CN104855141B - 一种基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法，包括：将所保藏母种斜面活化，活化菌种转至平板培养，长出菌落后用打孔器于菌落近边缘打孔，挑取琼脂块菌种至液体培养基培养，然后利用超声波细胞破碎仪对培养后的菌种进行破碎，得到含大量菌丝片段的均质化液体菌种，作为液体深层发酵或作为制备原种、栽培种或代料栽培的菌种。均质化液体菌种也可继续扩大培养后再次超声破碎获得更大量液体菌种。本发明所公布的液体菌种制作方法具有制作简便、快速、高效、不易染菌等特点，所制备的菌种具有生长点多、菌种用量少、生长速度快以及便于自动化接种的实现等优点，具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食用菌培养技术领域，具体涉及一种基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法。
背景技术
食用菌是一类富有营养与药用价值的大型真菌，它主要利用农业、林业以及工业生产中所产生的下脚料如稻草、玉米芯、棉子壳、木屑等可再生废弃物作为原料进行生产，转废为宝，生产的各种菇类可供人类食用和药用。由于这些原材料均属可再生资源，因此食用菌产业具有可持续发展的特点，与此同时这些废弃物的利用还可减少其对环境的破坏作用，可以说食用菌是地球生态循环的关键组成部分。目前，食用菌生产在我国正快速发展，已成为我国农业生产的重要组成部分，我国也因此成为世界最重要的食用菌生产国。
目前食用菌生产主要采用代料栽培模式，通常采用代料基质培养的固体菌种作为接种物，但固体菌种具有生产周期长、菌龄不一致、接种劳动强度大以及不利于机械化接种等缺点。与固体菌种相比，液体菌种具有生产周期短、生产自动化水平高、菌龄均一、萌发吃料快等优点，因此，食用菌液体菌种用于食用菌栽培的前景十分看好，是今后发展的必然趋势，近年来液体菌种开始应用于少数菇类的生产正是这一趋势的体现，取得了显著的效益。此外，食用菌液体深层发酵开始应用于多糖、酶等活性产物生产，有可能成为食用菌生产新方法，其过程也离不开液体菌种的制备。
食用菌液体菌种制备通常先将菌种活化，再转至平板培养，待菌落长好后用打孔器于培养菌落近边缘打孔，挑取琼脂块进行液体培养，作为液体菌种，或以此作为菌种培养二级种，以扩大菌种量，视菌种需要量可进一步摇瓶或发酵罐扩大培养。由于食用菌液体培养时主要以菌丝球形式生长，直接将液体菌种作为接种种子时生长点极少，致使生长速度慢或需要加大接种量，此外，原始液体菌种接种时难于准确控制接种量，以及由于菌丝球过大不利于机械化接种的实现。为提高液体菌种生长点、便于接种以及准确控制接种量，少数人采用研磨或机械均质法将原始液体菌种均质处理后再用于接种，但这两种方法均易导致菌种污染，且均质程度不够高，因此，开发更有效的食用菌液体菌种均质方法具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用超声波破碎技术获得食用菌液体菌种的方法，以提高液体菌种的使用效率和便于自动化接种。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：
本发明一种基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法，包括以下步骤：
（1）活化保藏菌种；
（2）活化菌种转至马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基（PDA）培养；
（3）待长出菌落后用打孔器于菌落近边缘打孔；
（4）挑取打孔后琼脂块菌种至装有液体培养基的摇瓶培养；
（5）培养后利用超声波细胞破碎仪破碎，得到含大量菌丝片段的均质化液体菌种，数量级扩增接种物的生长点，作为液体深层发酵或制作原种和栽培种的接种物以及代料栽培的接种物。
其中，所述步骤（5）的均质化液体菌种，可以继续扩大培养后再次进行超声波破碎，得到更大量的菌种。
具体如下：
（1）保藏的食用菌母种接种至新鲜斜面，25-27℃培养活化7-10 d；
（2）活化菌种接种至PDA平板，25-27℃培养5-10 d；
（3）无菌条件下，用直径0.5-1 cm的打孔器于平板中菌落近边缘打孔；
（4）挑取打孔琼脂块菌种至50 mL液体培养基中进行摇瓶培养，30℃、160 rev/min培养5-10 d；液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
（5） 培养后进行超声波破碎，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声破碎条件为：连续间断超声6次、每次10 s，或超声3次、每次20 s，共1 min，功率为250 W，得到含大量菌丝片段的均质化液体菌种；
（6）液体菌种接种至装有液体培养基的摇瓶，接种量为2% (v/v)，温度30℃，160rev/min培养3-7 d。培养时间视菌种和培养目的而定，如作为液体菌种，则培养时间宜短，这时菌种活性高；如以收集菌丝体及活性产物为目的，则培养时间可较长，以充分发酵。
