CN107779407A - 棘孢曲霉p93及由其制备的生物肥料制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了棘孢曲霉P93及由其制备的生物肥料制剂与应用。棘孢曲霉P93保藏号为CGMCC NO.14150。由棘孢曲霉P93制备的菌剂对于作物促生增产和活化土壤磷效果明显。菌剂P93能够溶解多种难溶磷，液体培养基中高效溶解磷矿粉、磷酸铁、磷酸锌和磷酸三钙，溶解率达12.1～94.2％；土壤条件下，使用5种难溶磷源后接种菌剂P93，土壤有效磷提高257.8～1004.6％；接种菌剂P93促进玉米吸磷，玉米植株全磷增加3.4～136.4％；溶磷能力超过目前报道的国际公认的溶磷拜莱青霉菌(ATCC 20851)。该菌剂对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

棘孢曲霉P93及由其制备的生物肥料制剂与应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂领域，具体地说，涉及棘孢曲霉P93及由其制备的生物肥料制剂与应用。

背景技术

磷素是植物生长必需的仅次于氮的大量元素，因土壤的固定作用其有效性很低，难以满足作物生长需要(Wild,1988)。研究表明，施入土壤的磷肥有90％以上转化为难溶磷，酸性土壤转化为磷酸铁、磷酸铝，石灰性土壤转化为磷酸钙(Hagin and Hadas,1962；Nagelschmidt G,et al.1994)。为提高作物产量，磷肥用量剧增，磷矿资源面临耗竭危机。据估算，全世界磷矿石可以使用60-90年(Runge-Metzger A.1995)。我国90％以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。然而，我国磷矿资源缺乏，而且中低品位居多，使用年限仅为20年(陶俊法,2009)。因此，提高磷肥利用效率，挖掘土壤磷素利用潜力，延长磷矿资源的使用寿命，对我国乃至世界各国农业可持续发展具有重要意义(Mendes et al.,2013；Kanse et al.,2014)。

溶磷微生物通过产生有机酸(Mendes et al.,2014；Li et al.,2015)，分泌H⁺质子(Illmer and Schinner,1995；Bagyaraj et al.2000)将难溶磷转化为有效磷，同时依靠产生植物促生物质(Hussein and Joo,2015)，从而在磷素的生物有效性和作物增产中起到重要作用。近百年来，溶磷微生物研究一直受到科学家的高度重视，期望通过接种溶磷微生物制剂提高土壤难溶磷的有效性和磷肥利用效率(Zaidi et al.,2009；Merbach et al.,2010)。由于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力和接种效果差异悬殊，因此，高效溶磷菌株的筛选显得尤为重要。

目前，溶磷微生物已经作为活化土壤难溶磷，提高磷矿石的生物有效性和作物产量的有效措施广泛使用(Mittal et al.,2008；Shi et al.,2014)。研究显示，无论在固体培养基平板还是液体培养条件下，溶磷真菌的效果高于溶磷细菌(Kucey et al.,1983；Khan et al.,2010)。溶磷微生物具有增加土壤有效磷(Kucey et al.,1989；Shi et al.,2014；Yin et al.,2015)，促进磷素吸收和减少磷肥用量(Singh and Reddy,2011；Nakayanet al.,2013)，促进磷矿石的生物有效性(Kucey and Leggett,1989；El-Tarabily et al,2008；KAUR and REDDY,2015)，以及促进作物生长和提高作物产量的作用(Chuang et al.,2006；Mittal et al.,2008；Ghosh et al.,2015)。已有报道表明，溶磷微生物及其生物有机肥在溶解难溶磷、减少磷肥投入和提高作物产量方面潜力巨大。因此，在溶磷微生物筛选和应用潜力研究过程中，应注重选择既有较高溶磷能力，又能提高作物产量的高效菌株。

我国政府高度重视化肥减量高效问题，要求逐步做到化肥零增长。磷肥的过量使用导致江河湖泊的富营养化，需要降低磷肥使用量、提高磷肥利用率，减少环境进入水体的有效磷数量。为了达到磷肥零增长的目标，溶磷微生物无疑成为了首选的环境友好型的技术措施。

发明内容

本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降的问题，提供一种广泛适应性的高效溶磷促生菌--棘孢曲霉P93、由其制备的微生物菌剂、生物肥料制剂及其应用。

为了实现本发明目的，发明人从我国河北省石家庄市农田土壤(石灰性土壤)中筛选到一株具有较强溶解土壤难溶磷能力的真菌P93，经鉴定为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)。棘孢曲霉P93现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.14150，保藏日期2017年8月24日。

