CN103374543A

CN103374543A - 一种盾壳霉zs-1sb菌剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103374543A
Application number: CN2012101230603A
Authority: CN
Inventors: 姜道宏; 程家森; 付艳苹; 谢甲涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-04-24
Also published as: CN103374543B

Abstract

本发明公开了一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法及应用，其步骤：（1）先将盾壳霉ZS-1SB菌株在PDA斜面培养；用无菌水冲洗斜面，调至分生孢子悬浮液为10⁶孢子/ml；（2）将步骤1制备的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液在150r/min，在一定条件下振荡，得到盾壳霉ZS-1SB菌液；（3）将燕麦片和谷壳以体积比混匀，加入使含水量达到40%，应用食用菌装袋机装料，常压蒸汽灭菌。冷却后，接种盾壳霉ZS-1SB菌液，30ml/培养瓶，在一定条件下培养；本发明的制备方法制备的盾壳霉产量可达3.2×10¹⁰孢子/g干培养料。生防菌剂在田间栽培条件下，土壤撒施和花期地上部分喷施对油菜菌核病的防效达到了57%，可以应用于大规模病害防治。

Description

一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，更具体涉及一种具有菌核病生防潜能的盾壳霉ZS-1SB菌剂的大规模机械化固体发酵的方法，同时还涉及一种盾壳霉ZS-1SB菌剂在制备治疗或预防油菜菌核病药物中的应用。

背景技术

核盘菌可以侵染油菜、大豆、向日葵等主要的油料作物和莴苣、大白菜、芹菜、胡萝卜等重要的蔬菜作物，在世界范围内引起多种植物的菌核病。由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种植资源，没有抗病品种可以利用，由其引致的菌核病仍然是农业生产中世界性的难题。由于化学农药难以抵达油菜的茎部和枝条等受害部位和抗药性问题的日趋严重，使得人们更多的重视病害的生物防治。盾壳霉(Coniothyrium minitans)首次由美国学者Campbell(Campbell，Mycologia，1947，39：190-195)描述和命名，而后国内外多名学者报道、应用盾壳霉对油菜菌核病的防治作用，因其专一性选择寄生核盘菌菌核、具有与核盘菌相似的温度等环境要求、对动植物安全而成为环境微生物中最具生态优势、最有生防潜力的生防菌(Whipps & Gerlagh，Mycol Res，11：897-907；Jones et al，Mycol Res，2003，107，267-276；Li et al，Eur J Plant Pathol，2006，114，345-355)。与其它生防真菌类似，盾壳霉的开发和应用受到规模化生产的限制，目前高效生产盾壳霉的分生孢子是商业化应用的关键。

授权号为ZLZL 200910062405.7的专利(姜道宏等，2010)公开了利用燕麦片和谷糠进行半敞开式固体发酵培养盾壳霉的方法；申请号为CN201110162803.3的专利(刘勇等，2011)公开了利用谷糠培养基在固态发酵罐中经121℃、0.15MPa灭菌1小时后制备盾壳霉(菌株号Cm2004)的方法，分生孢子产量达5.58×10⁹个/g；申请号为CN201010120300.5的专利(姚永秀，2010)公开了利用农业废弃物湿热灭菌1小时后在生化培养箱中培养盾壳霉分生孢子的方法。已报道的方法对设备均有较高的要求，需要高压灭菌设备或特殊的培养场地(生化培养箱或发酵罐)，不适宜于盾壳霉的大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法，该方法采用燕麦片和谷壳为材料，培养瓶为容器，机械化装料，常压蒸汽灭菌，20℃培养室培养18天，盾壳霉分生孢子产量可达3.2×10¹⁰孢子/g干培养料。本发明提供的技术流程操作简单，适宜于大规模机械化生产。本发明所使用的盾壳霉菌株(Coniothyrium minitans)ZS-1SB，已于2009年5月31日送交用于专利程序的位于湖北省武汉市武汉大学内的国际生物材料样品保藏机构--中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M209114。

本发明的另一个目的是在提供了一种盾壳霉ZS-1SB菌剂在制备治疗或预防油菜菌核病药物中的应用，防病效果显著，油菜苗期土壤撒施可以显著降低萌发子囊盘数量，防病效果达到57％以上；油菜花期喷施地上部分，一半以上的田块防效达到3级以上。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法，其步骤是：

