CN110387336A - 一种苹果轮纹病菌的接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苹果轮纹病病菌的接种方法，包括苹果轮纹菌液获得，菌液接种苹果果实，最后接种枝条。其中PDA液体培养基配方为马铃薯200g；葡萄糖20g；蒸馏水1000mL。本发明的有益效果是能够补充或者替代目前多数研究中用菌饼接种苹果轮纹病的方法，可以大量而且准确地接种，具有简单、高效的特点。

Description

一种苹果轮纹病菌的接种方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种苹果轮纹病菌的接种方法。

背景技术

目前，苹果轮纹病成为严重限制我国苹果产业健康持续发展的重要因素之一。2008年，对山东等我国7个苹果主产省市的88个果园调查结果显示，苹果轮纹病总体发病率为77.6％，其中山东省、河南省发病率均高达100％。轮纹病菌侵染枝干，形成病瘤，粗皮以及干腐状病症，严重影响树势，最终可导致树体或者枝条死亡；轮纹病菌侵染果实，严重时果实腐烂，导致产量和品质严重下降。据报道，一般年份，常规园采收的果实病果率为12-20％，常温下贮藏1个月后，病果率可达50-60％。苹果轮纹病菌不仅侵染田间生长的苹果，而且由于其潜伏侵染特性，还可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害。因此，苹果轮纹病被认为是80年代以来最严重的烂果病害之一，给果农及苹果产业造成了巨大的损失。亟待研发更好的防控措施，以促进我国苹果产业健康稳定发展。

研发病害防控措施的必要手段是借助于人工接种技术。而获得大量的孢子是人工接种的第一步。孢子可以通过洗涤气生菌丝，或者振荡培养等简易方法获得。但是苹果轮纹病的病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp.)一般条件下不易产生孢子。其常规的产孢方法是将病原菌接种在PDA培养基上，刮伤菌丝，紫外光(254nm)或黑光(365nm)照射。也可以接种幼果，转入黑光灯下培养获得。但是这些方法诱导时间长，并且需要一定的设备条件，诱导产孢量少,且效果不稳定,难以满足大批量接种试验的需求。这影响了对其生物学特性、致病机理和药剂毒理的研究，继而也影响了该病防控措施的研发。

目前由于苹果轮纹病病菌诱导孢子比较困难，因此大多数报道的相关研究中用PDA培养基上获得的菌饼替代孢子进行人工接种。为此，我们发明了一种补充或者替代菌饼接种的方法，可以大量而且准确地接种，进行相关研究。该技术具有简单、高效的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果轮纹病菌的接种方法，本发明的有益效果是能够补充或者替代目前多数研究中用菌饼接种苹果轮纹病的方法，可以大量而且准确地接种，具有简单、高效的特点。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：苹果轮纹菌液获得：

在超净工作台中，取无菌PDA液体培养基加入高温灭菌的三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中培养，苹果轮纹病菌菌丝产生菌丝球状物；在超净工作台中，取无菌PDA液体培养基加入无菌离心管，再从三角瓶中的培养物中夹取两三个菌丝球状物放入离心管中；取一大烧杯，加满冰块，将上述离心管插入冰块中并固定于烧杯中；将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体，将菌丝球状物破碎为乳液状；

步骤2：菌液接种苹果果实：

选取大小一致、无损伤的富士苹果果实，将果实用酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；在赤道处相对位置用打孔器打两个孔，用移液枪吸取破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中加等量的PDA液体培养基做对照；将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中培养，观察发病情况；

步骤3：接种枝条：

选取枝条嫩梢，洗净后用酒精消毒，无菌水冲洗，在枝条上用尖头小镍将嫩梢刺伤；吸取破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入等量的液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好，嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入无菌水；放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖培养，观察发病情况。

进一步，步骤1：苹果轮纹菌液获得：

在超净工作台中，取50mL灭菌的PDA液体培养基加入高温灭菌的100mL三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中28℃、200rpm培养3d后，苹果轮纹病菌菌丝产生直径为0.5-2cm不等的菌丝球状物；在超净工作台中，取30mL PDA液体培养基加入50mL的离心管，再从三角瓶中培养物中夹取两三个菌丝球状物放入50mL离心管中；取一大烧杯，加满冰块，将上述50mL离心管插入冰块中并固定于烧杯中；将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体2cm左右，设置超声时间3s，间隔时间5s，工作次数90次，将菌丝球状物破碎为乳液状。

进一步，步骤2：菌液接种苹果果实：

选取大小一致、无损伤的富士苹果果实，将果实用75％酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；在赤道处相对位置用5mm的打孔器打上两个5mm深的孔，用移液枪吸取20μL破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中加入20μL PDA液体培养基做对照；将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中，28℃培养，观察发病情况。

进一步，步骤3：接种枝条：

选取枝条嫩梢，洗净后用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗四次，在枝条上相隔10cm，用尖头小镍将嫩梢刺伤；吸取20μL破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入20μL液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好，嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入1mL无菌水；放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖，28℃培养，观察发病情况。

进一步，PDA液体培养基配方为马铃薯200g；葡萄糖20g；蒸馏水1000mL。

附图说明

图1是苹果轮纹病菌振荡培养3d后形成的菌丝球状物；

图2是苹果轮纹病菌菌丝球状物超声波破碎后形成的菌液接种苹果果实后发病情况；

图3是苹果轮纹病菌菌丝球状物超声波破碎后形成的菌液接种苹果枝条后发病情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

苹果轮纹菌液获得：

·菌液振荡培养：在超净工作台中，取50mL的PDA液体培养基加入高温灭菌的100mL三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中28℃、200rpm培养3d后，苹果轮纹病菌菌丝产生直径约为0.5-2cm不等的菌丝球状物；