（7）培养结束后收集菌丝体和发酵液，用于活性物质提取；如以液体菌种培养为目的(培养时间较短),培养结束后超声破碎（也可以再次用于以扩大培养液体菌种为目的），得到的菌种作为液体发酵菌种或作为大量制备原种、栽培种的接种物或直接作为代料栽培的接种物。本发明的有益效果是： 液体深层发酵时，与原始液体菌种相比，采用超声破碎液体菌种作为接种物时，发酵周期缩短，生物量和多糖等活性产物产量高，且还可显著降低菌种使用量；此外，发酵培养过程可形成均一性菌丝球，有利于过程控制和细胞生理研究。食用菌代料栽培时，采用超声破碎菌种作为栽培接种物时，最大优势在于可显著减少菌种用量、缩短生产周期、提高菌种使用效率以及便于机械化、自动化接种的实现。
具体实施方式
本发明提供了一种食用菌液体菌种制作方法，下面以实施例来描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。
实施例1
灵芝液体菌种制作及摇瓶发酵
1、灵芝试管母种接种至新鲜斜面，26℃培养活化7-10 d；
2、活化菌种接种至PDA平板，26℃培养7-10 d；
3、超净工作台或无菌条件下，用直径1 cm的打孔器于平板中灵芝菌落近边缘打孔；
4、挑取打孔琼脂块菌种5块至50 mL液体培养基（250 mL摇瓶）进行摇瓶培养，培养条件为：30℃、160 rev/min培养10 d；其中，液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
5、采用超声波细胞仪破碎液体培养物，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声条件为250 W、连续超声20 s、共3次，合计1 min，获得含有大量菌丝片段的均质化液体菌种；
6、接种至装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶，接种量为2% (v/v)，30℃、160rev/min摇床振荡培养7 d；
7、发酵结束后收集菌丝体和发酵液，生物量、胞外多糖和胞内三萜酸分别达到16.7 g/L、2.4 g/L， 213 mg/L，而以原始液体菌种为接种物的发酵[接种量为10% (v/v)]分别仅为10.4 g/L、1.6 g/L和162 mg/L，提高了60.6%、50%和31.5%，而菌种使用量仅为后者的20%。
实施例2
猴头菇液体菌种制作及多糖摇瓶发酵
1、猴头菇试管母种接种至新鲜斜面，25℃培养活化7-10 d；
2、活化猴头菇菌种接种至PDA平板，25℃培养10 d；
3、超净工作台或无菌条件下用直径0.5 cm打孔器于菌落近边缘打孔；
4、挑取打孔琼脂块菌种5块至50 mL液体培养基（250 mL摇瓶）进行摇瓶培养，培养条件为：30℃、160 rev/min培养10 d；其中，液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
5、采用超声波细胞仪破碎液体培养物，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声条件为250 W、连续超声10 s、共6次，合计1 min，获得含有大量菌丝片段的均质化液体菌种，接种至装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶，接种量为2% (v/v)，30℃、160 rev/min摇床振荡培养7 d；
6、发酵结束后收集菌丝体和发酵液，生物量和胞外多糖分别达到13.1 g/L和1.7g/L，而以原始液体菌种为接种物的发酵[接种量为10% (v/v)]分别仅为8.2 g/L和1.1 g/L，提高了59.7%和54.5%，而菌种使用量仅为后者的20%。
实施例3
长根菇液体菌种制作及摇瓶发酵
1、长根菇试管母种接种至新鲜斜面，25℃培养活化7 d；
2、活化菌种接种至PDA平板， 25℃培养7 d；
3、超净工作台或无菌条件下用直径0.5 cm打孔器于菌落近边缘打孔；
4、挑取打孔琼脂块菌种5块至50 mL液体培养基（250 mL摇瓶）进行摇瓶培养，培养条件为：30℃、160 rev/min培养10 d；其中，液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
5、采用超声波细胞仪破碎液体培养物，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声条件为250 W、连续超声20 s、共3次，合计1 min，获得含有大量菌丝片段的均质化液体菌种，接种至装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶，接种量为2% (v/v)，30℃、160 rev/min摇床振荡培养7 d；
6、发酵结束后收集菌丝体提取胞内多糖，生物量和胞内多糖分别达到13.6 g/L和1.3 g/L，而以原始液体菌种为接种物的发酵[接种量为10% (v/v)]分别仅为8.9 g/L和0.74 g/L，提高了52.8%和75.7%，而菌种使用量仅为后者的20%。
实施例4
灵芝液体菌种制作及补料分批发酵
1、灵芝试管母种接种至新鲜斜面，25℃培养活化7-10 d；
2、活化灵芝菌种接种PDA至平板，25℃培养7 d；
3、超净工作台或无菌条件下用直径0.5 cm的打孔器于平板中在灵芝菌落近边缘打孔；