菌株P93的菌学特征如下：

在CA固体培养基平板以及CYA平板上的形态观察：

菌株P93生长迅速，菌落前期呈白色絮状，后变成褐色直到黑色，粉末状，背面为无色；分生孢子头的顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，黑色，顶端有链形孢子。孢子直径约2.5-4.3μm。

菌株P93的ITS rRNA基因测序结果如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供含有所述棘孢曲霉P93的微生物菌剂。

本发明所述菌剂中还含有添加剂和保护剂。

其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的至少一种。

所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的至少一种。

本发明提供的菌剂由如下重量份的组分组成：

棘孢曲霉P93发酵液 1份

添加剂 0.5-3份

保护剂 0.01-0.05份

所述菌剂中棘孢曲霉P93活菌数为1×10⁸～2×10⁸cfu/g。

在本发明的一个具体实施方式中，所述添加剂为轻质碳酸钙，所述保护剂为海藻酸钠，菌剂中棘孢曲霉P93活菌数为1×10⁸cfu/g。

本发明还提供由所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂制备的复合微生物菌剂。

本发明还提供由所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂，或所述复合微生物菌剂制备的土壤磷素活化剂。

本发明还提供由所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂，或所述复合微生物菌剂，或所述土壤磷素活化剂制备的生物肥料制剂。优选地，所述生物肥料制剂中还含有灭菌的有机物料和粘结剂。

本发明还提供所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂，或所述复合微生物菌剂，或所述土壤磷素活化剂，或所述生物肥料制剂在制备农用复混肥中的应用。

本发明还提供一种有机无机复混肥，由所述菌剂或所述复合微生物菌剂与有机肥料、氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。

本发明还提供所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂，或所述复合微生物菌剂，或所述土壤磷素活化剂，或所述生物肥料制剂，或所述复混肥在土壤难溶磷的活化，提高磷肥利用率，增加磷矿粉生物有效性和节约磷肥资源中的应用。

本发明进一步提供所述棘孢曲霉P93，或所述菌剂，或所述复合微生物菌剂，或所述土壤磷素活化剂，或所述生物肥料制剂，或所述复混肥在提高土壤中磷素利用率以及提高作物产量中的应用。

前述的应用，将所述菌剂或所述复合微生物菌剂进行拌种，或作为基肥，或用作追肥施用于作物生长区域。

所述作物包括大棚蔬菜。优选地，所述作物包括玉米、花生、向日葵等。

本发明提供的有效成分为棘孢曲霉P93的微生物菌剂对于田间作物促生增产和活化土壤磷效果明显，能够高效溶解磷矿粉、磷酸铁、磷酸锌和磷酸三钙，溶磷种类多，溶解率达到12.1-94.2％，溶磷能力超过目前报道的国际公认的溶磷拜莱青霉菌(ATCC 20851)。盆栽接种P93菌剂，玉米鲜重提高2.38-25.96％，干重提高5.42-25.25％；花生生物量增加140.8％，向日葵生物量增加25.3％。5种难溶磷使用条件下，接种P93菌剂的土壤有效磷比对照增加16.35-73.54％；磷酸铁、磷酸锌和磷酸三钙处理的植株全磷提高61.9-136.4％。在潮土条件下使用P93菌剂，玉米产量比对照提高15.6％。对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

本发明提供的有效成分为棘孢曲霉P93的微生物菌剂对于田间花生、向日葵的促生增产效果明显，且其作用效果不受田间土壤条件、化肥使用的抑制，可以在轻度盐碱农田中，与化肥一起施用。盆栽接种P93菌剂，花生生物量增加140.8％，向日葵生物量增加25.3％，田间玉米增产15.6％。

附图说明

图1为本发明实施例2中棘孢曲霉P93菌株平板溶磷的效果；其中，A、B分别表示Y棘孢曲霉P93的PDA培养基平板的正面和反面。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1棘孢曲霉P93菌剂的制备

1.棘孢曲霉P93的分离及纯化

从河北省石家庄市农田土壤(石灰性土壤)中分离并纯化获得一株高效溶解难溶磷的菌株P93。

根据菌株P93的菌学特征及ITS rRNA基因测序结果，确定菌株P93为棘孢曲霉。

2.棘孢曲霉菌P93的培养

(1)培养基的组成(kg/t发酵液)

可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH₄)₂SO₄ 3kg，K₂HPO₄ 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO₄·7H₂O 0.1kg，CaCO₃ 0.5kg，FeSO₄0.001kg，硼酸(1％)1L，pH7.0，以水配制。

(2)发酵培养过程

将棘孢曲霉菌P93接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25-28℃培养3d。将棘孢曲霉菌P93转接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1％接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.0vvm下，培养3d。

