CN104651237A - 一种高效解磷的黑曲霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种具有解磷功能的黑曲霉菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2015004。所述黑曲霉能将难溶性无机磷液体培养基中的难溶磷（Ca3(PO4)2）分解成可溶性的有效磷，使培养基中有效磷含量高达0.680mg/mL，解磷效果显著。在油菜大田栽培实验中，使用本发明筛选到的黑曲霉能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉可用于制备解磷菌剂，广泛应用于农业生产中，前景广阔。

Description

一种高效解磷的黑曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种高效解磷的黑曲霉菌株及其应用。
背景技术
作为三大营养元素之一的磷，不仅是很多器官的组成成分，而且参与许多重要的生命代谢活动，磷对作物碳水化合物的合成、分解和运输起着重要的作用，可以改善糖用、淀粉以及油料作物的磷素营养，土壤中磷元素的丰缺对作物的产量和品质影响尤为明显。
从我国情况来看，全国有74%耕地土壤缺磷，解决这一问题不外乎两条途径：一是增加磷源投入，二是提高难溶性磷的利用率。
从农业的可持续发展来看，第一条途径存在一定的问题，首先，磷是一个不可再生资源，根据已探明的磷矿储量和开采速度，世界现有磷矿资源只能维持100年左右，而且我国磷矿资源并不丰富，且品位较低，大量的磷肥依赖进口。其次，磷肥生产需要大量的硫酸或磷酸，能源消耗大，增加了农业生产的成本。再次，高水溶性磷肥施入固磷强的石灰性土壤中，作物的当季利用率一般只有5%~10%，加上作物的后效，也不超过25%。因此，大部分磷肥作为无效态（难溶态）在土壤中积累。据报道，至少有70%~90%的磷进入土壤而成为难以被作物吸收利用的固定形态（鲁如坤，1995年）。在这些土壤中，土壤有效磷含量很低而全磷含量较高，如据黄土高原7省区的调查，土壤全磷平均较有效磷高250倍；黄淮海平原黄潮土与风沙土全磷较有效磷高130~500倍（李振生，1992年）。我国自20世纪50年代施用化学磷肥以来，储存累积在土壤中的难溶性磷高达6000万 t，超过全国磷肥10年消费量的总和。
第二条途径的潜力很大，它是对土壤中磷及所施入的磷肥进行活化提高其有效性，走低投入高产出的可持续发展之路。第二条途径包括三方面的内容：一是发挥植物的自身潜力，通过育种技术的创新，定向地筛选培育磷高效植物品种来开发利用土壤难溶性磷素资源，这方面研究已成为世界许多科学家研究的热点；二是在研究磷在土壤中的形态分布特征和作物吸磷特性的基础上，通过改进磷肥的施用技术等方式提高磷的潜在有效性；三是从土壤中筛选高效解磷微生物，研制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，将土壤中难溶性磷活化出来。可见解磷菌的研究对发展持续高效农业具有深远的战略意义，因此筛选出更多、解磷效果更好的微生物一直是国内外研究的热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高效解磷的黑曲霉菌株及其应用。该菌株是从石灰性土壤中筛选得到的，能有效提高土壤中有效磷的含量，应用前景广阔。
    本发明一方面提供了一种黑曲霉FMJ1（Aspergillus niger FMJ1），已于2015年1月5日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015004。
    本发明另一方面提供了一种解磷菌剂，包含上述黑曲霉FMJ1。
    所述解磷菌剂，还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一种或两种或多种的组合。
    所述解磷菌剂在农业生产中的应用。
本发明筛选到的黑曲霉FMJ1能将难溶性无机磷液体培养基中的难溶磷（Ca3(PO4)2）分解成可溶性的有效磷，使培养基中有效磷含量高达0.680mg/mL，解磷效果显著。在油菜大田栽培实验中，黑曲霉FMJ1处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了274.7%和206.1%，比培养基处理组分别提高268.9％和199.6％，有效磷含量比空白处理组提高了65.8%，比培养基处理组提高了61.7%。从而说明，使用本发明筛选到的黑曲霉FMJ1能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，取得了意料不到的技术效果。黑曲霉FMJ1可用于制备解磷菌剂，广泛应用于农业生产中，前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于本发明所涉及的培养基配方如下：
难溶性无机磷固体培养基：
葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.5 g, NaCl 0.3 g, KC1 0.3 g, MgSO4·7H20 0.3 g, FeSO4.7H20 0.03 g, MnSO4.4H20 0.03 g,Ca3(PO4)25.0 g,蒸馏水1000 ml, pH 7.0-7.5，琼脂20 g, 115 ℃灭菌30 min，备用。
难溶性无机磷液体培养基：
葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.5 g, NaCl 0.3 g, KC1 0.3 g, MgSO4.7H20 0.3 g, FeSO4.7 H20 0.03 g, MnSO4.4H20 0.03 g，Ca3(PO4 )25.0 g,蒸馏水1000 ml, pH 7.0-7.5，115 ℃灭菌30 min，备用。
实施例1 土壤中微生物的初步筛选
土壤稀释液的制备：从济南南部山区取回石灰性土壤，称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：106-107的土壤稀释溶液。
取0.1ml土壤稀释溶液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养箱中倒置培养2-3天，观察培养基上长出的菌落，其中有11个菌落周围产生了明显的颜色变化，并有透明圈产生，将其分别命名为YW-1，YW-2，YW-3，……，YW-11。