·在超净工作台中，取30mL PDA液体培养基加入50mL的离心管，再从三角瓶中培养物中夹取两三个菌丝球状物放入50mL离心管中；

·取一大烧杯，加满冰块，将上述50mL离心管插入冰块中并固定于烧杯中；

·将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体2cm左右，设置超声时间3s，间隔时间5s，工作次数90次，将菌丝球状物破碎为乳液状。

菌液接种苹果果实

·选取大小一致、无损伤的富士苹果果实。将果实用75％酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；

·在赤道处相对位置用5mm的打孔器打上两个5mm深的孔，用移液枪吸取20μL破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中加入20μL PDA液体培养基做对照；

·将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中，28℃培养，观察发病情况。接种枝条

·选取枝条嫩梢，洗净后用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗四次，在枝条上相隔10cm，用尖头小镍将嫩梢刺伤；

·吸取20μL破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入20μL液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好。嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入1mL无菌水；

·放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖，28℃培养，观察发病情况。

PDA液体培养基配方：

马铃薯200g；

葡萄糖20g；

蒸馏水1000mL；

自然PH。

1.苹果轮纹病菌震荡培养后的情况

苹果轮纹病菌在200rpm，28℃培养3d后，培养生成的菌丝粘结形成菌丝球状体，大多数直径超过0.5cm，体积大的直径可以超过2cm。而培养液还是澄清状，没有形成一般真菌培养后的乳液状。图1为苹果轮纹病菌振荡培养3d后形成的菌丝球状物。

2.破碎后的菌液

将培养物倒入50mL的离心管，超声波破碎后，菌丝球状物变小，最后形成了乳液状。

3.菌液接种果实的致病性检测

为了检测破碎后的菌液是否具有强致病性，将20μL菌液接种苹果。28℃培养，1d后接种孔边沿开始变褐色，褐色带逐渐向外扩展，3d后，病斑直径可以2.5-3.5cm，5d后，果皮颜色呈现为黄褐色，整个果实呈现果实腐烂的状态，而且渗出水状物，轻轻一捏，从果柄部位渗出较多的溶液状物。说明破碎的菌液对果实具有很强的致病性，而对照没有发病迹象。图2为苹果轮纹病菌菌丝球状物超声波破碎后形成的菌液接种苹果果实后发病情况，其中，a:3d后的对照；b：接种轮纹病菌3d后的情况；c：接种轮纹病菌5d后果实全部变褐，渗出液状物。4.菌液接种苹果枝条的致病性检测

为了进一步验证破碎的菌液对苹果树枝条的致病性，将20μL接种在新稍上，4d后接种部位枝条组织出现坏死斑，6d后嫩梢接种处全部腐烂，病斑直径可以达到2cm，而对照处枝条组织没有表现病症，说明破碎的菌液对枝条也具有强致病性。图3为苹果轮纹病菌菌丝球状物超声波破碎后形成的菌液接种苹果枝条后发病情况，其中a:3d后的接种轮纹病的形成的病斑；b：对照部位。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种苹果轮纹病病菌的接种方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1：苹果轮纹菌液获得：

在超净工作台中，取PDA液体培养加入高温灭菌的三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中培养，苹果轮纹病菌菌丝产生菌丝球状物；在超净工作台中，取PDA液体培养基加入离心管，再从三角瓶中培养物中夹取两三个菌丝球状物放入离心管中；取一大烧杯，加满冰块，将上述离心管插入冰块中并固定于烧杯中；将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体，将菌丝球状物破碎为乳液状；

步骤2：菌液接种苹果果实：

选取大小一致、无损伤的富士苹果果实，将果实用酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；在赤道处相对位置用打孔器打上两个孔，用移液枪吸取破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中加入等量PDA液体培养基做对照；将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中培养，观察发病情况；

步骤3：接种枝条：

选取枝条嫩梢，洗净后用酒精消毒，无菌水冲洗，在枝条上用尖头小镍将嫩梢刺伤；吸取破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好，嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入无菌水；放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖培养，观察发病情况。

2.按照权利要求1所述一种苹果轮纹病病菌的接种方法，其特征在于：所述步骤1：苹果轮纹菌液获得：

在超净工作台中，取50mL无菌的PDA液体培养基加入高温灭菌的100mL三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中28℃、200rpm培养3d后，轮纹病菌菌丝产生直径为0.5-2cm不等的菌丝球状物；在超净工作台中，取30mL PDA液体培养基加入50mL的离心管，再从三角瓶中培养物中夹取两三个菌丝球状物放入50mL离心管中；取一大烧杯，加满冰块，将上述50mL离心管插入冰块中并固定于烧杯中；将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体2cm左右，设置超声时间3s，间隔时间5s，工作次数90次，将菌丝球状物破碎为乳液状。

3.按照权利要求1所述一种苹果轮纹病病菌的接种方法，其特征在于：所述步骤2：菌液接种苹果果实：

选取大小一致、无损伤的富士苹果果实，将果实用75％酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；在赤道处相对位置用5mm的打孔器打上两个5mm深的孔，用移液枪吸取20μL破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中20μL PDA液体培养基做对照；将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中，28℃培养，观察发病情况。

4.按照权利要求1所述一种苹果轮纹病病菌的接种方法，其特征在于：所述步骤3：接种枝条：

选取枝条嫩梢，洗净后用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗四次，在枝条上相隔10cm，用尖头小镍将嫩梢刺伤；吸取20μL破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入20μL液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好，嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入1mL无菌水；放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖，28℃培养，观察发病情况。

5.按照权利要求1所述一种苹果轮纹病病菌的接种方法，其特征在于：所述PDA液体培养基配方为马铃薯200g；葡萄糖20g；蒸馏水1000mL。