度17℃，培养至发酵终点，放罐。

3、菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于10℃下进行低温粉碎8min，得到菌丝体超微粉；

4、发酵菌丝体仿生提取：

模拟人工胃液，取10.0g发酵菌丝体超微粉，加入200ml蒸馏水混合，再加入0.05g胃蛋白酶(酶活1000000U/g，sigma公司)、0.3gα-淀粉酶（酶活60000U/g，sigma公司），用1mol/L的HCl将pH值调为2.8，在37℃下按200rpm搅拌提取50min后，6000rpm离心20min，得上清液1。

模拟人工肠液，向上述提取离心后的残渣中加入200ml蒸馏水，再加入0.1g肠肽酶（酶活800U/g，sigma公司)、0.1g碱性蛋白酶（酶活为60000U/g，南宁庞博生物工程有限公司），用5%NaOH将pH值调为9.5，在37℃下按200rpm搅拌提取50min后，6000rpm离心20min后，得上清液2。

合并上清液1和2，用5%NaOH或1mol/L的HCl调至中性，即得中国被毛孢发酵菌丝体活性组分，经检测，该组分中含有虫草素13mg、虫草腺苷0.7mg、甘露醇500mg、虫草多糖700mg。

Claims

1.一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法，所述方法包括：

（1）种子液制备：液体种子培养基经灭菌后接入中国被毛孢菌株，50~300rpm、10~30℃下振荡培养2~35天，得到种子液；所述液体种子培养基组成如下：碳源0.5～4%，氮源0.1～2%，KH₂PO₄0.01~0.5%，MgSO₄0.01~0.5％，溶剂为水，pH6.0~7.0；所述碳源为下列之一或其中两种以上的混合物：葡萄糖、蔗糖、玉米粉；所述氮源为下列之一或其中两种以上的混合物：蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉、麦麸、豆饼粉；

（2）发酵培养：液体发酵培养基以2～25%体积比接种量接入种子液，在气升式发酵罐中进行发酵，罐压0.02~0.07Mpa，发酵罐通气量为1:0.2V/V.min~1:3V/V.min，培养温度15～25℃，培养时间3~30天；所述液体发酵培养基组成同液体种子培养基；

（4）发酵菌丝体仿生提取：菌丝体超微粉加入至10~50倍质量的水中，加入足量酶1，调pH值为1.0~3.0，35~37℃、40~300rpmrpm下搅拌提取20min~150min，离心，得上清液1，取沉淀加入至10~50倍质量的水，加入足量酶2，调pH值为8.0~10.0，35~37℃、50~250rpmrpm下搅拌提取10min~120min，离心，得上清液2；合并上清液1和上清液2，调pH值为中性，即得冬虫夏草发酵菌丝体活性组分；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶1为胃蛋白酶，或者为胃蛋白酶与木瓜蛋白酶、α-淀粉酶或凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量为2000~10000U/g菌丝体超微粉，木瓜蛋白酶用量为1000~5000U/g菌丝体超微粉，α-淀粉酶用量为1000~3000U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为50~200U/g菌丝体超微粉。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶2为肠肽酶与胰蛋白酶、凝乳酶、碱性蛋白酶中一种或多种的混合物；肠肽酶用量为1~20U/g菌丝体超微粉，胰蛋白酶用量为100~500U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为200~500U/g菌丝体超微粉，碱性蛋白酶用量为300~800U/g菌丝体超微粉。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶1为胃蛋白酶与凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量为5000~6000U/g菌丝体超微粉，凝乳酶用量为80~100U/g菌丝体超微粉；所述酶2为肠肽酶与胰蛋白酶的混合物，肠肽酶用量为5~10U/g菌丝体超微粉，胰蛋白酶用量为300~500U/g菌丝体超微粉。