实施例2解磷微生物的复筛
    将实施例1初筛得到的11株菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养3天后，观察菌落周围透明圈的大小，结果发现透明圈最大的五株菌分别为YW-2，YW-3，YW-7，YW-9，YW-10。
将上述透明圈最大的五株菌分别接种到50mL难溶性无机磷液体培养基中，30℃，200rpm，培养6天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组；分别检测培养液中的活菌数量，具体结果见表1。
2.1 磷标准曲线的绘制
依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。
2.2 培养液有效磷含量测定
    在无菌条件下分别取上述五株菌的培养液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表1。
表1 不同菌株的解磷效果
样品 活菌数（CFU/mL） 有效磷含量（mg/mL）
空白对照组 0 0
YW-2 106-107 0.054
YW-3 107-108 0.139
YW-7 107-108 0.076
YW-9 107-108 0.680
YW-10 106-107 0.048
从表1的结果可以看出，本发明筛选到的上述五株菌均具有一定的解磷效果，能将培养基中的难溶磷（Ca3(PO4)2）分解成可溶性的有效磷，其中YW-9菌株的繁殖力较强，解磷效率最高，有效磷含量高达0.680mg/mL。因此，该菌株可做成解磷菌剂，广泛应用于农业生产中。
实施例3  YW-9菌株的鉴定
1）YW-9菌株的菌落形态：
菌落为黑褐色，呈厚绒状，边缘圆形、整齐；菌落背面无色或中央略带黄褐色。菌落正面有大量的分生孢子，褐黑色，无渗出液；菌丛呈黑褐色，菌丝发达，分生孢子头状如“菊花”， 具有两层孢子小梗，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色。
2）YW-9菌株的分子生物学鉴定：
采用分子生物学的方法对上述筛选得到的YW-9菌株进行鉴定，测得其18s rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行blast比对。结合YW-9菌株的菌落形态和18srDNA比对结果，申请人确认YW-9菌株为黑曲霉（Aspergillus niger），命名为黑曲霉FMJ1（Aspergillus niger FMJ1）。
申请人已于2015年1月5日将上述黑曲霉FMJ1（Aspergillus niger FMJ1）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2015004。
实施例4 黑曲霉FMJ1在油菜大田栽培实验中的应用
1、黑曲霉FMJ1菌液的制备：
先将上述黑曲霉FMJ1接种到PDA固体培养基上，28℃培养3-4天至孢子成熟，将长好的孢子用适量无菌生理盐水洗下，转接入马铃薯液体培养基中，充分混合均匀，于28℃培养4天，发酵液中活菌数含量为109-1010CFU/mL。
2、实验地点：青岛市城阳区惜福镇油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。
3、实验过程：
选取2m×2m的方形区域作为一个实验区，共设置30个实验区，且每个实验区之间保持1米的间隔。
实验共设3个组：①空白对照组：不添加任何物质；②培养基处理组：在每个实验区中按50mL/m2的比例均匀喷洒上述灭菌的马铃薯液体培养基，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀；③黑曲霉FMJ1处理组：在每个实验区中按50mL/m2的比例均匀喷洒上述黑曲霉FMJ1发酵菌液，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。
1）种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥。
2）播种与收获：在每个实验区均匀播种30g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种45天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。
3）收获油菜的同时，分别采集每个实验区的土样，采用Olsen法检测土样中有效磷的含量，并进行比较。
试验结果表明：与空白对照组相比，培养基处理组油菜的平均鲜重和干重分别提高了5.8%和6.5%，有效磷含量提高了4.1%；黑曲霉FMJ1处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了274.7%和206.1%，比培养基处理组分别提高268.9％和199.6％，有效磷含量比空白处理组提高了65.8%，比培养基处理组提高了61.7%。从而说明，使用本发明筛选到的黑曲霉FMJ1能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，取得了意料不到的效果。
本发明所述黑曲霉FMJ1可作为解磷菌剂单独使用，也可与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一种或两种或多种的组合混合制备解磷菌剂，能使土壤中有效磷的含量普遍提高30%-60%，效果显著。

Claims (4)

1.一种黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉的保藏编号为CCTCC NO：M2015004。
2.一种解磷菌剂，其特征在于，所述解磷菌剂包含权利要求1所述的黑曲霉。
3.如权利要求2所述的解磷菌剂，其特征在于，所述解磷菌剂包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一种或两种或多种的组合。
4.权利要求2或3所述解磷菌剂在农业生产中的应用。
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