(1)将盾壳霉ZS-1SB菌株在PDA斜面上，于18-22℃条件下培养6-8d。用无菌水冲洗斜面，调至分生孢子悬浮液为10⁶孢子/ml；

(2)将制备的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液在150r/min，18-22℃条件下振荡1-3h，得到盾壳霉ZS-1SB菌液；

(3)将培养料燕麦片和谷壳以体积比为1∶1混匀，加入水，使含水量达到40％，应用食用菌装袋机将培养料装入高17cm内径10cm、容积为1300ml的培养瓶，800g培养料/培养瓶，加盖常压蒸汽灭菌11-13h，冷却至室温(20-25℃，以下相同)后，在无菌接种箱内接种步骤2制备的盾壳霉ZS-1SB菌液，30ml/培养瓶，置于18-22℃培养室培养17-19天，然后自然风干，粉碎，真空包装即可。

常压蒸汽灭菌：通过热蒸汽使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热穿透力强，灭菌效果较干热好。

所述的PDA培养基的组分及配比如下：

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃蒸汽灭菌30min。

研究表明，采用本发明提供的方法生产的盾壳霉分生孢子制剂可以显著降低田间核盘菌菌核萌发的子囊盘数量，无论是进行油菜苗期土壤撒施，还是油菜花期地上部分喷雾，对油菜菌核病均有显著的防治效果。

规模化生产是应用生防菌剂进行田间作物病害防治的关键，应用盾壳霉制剂防治油菜菌核病更是如此。本发明提供的盾壳霉的制备方法具有以下有优点：

1.原材料为农业生产的副产品，来源广，价格低廉；

2.生产技术流程简单，无需使用专业的高压灭菌和恒温培养设备，借助食用菌栽培的技术体系，即可实现规模化、机械化生产；

3.盾壳霉制剂孢子含量高，可达3.2×10¹⁰孢子/g干培养料；

4.防病效果显著，油菜苗期土壤撒施可以显著降低萌发子囊盘数量，防病效果达到57％；油菜花期喷施地上部分，一半以上的田块防效达到3级以上。

附图说明

图1为一种盾壳霉ZS-1SB大规模机械化固体发酵情况示意图。

图1A显示本发明提供的大规模机械化固体发酵；图1B是培养终期形成的含有盾壳霉ZS-1SB菌剂的培养物。

图2为一种盾壳霉ZS-1SB菌剂防治油菜菌核病防效频率图。

图2A显示发病率防效频率；图2B显示病指防效频率。

具体实施方式

在下面的实施例中，申请人对该菌株进行发酵培养，同时应用制备的盾壳霉菌剂进行油菜菌核病的田间防治试验，以确定其对菌核病的控制作用。

实施例1：盾壳霉ZS-1SB菌剂的大规模机械化固体发酵的方法，其步骤是：

1.盾壳霉ZS-1SB孢子悬浮液制备：将盾壳霉ZS-1SB菌株置于PDA培养基(配方如前所述)斜面上，于20℃条件下培养7d。用无菌水冲洗斜面，调至分生孢子悬浮液为10⁶孢子/ml。

2.盾壳霉ZS-1SB的预培养：将步骤1制备的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液在150r/min，20℃条件下振荡2h，得到盾壳霉ZS-1SB菌液，备用。

3.盾壳霉ZS-1SB菌剂大规模机械化固体发酵培养：将干培养料(含水量一般不超过8％)燕麦片(商购)和谷壳(商购)以体积比为1∶1混匀，加入适量水(使其浸涨，使含水量达到40％，应用食用菌装袋机(浙江省磐安县康立机械厂，ZDJ2080型高效食用菌装袋机)将培养料装入高17cm内径10cm、容积为1300ml的培养瓶，800g培养料/培养瓶，加盖常压蒸汽灭菌12h。冷却至室温后，在无菌接种箱内接种步骤2制备的盾壳霉ZS-1SB菌液，30ml/培养瓶，置于20℃培养室培养18天(见图1A和图1B)，然后自然风干，粉碎，真空包装即可，经检测本实施例的盾壳霉ZS-1SB菌剂含孢子数可达3.2×10¹⁰孢子/g干培养料。