3.棘孢曲霉菌P93菌剂的制备

向发酵液中加入保护剂海藻酸钠，棘孢曲霉菌P93以轻质碳酸钙吸附。

4.棘孢曲霉菌P93菌剂造粒

向以上吸附、混合好的菌剂中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要造粒形成适合向日葵的颗粒菌剂(活菌数为1×10⁸cfu/g)，与向日葵种子播种机一起施入土壤；或者利用造粒机形成与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥粒径近似的颗粒生物肥料，其生物肥料与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥一起机械施入土壤。

实施例2菌株P93固体平板试验溶磷效果

为了明确棘孢曲霉菌P93的溶解难溶磷的能力，本实施例中使用了磷酸三钙Ca₃(PO₄)₂为磷源，28℃培养5天，测定PDA平板上的有效磷。试验以拜莱青霉菌ATCC 20851、草酸青霉菌P8(CGMCC 2272)为对照菌株，并设有不接种对照试验。

结果显示，P93真菌溶解磷酸三钙能力最强，溶磷高达48.16mg磷/平板，比菌株ATCC 20851的溶磷量(21.05mg磷/平板)增加128.8％(表1)；菌株P93溶磷量略低于草酸青霉菌P8的溶磷量48.76mg磷/平板。棘孢曲霉菌P93在无机磷培养基(磷酸三钙为磷源)上形成的菌落见图1(A和B)。

表1不同溶磷菌株在PDA固体平板上的溶磷效果

注：a、b表示各处理之间差异显著。

实施例3溶磷菌株P93在液体培养基中溶解难溶磷的效果

在液体培养基中于20℃，17rpm的培养条件下，培养5d后，测定了溶磷真菌P93对于磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁、磷酸锌、磷矿粉的溶解效果。结果显示，棘孢曲霉菌P93菌株从磷酸三钙中释放的有效磷最高，达934.89μg磷/mL，占加入总磷量的94.2％；菌株P93溶解磷酸铝的能力较强，有效磷为494.73μg磷/mL，分别占加入总磷量的39.0％；菌株P93溶解磷酸铁的能力较强，释放的有效磷也达到344.6μg磷/mL，占加入难溶磷的33.6％；菌株P93溶解硫酸锌的能力较强，有效磷达到了194.93μg磷/mL，占加入磷量的24.3％；棘孢曲霉菌P93从云南磷矿粉溶解出的有效磷达到88.17μg磷/mL，占加入磷矿粉含磷量的12.1％。磷酸铝是一种比较难溶解的磷源，目前国内外报道的高效溶解磷酸铝的菌株较少，而P93表现了对其较强的溶解效果(表2)。

表2棘孢曲霉菌P93对4种难溶磷的溶解效果

注：a、b、c、d、e表示各处理之间差异显著。

实施例4盆栽条件下溶磷菌对土壤有效磷的影响

在施用5种磷源后，接种P93菌剂的土壤有效磷显著增加，比对照分别增加了19.98mg/kg(磷酸钙)、60.24mg/kg(磷酸锌)、73.54mg/kg(磷酸铁)、18.64mg/kg(矾山磷矿粉，FRP)和16.35mg/kg(昆阳磷矿粉，KRP)。菌剂P93作用于5种磷源的效果不同，矾山和昆阳磷矿粉接种菌剂P93处理的土壤中有效磷增加幅度较小，磷酸铁、磷酸锌接种菌剂P93处理的土壤有效磷增加较多(表3)。

表3不同磷源供应下P93菌剂对玉米盆栽土壤有效磷含量的影响

注：AFRP：矾山磷矿粉；KRP：昆阳磷矿粉；a、b表示各处理间差异显著(P<0.05)。

实施例5盆栽条件下溶磷菌P93对玉米生长的影响

与对照相比，施用菌剂对不同磷源处理土壤中玉米生物量影响显著(表4)。以磷酸钙为磷源时，使用菌剂P93能够显著增加玉米生物量，鲜重增加量分别为34.99g/盆，干重增加量2.66g/盆。以磷酸锌为磷源时，玉米鲜重增加量为4.79g/盆，干重增加量为0.71-g/盆；以磷酸铁为磷源时，玉米鲜重增加量为21.29g/盆，干重增加1.85-3g/盆；以矾山磷矿为磷源时，玉米鲜重增加量为2.01g/盆，干重增加量为0.46g/盆；以昆阳磷矿为磷源时，玉米鲜重增加量为731.9g/盆，干重增加量为2.49g/盆。菌剂P93土壤中对玉米促生效果最适磷源顺序为：磷酸钙>磷酸锌>昆阳磷矿粉>磷酸铁>矾山磷矿粉，以生物量干重增加高低排序则为Ca-P>KRP>Fe-P>Zn-P>FRP。

