CN111394255A - 一种埋藏曲霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种埋藏曲霉及其应用，所述埋藏曲霉命名为Aspergillus sp.MN114011，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60666，保藏日期为2019年5月14日。本发明的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011对于浓度高达20％的难溶性磷源具有显著的解磷效果，可以有效提高有效磷的含量，增强土壤磷的利用率；同时能够促进作物增产，埋藏曲霉处理后的玉米作物，根系得到明显增强，具有显著的促进作物生长的作用；在制备解磷剂和生长促进剂方法具有广阔的应用前景。

Description

一种埋藏曲霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种埋藏曲霉及其应用，尤其涉及一种埋藏曲霉及其在土壤解磷和促进植物生长中的应用。
背景技术
作为三大营养元素之一，磷元素在参与器官构成、促进代谢活动等方面具有重要作用，对作物的碳水化合物合成、分解和运输具有显著的促进作用，土壤中磷元素的丰缺对作物的产量和品质影响尤为明显。
自20世纪50年代以来，由于化学磷肥的过度施用，储存累积在土壤中的难溶性磷高达6000万吨，超过全国磷肥10年消费量的总和。盐碱地在我国分布广泛，尤其在黄河三角洲地区分布有大面积盐碱地，在这些盐碱地中，土壤有效磷的含量较低而全磷含量较高。例如，对黄土高原7省区进行土地调查，土壤全磷含量较有效磷的含量高250倍；黄淮海平原黄潮土与风沙土的全磷含量较有效磷高130～500倍。磷是植物的必需营养元素之一，但是在土壤中、尤其是在盐碱地中，磷大多以作物难以利用的无机态或有机态存在，显著降低了作物对磷的利用效率，造成了农业效益低下、作物产量低等问题。
解磷菌可以提高土壤磷的利用率，解磷菌在代谢过程中产生多种酶：如植酸酶、核酸酶、磷脂酶和有机酸类，并通过酸化、螯合和离子交换等过程将难溶磷变为可溶磷供植物吸收利用；施加解磷菌可以促进土壤中有效磷的转化，提高作物产量。
CN104651237A公开了一种高效解磷的黑曲霉菌株及其应用，所述黑曲霉能将难溶性无机磷液体培养基中的难溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，使培养基中有效磷含量高达0.680mg/mL，解磷效果显著；在油菜大田栽培实验中，所述黑曲霉能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，但是所述黑曲霉不适用于高盐浓度土壤的解磷。
CN106222096A公开了一株塔宾曲霉菌CT1及其在盐碱地解磷方面的应用，所述塔宾曲霉菌CT1可以有效提高土壤磷的利用率，促进作物增产，但是所述塔宾曲霉菌CT1的解磷能力随着盐浓度升高而降低。
因此，获取新的解磷微生物用于高磷浓度土壤的解磷，在农业领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种埋藏曲霉及其应用，所述埋藏曲霉对于高浓度的难溶性磷源具有显著的解磷效果，可以有效提高土壤磷的利用率，促进作物增产，具有广阔的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种埋藏曲霉，所述埋藏曲霉命名为Aspergillus sp.MN114011，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60666，保藏日期为2019年5月14日。
本发明中，埋藏曲霉具有暗金黄色的分生孢子头，大而壁厚的顶囊以及球形的分生孢子，保藏编号为GDMCC 60666的埋藏曲霉可以将难溶性磷源转化为植物可吸收的磷化合物，具有促进植物生长的作用。
优选地，所述埋藏曲霉的ITS序列如SEQ ID NO:1所示；
SEQ ID NO:1：
GGAAGATCATTACCGAGTGAGGACCTAACCGGTCCAACCTCCCACCC GTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCGTGGCCGCCGG GGGGCATCTCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCAACACGAAC ACTGTCTGAAGGTTGCAGTCTGAGTCGATTTATTTAATCGTTAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCA CATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT GCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCTTCCCGGGGGAC GGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGG GCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCTGCCGACCACCAACC TTTTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTA AGCATATCAAAAGC。
第二方面，本发明提供了一种解磷菌剂，所述解磷菌剂包括如第一方面所述的埋藏曲霉。
优选地，所述埋藏曲霉的浓度为(1.0～2.0)×109CFU/mL，例如可以是1.0×109CFU/mL、1.1×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL、1.3×109CFU/mL、1.4×109CFU/mL、 1.5×109CFU/mL、1.6×109CFU/mL、1.7×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、1.9×109 CFU/mL或2.0×109CFU/mL。