实施例2：一种生防菌盾壳霉ZS-1SB菌剂在制备治疗或预防油菜菌核病药物中的应用，其应用过程是：

为了验证本发明生产的盾壳霉ZS-1SB菌剂的防病效果，申请人选择湖北省武穴市油菜大田进行了油菜菌核病的田间防治试验。

1.苗期土壤撒施防病试验：

试验安排在湖北省武穴市杨门村，共120亩。供试油菜品种为当地主要推广的优质高产(双低型)甘蓝型杂交油菜新品种“华油杂6号”，按照常规方法育苗和移栽。在油菜苗期每亩撒施拌有0.5kg盾壳霉菌剂的细土20kg，未撒施盾壳霉田块为对照。随机选取至少5块油菜田(面积大于3亩)和对照田块，采用5点取样法，在子囊盘萌发高峰期调查子囊盘数量，在油菜收获前调查茎发病率并记载发病级别，计算病情指数和病指防效。

病情指数＝∑[病级数×该级病株数]/(调查总数×最高病级数)×100

病指防效(％)＝(对照菌核病病情指数-处理防菌核病病情指数)/对照菌核病病情指数

调查结果表明，处理区高峰期子囊盘数量平均为1.0个/m²，而对照田块高峰期子囊盘数量为2.4个/m²，子囊盘减少率达到60％；茎发病率和病情指数分别为5.3％和2.1，而未处理对照田块茎发病率和病情指数分别为11.9％和5.3，病指防效为57％。

2.花期喷雾防病试验：

试验安排在湖北省武穴市花桥镇，面积为1000亩，油菜品种为华双5号，按照常规方法育苗和移栽。在油菜初花期(指约5-10％的油菜主茎开花；油菜初花期是指油菜始花期后6天)，机动或人工喷雾器喷雾油菜植株，盾壳霉分生孢子浓度为10⁷个/ml。在试验区随机选取至少5块油菜田(面积大于3亩)为不喷任何药剂对照田块，采用5点取样法在油菜收获前调查茎发病率并记载发病级别，计算病情指数、病指防效和和病株率防效。同时将防效水平划分4个等级，统计示范区田块的防效频率。

病株率防效(％)＝(对照菌核病株发病率-处理防菌核病株发病率)/对照菌核病株发病率

盾壳霉菌剂防治油菜菌核病结果如下：病株率低防效(防效范围：0％～25％)频率为7％、中等防效(防效范围：25～50％)频率为29％、偏好防效(防效范围：50～75％)频率为36％、高防效(防效范围：75～100％)频率为29％(图2)；病指低防效频率为14％、中等防效频率为29％、偏好防效频率为21％、高防效频率为36％。防效结果表明，武穴市试验区有一半以上的田块防效达到3级以上，即分别有21％的田块防效达到3级，36％的田块防效达到4级。

田间试验结果表明本发明制备的盾壳霉ZS-1SB菌剂可以有效降低田间核盘菌菌核萌发的子囊盘数量，并降低油菜菌核病病情指数，具有较好的防治作用，显示其具有良好的开发应用前景。

Claims

1.一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法，其步骤是：

（1）将盾壳霉ZS-1SB菌株在PDA斜面上，于18-22℃条件下培养6-8d，用无菌水冲洗斜面，调至分生孢子悬浮液为10⁶孢子/ml；

（2）将制备的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液在150 r/min，18-22℃条件下振荡1-3 h，得到盾壳霉ZS-1 SB菌液；

（3）将干培养料燕麦片和谷壳以体积比为1：1混匀，加入水，使含水量达到40%，应用食用菌装袋机将培养料装入高17cm内径10cm、容积为1300 ml的培养瓶，800g培养料/培养瓶，加盖常压蒸汽灭菌11－13 h，冷却至室温后，在无菌接种箱内接种步骤2 制备的盾壳霉ZS-1 SB菌液，30ml/培养瓶，置于18－22℃培养室培养17-19天，然后自然风干，粉碎，真空包装。

2.根据权利要求1所述的一种盾壳霉ZS-1SB菌剂的制备方法，其特征在于：所述的PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，补充蒸馏水至1000 ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

3.权利要求1所述的一种盾壳霉ZS-1SB菌剂在制备治疗或预防油菜菌核病药物中的应用。