4、挑取打孔琼脂块菌种5块至50 mL液体培养基（250 mL摇瓶）进行摇瓶培养，培养条件为：30℃、160 rev/min培养10 d；其中，液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
5、采用超声波细胞仪破碎液体培养物，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声条件为250 W、连续超声20 s、共3次，合计1 min，获得含有大量菌丝片段的均质化液体菌种；为进一步扩大菌种量，接种至装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶，接种量为2%(v/v)，30℃、160 rev/min摇床振荡培养 5 d，形成大量均一性菌丝球；
6、含有大量菌丝球的液体菌种再次超声波破碎，破碎后接种至装有3 L液体发酵培养基的5 L发酵罐培养，培养条件为30℃、160 rev/min、1 vvm，发酵时间为7 d，其间补充葡萄糖使葡萄糖浓度维持10 g/L以上；
7、发酵结束后收集菌丝体以提取多糖和灵芝三萜酸，生物量、胞内多糖和胞内灵芝三萜酸分别为16.3 g/L、1.4/L和214 mg /L；而以原始液体菌种为接种物的发酵[接种量为10% (v/v)]分别仅为11.4 g/L、0.74 g/L和162 mg/L，分别提高了43%、89.2%以及32.1%，而菌种使用量仅为后者的20%。
实施例5
杏鲍菇液体菌种栽培出菇
1、杏鲍菇试管母种接种至新鲜斜面，25℃培养活化7-10 d；
2、活化菌种接种至PDA平板，25℃培养7 d；
3、无菌条件下以直径1 cm的打孔器于平板上菌落近边缘打孔；
4、挑取打孔琼脂块菌种5块至50 mL液体培养基（250 mL摇瓶）进行摇瓶培养，培养条件为：30℃、160 rev/min培养10 d；其中，液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨 3.5g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL去离子水；
5、采用超声波细胞仪破碎液体培养物，超声探头消毒后直接置于摇瓶液体培养物中，超声条件为250 W、连续超声20 s、共3次，合计1 min，获得含有大量菌丝片段的均质化液体菌种，接种至装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶，接种量为2% (v/v)，30℃、160 rev/min摇床振荡培养5 d，形成含有大量菌丝球液体菌种；
6、含大量菌丝球的液体菌种无菌条件下再超声波破碎，形成含有大量菌丝片段的液体菌种，无菌水稀释10倍；
7、稀释后的液体菌种用接种枪接种至杏鲍菇代料栽培菌包（湿重1 kg），每包接种量为 10 mL,经发菌培养及出菇阶段管理收获杏鲍菇子实体。
采用超声破碎液体菌种优点如下：与固体菌种相比，可实现快速接种，减轻劳动强度，同时生产周期缩短约12 d，鲜菇产量达到 320 g/包，略有提高；与原始液体菌种相比，菌种使用量显著减少，仅为其10%，提高了菌种使用效率；此外，超声破碎菌种可十分方便的应用于自动化接种。
Claims (3)
1.一种基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）活化保藏菌种： 保藏的食用菌母种接种至新鲜斜面，25-27℃培养活化7-10 d；
（2）活化菌种转至马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基（PDA）培养， 25-27℃培养5-10 d；
（3）待长出菌落后用打孔器于菌落近边缘打孔：无菌条件下，用直径0.5-1 cm 的打孔器于平板中菌落近边缘打孔；
（4）挑取打孔后琼脂块菌种至装有液体培养基的摇瓶培养：挑取打孔琼脂块菌种至50mL 液体培养基摇瓶培养，30℃、160 rev/min 培养5-10 d；
（5）利用超声波细胞破碎仪对培养后的菌种进行破碎，得到菌丝体均质化的液体菌种，从而数量级扩增接种物生长点，作为液体深层发酵或制备原种、栽培种、代料栽培的接种物；
利用超声波细胞破碎仪对培养后的菌种直接进行破碎，每次超声10 s、超声6 次，或每次超声20 s、超声3次，共1 min，超声功率250 W，得到含大量菌丝片段的均质化液体菌种；
液体菌种接种至装有液体培养基的摇瓶，接种量为2% (v/v)，温度30℃、160 rev/min培养3-7 d；
收集菌丝体和发酵液，用于活性物质提取；或者再次超声破碎，得到的菌种用于扩大液体发酵或作为大量制备原种、栽培种或代料栽培的接种物。
2.如权利要求1 所述的基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法，其特征在于：所述步骤（5）的均质化液体菌种，可以继续扩大培养后再次进行超声破碎，得到更大量的菌种。
3.如权利要求1 所述的基于超声破碎的食用菌液体菌种制作方法，其特征在于：所述步骤（4）的液体培养基配方为：葡萄糖35 g，蛋白胨3.5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5g，维生素B1 0.01 g，1000 mL 去离子水。
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