优选地，所述解磷菌剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的解磷菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将埋藏曲霉接种于LB培养基中，振荡培养得到种子液；
(2)吸取种子液接种到发酵培养基中，发酵培养；
(3)将发酵液过滤，得到所述解磷菌剂。
优选地，步骤(1)所述振荡培养的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、 27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为25～28℃。
优选地，步骤(1)所述振荡培养的速度为120～200r/min，例如可以是120 r/min、130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min 或200r/min，优选为150～200r/min。
优选地，步骤(1)所述振荡培养的时间为20～25h，例如可以是20h、21h、 22h、23h、24h或25h，优选为24h。
优选地，步骤(2)所述发酵培养基的pH为6.5～7.5，例如可以是6.5、6.6、 6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地，步骤(2)所述发酵培养的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、 27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为25～28℃。
优选地，步骤(2)所述发酵培养的时间为20～25h，例如可以是20h、21h、 22h、23h、24h或25h，优选为24h。
优选地，步骤(3)所述过滤采用0.22μm细菌过滤器进行。
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第二方面所述的解磷菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将埋藏曲霉接种于LB培养基中，在25～35℃下以120～200r/min的速度振荡培养20～25h，得到种子液；
(2)吸取种子液接种到pH为6.5～7.5的发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养20～25h；
(3)将发酵液采用0.22μm细菌过滤器过滤，得到所述解磷菌剂。
第四方面，本发明提供了一种生长促进剂，所述生长促进剂包括如第一方面所述的埋藏曲霉。
优选地，所述埋藏曲霉的浓度为(1.0～2.0)×109CFU/mL，例如可以是1.0×109CFU/mL、1.1×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL、1.3×109CFU/mL、1.4×109CFU/mL、 1.5×109CFU/mL、1.6×109CFU/mL、1.7×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、1.9×109 CFU/mL或2.0×109CFU/mL。
优选地，所述生长促进剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的埋藏曲霉和/或如第二方面所述的解磷菌剂在土壤解磷中的应用。
优选地，所述土壤中难溶性磷的含量为0.01％～20％，例如可以是0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、 12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的埋藏曲霉和/或如第四方面所述的生长促进剂在促进植物生长中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011对于浓度高达20％的难溶性磷源具有显著的解磷效果，可以有效提高有效磷的含量，增强土壤磷的利用率；
(2)本发明的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011能够促进作物增产，埋藏曲霉处理后的玉米作物，根系得到明显增强，具有显著的促进作物生长的作用；
(3)本发明的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011在制备解磷剂和生长促进剂方法具有广阔的应用前景。
附图说明
图1(A)为培养于CYA培养基的埋藏曲霉形态，图1(B)为培养于PDA 培养基的埋藏曲霉形态；
图2为显微镜下埋藏曲霉形态；
图3为一株埋藏曲霉三个重复在有机磷固体平板上对难溶性磷的溶解能力。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011的获取和形态学鉴定
(1)菌株获取
埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011分离自云南省文山州砚山县稼依镇(23°43′17.07″，104°02′5.77″)的花生种植地采集农业土壤中。
分离方法如下：
称取5g土壤，加入45mL无菌水后用涡旋震荡仪震荡5min，再梯度稀释为10-1～10-5，取10-3、10-4和10-5三个梯度的菌液进行平板涂布，涂布于有机磷固体培养基上，每个涂布进行三个重复，于28℃恒温培养箱中倒置培养4天， 4天后挑出有解磷圈的菌株，纯化，用甘油管保存，用于下一步复筛工作；
有机磷固体培养基的配方如下：葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、酵母浸粉0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、卵磷脂0.2g、磷酸钙1.0g、琼脂15g、水1L、pH＝7。
(2)菌株形态学鉴定
将分离的菌株接种于CYA培养基(磷酸氢二钾1.0g、硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、酵母膏粉5.0g、蔗糖30.0g、琼脂15.0g、水1L)中，25℃培养5天，形态如图1(A)所示，菌株呈圆形，直径为2.4cm，有白色丝绒状菌丝，中间突起，有放射性沟纹，无孢子产出，背面为白色至黄褐色。
将分离的菌株接种于PDA培养基(马铃薯浸粉5g/L、葡萄糖20g、琼脂 20g、氯霉素0.1g、水1L)中，25℃培养5天，形态如图1(B)所示，菌株呈圆形，直径为1.8cm，有白色丝绒状菌丝，中间突起，黄色孢子，背面为白色至褐色。
显微镜下观察菌株形态，如图2所示，菌株为近球形，菌丝有隔，分生孢子直径为3.60～4.79μm。
实施例2埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011的分子鉴定
菌株通过平板划线得到单菌落，挑取单菌落于含有2mL TSB的摇菌管中，置于28℃振荡培养至浑浊；取1mL菌液于离心管中，10000rpm离心3min后弃上清，加入50μL无菌水，振匀后于95℃保温处理2min，置于0℃冰箱中备用；
用牙签挑取少量菌丝至20μL裂解液中，95℃裂解30分钟；吸取2μL裂解产物至PCR体系中，PCR体系包括12.5μL预混液TaqMaster Mix、10μL ddH2O、0.7μL ITS4(SEQ ID NO:2)、0.7μL ITS5(SEQ ID NO:3)、0.6μL DMSO，进行PCR扩增；
取5μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳45 min，在紫外灯下检测扩增结果；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒回收DNA片段；
将回收的片段进行测序，测序结果在GenBank中通过BLAST比对该菌的 ITS序列片段SEQ ID NO:1(共564bp)，结果显示其与埋藏曲霉Aspergillus sepultus的相似度(maxidentity)为100％，比对序列覆盖范围(query cover)为 100％，E值为0，因此鉴定菌株为埋藏曲霉，鉴定结果可信。
SEQ ID NO:2：TCCTCCGCTTATTGATATGC；
SEQ ID NO:3：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG。
实施例3菌株保藏
基于实施例1～2的形态观察和分子鉴定结果，菌株MN114011属于埋藏曲霉(Aspergillus sepultus)，将埋藏曲霉Aspergillus sp.MN114011于2019年5 月14日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编510070，保藏编号为GDMCC 60666。
实施例4埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011的解磷实验
(1)固体平板检测
将埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011接种于不同的含磷量为 0.01％～20％的有机磷固体平板上，共接种三个重复，同时设置黑曲霉对照组，于28℃恒温培养箱中倒置培养5天，5天后观察解磷圈，记录解磷圈的直径(D) 和菌落的直径(d)，计算D/d值，检测菌株在固体培养基中的菌落直径及对固体平板难溶性磷的溶解能力，若D/d的比值越大，则表明解磷能力越强。结果如表1和图3所示，MN114011能使平板产生较大的解磷圈，解磷圈与菌落直径之比大于1.2，说明菌株有较强的解磷能力，同时和黑曲霉的解磷能力相近。
表1 MN114011对有机磷培养基的解磷效果
Figure RE-GDA0002493315480000091
(2)液体培养基检测
将埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011接种于装有100mL NBRIP液体培养基(葡萄糖10g/L、Ca3(PO4)2 2.5g/L、AlPO4 1g/L、FePO4 1.5g/L、MgCl2 5g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KCl 0.2g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母膏0.5g/L) 的250mL锥形瓶上，共接种三个重复，以黑曲霉作为对照，以未接种任何菌株的NBRIP作为阴性对照(CK)，在28℃下200rpm震荡培养5天；用钼锑抗比色法进行比色；在室温(25℃)下放置30分钟后，用分光光度计在700nm 波长处进行比色，测定液体培养基中有效磷的含量。
结果如表2所示，在培养5天后培养MN114011的NBRIP培养基中的有效磷含量是黑曲霉的一倍，是无菌的空白对照的4倍，故解磷效果较好。
表2 MN114011在NBRIP中的解磷效果
Figure RE-GDA0002493315480000101
实施例5盆栽实验
将活化好的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011接种于无菌大米上进行发酵培养，在25℃下培养10天，用0.1％Tween 80溶液冲洗曲霉孢子，将菌数稀释至109CFU/mL；将孢子悬浮液与噻虫嗪(诺普信农化)混合，再将带有曲霉MN110411的种衣剂与玉米种子以1:80的比例混合包衣，使种子上含有 1×104～1×108CFU/seed的菌数；
将黄土与黑土按照10:1的比例混合后灭菌(121℃灭菌1小时，加0.15％磷酸三钙)；以有曲霉MN114011的种子为实验组，以无菌有噻虫嗪的种子为空白对照(Blank)，以无菌无包衣的种子为阴性对照(CK)，以有青霉MN17177 的种子为阳性对照，以有黑曲霉的种子作为对比例，每个处理54个重复进行盆栽实验，常规管理；生长20天后收获盆栽，测定单个植株株高、根重和干重。
结果如表3所示，实验组的玉米生物量与MN17177阳性对照相当，高于对阴性对照组、空白对照组和黑曲霉组；实验组的根系较阴性对照(CK)增加了 15.7％，较空白对照(Blank)增加了12％，较黑曲霉组增加了4.4％，说明埋藏曲霉Aspergillus sepultusMN114011具有显著的促进作物生长的作用。(说明：表3中a、b、c表示处理组间是否有显著差异，字母相同表示没有差异。)
表3 MN114011和噻虫嗪混合后包衣于玉米对玉米苗期生物量的影响
组别 株高(cm) 鲜全重(g) 干根重(g) 干全重(g)
MN114011 32.44±0.37ab 2.13±0.07ab 1.40±0.05a 3.61±0.09ab
空白对照 30.77±0.25c 2.10±0.05ab 1.25±0.02b 3.25±0.02b
MN17177 32.78±0.43a 2.34±0.10a 1.40±0.02a 3.74±0.15a
阴性对照 31.51±0.06bc 2.03±0.09b 1.21±0.04b 3.27±0.13b
黑曲霉 32.01±0.26ab 2.15±0.09b 1.34±0.04a 3.36±0.06b
综上所述，本发明的埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011对于浓度高达20％的难溶性磷源具有显著的解磷效果，可以有效提高有效磷的含量，增强土壤磷的利用率；所述埋藏曲霉Aspergillus sepultus MN114011能够促进作物增产，埋藏曲霉处理后的玉米作物，根系得到明显增强，具有显著的促进作物生长的作用在制备解磷剂和生长促进剂方法具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种埋藏曲霉及其应用
<130> 20191202
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> 生物来源
<400> 1
ggaagatcat taccgagtga ggacctaacc ggtccaacct cccacccgtg tctatcgtac 60
cttgttgctt cggcgggccc gccattcgtg gccgccgggg ggcatctcgc ccccgggccc 120
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (10)

1.一种埋藏曲霉，其特征在于，所述埋藏曲霉命名为Aspergillus sp.MN114011，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60666，保藏日期为2019年5月14日。
2.根据权利要求1所述的埋藏曲霉，其特征在于，所述埋藏曲霉的ITS序列如SEQ IDNO:1所示。
3.一种解磷菌剂，其特征在于，所述解磷菌剂包括如权利要求1或2所述的埋藏曲霉；
优选地，所述埋藏曲霉的浓度为(1.0～2.0)×109CFU/mL；
优选地，所述解磷菌剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种如权利要求3所述的解磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将埋藏曲霉接种于LB培养基中，振荡培养得到种子液；
(2)吸取种子液接种到发酵培养基中，发酵培养；
(3)将发酵液过滤，得到所述解磷菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述振荡培养的温度为25～35℃；
优选地，步骤(1)所述振荡培养的速度为120～200r/min；
优选地，步骤(1)所述振荡培养的时间为20～25h；
优选地，步骤(2)所述发酵培养基的pH为6.5～7.5；
优选地，步骤(2)所述发酵培养的温度为25～35℃；
优选地，步骤(2)所述发酵培养的时间为20～25h；
优选地，步骤(3)所述过滤采用0.22μm细菌过滤器进行。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将埋藏曲霉接种于LB培养基中，在25～35℃下以120～200r/min的速度振荡培养20～25h，得到种子液；
(2)吸取种子液接种到pH为6.5～7.5的发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养20～25h；
(3)将发酵液采用0.22μm细菌过滤器过滤，得到所述解磷菌剂。
7.一种生长促进剂，其特征在于，所述生长促进剂包括如权利要求1或2所述的埋藏曲霉；
优选地，所述埋藏曲霉的浓度为(1.0～2.0)×109CFU/mL；
优选地，所述生长促进剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种如权利要求1或2所述的埋藏曲霉和/或如权利要求3所述的解磷菌剂在土壤解磷中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述土壤中难溶性磷的含量为0.01％～20％。
10.一种如权利要求1或2所述的埋藏曲霉和/或如权利要求7所述的生长促进剂在促进植物生长中的应用。
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