表4不同磷源供应下菌剂对玉米生物量促进生长的作用

注：FRP：矾山磷矿粉；KRP：昆阳磷矿粉；a、b表示各处理间差异显著(P<0.05)。

实施例6盆栽条件下溶磷菌对植株全磷的影响

在施用5种难溶磷源的土壤中，接种P93菌剂处理的玉米植物全磷含量比对照显著增加(表5)。磷酸钙供应条件下，接种P93处理的植株全磷含量0.65％，比对照增加66.7％；磷酸锌处理土壤中，植株全磷含量较高，达到0.56％，增加幅度最大，比对照提高136.4％；磷酸铁处理土壤植株全磷含量为0.54％，比对照提高61.9％；矾山磷矿粉(FRP)处理对植株全磷影响较小，比对照提高3.4％。

表5不同磷源处理下菌剂对玉米植株全磷的作用

注：FRP：矾山磷矿粉；KRP：昆阳磷矿粉；a、b表示各处理间差异显著(P<0.05)。

实施例7氮磷钾化肥条件下P93对花生、向日葵生物量的影响

试验在盆栽条件下进行，氮肥使用量为纯氮100mg/kg土壤,纯P₂O₅ 65mg/kg土壤，纯K₂O为50mg/kg土壤。氮肥使用化学试剂硫酸铵，磷肥使用化学试剂NaH₂PO₄，钾肥使用化学试剂氯化钾。将菌株P93、ATCC 20851制备成生物肥料菌剂，使用量为5g/盆，菌剂与土壤混合均匀，ATCC 20851作为对照菌株。棘孢曲霉菌P93生物肥料增加生物量作用显著，花生、向日葵生物量鲜重比对照分别提高140.8％和25.3％，比对照菌株ATCC 20851菌剂分别提高12.42％和11.49％。接种对照菌株ATCC 20851生物肥料菌剂显著增加花生、向日葵生物量。显示溶磷菌A93生物肥料促进作物生长效果显著(表6)。

表6 P93菌剂对盆栽花生、向日葵生物量的影响

注：a、b、c表示各处理之间差异显著。

实施例8溶磷生物肥料对田间玉米的增产作用

在北京海淀区西二旗玉米地进行了溶磷菌肥试验，小区试验地面积为6×4m，将其划分为2×0.75m的小区，每个小区接种菌剂300g，溶磷菌剂与表层约15cm厚的土壤混合均匀后培垄(200cm×20cm×20cm)，每垄种植玉米10棵。玉米收获后，晾干、籽粒和植株称重量，测植株全磷含量。在分别施入P93、ATCC 20851种菌剂后，玉米产量显著增加(表7)。菌剂P93对玉米的增产效果最好，增产1.22t/hm²，显著高于对照菌株ATCC 20851相比，菌剂P93、ATCC 20851菌剂比对照分别增产15.6％和13.7％。接种菌剂P93处理显著增加了玉米秸秆产量，比对照提高25.31％；ATCC 20851菌剂秸秆产量比对照分别增产6.35％。表明P93菌剂能够显著提高玉米籽粒产量和秸秆产量(P<0.05)。

表7田间条件下P93溶磷菌剂对玉米的增产作用

注：a、b、c表示各处理之间差异显著。

本发明对广泛适应性的高效溶磷促生的棘孢曲霉P93及其生物有机肥进行了多方面研究，施用本发明的溶磷生物肥料菌剂，能够高效活化土壤磷素，增加土壤有效磷水平，增强磷矿粉的生物有效性，提高作物吸磷量，作物增产显著，达到了溶磷增产的效果，具有良好的农业生产应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 棘孢曲霉P93及由其制备的生物肥料制剂与应用

<130> KHP171111119.3TQ

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 1

gggcctgcgg aaggatcatt accgagtgct gggtccttcg gggcccaacc tcccacccgt 60

gcttaccgta ccctgttgct tcggcgggcc cgccttcggg cggcccgggg cctgcccccg 120

ggaccgcgcc cgccggagac cccaatggaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagttga 180

ttgataccaa tcagttaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga 240

acgcagcgaa atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg 300

aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt catttctccc 360

ctccagcccc gctggttgtt gggccgcgcc cccccggggg cgggcctcga gagaaacggc 420

ggcaccgtcc ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcaccc gctctatggg cccggccggg 480

gcttgcctcg acccccaatc ttctcagatt gacctcggat cagtagtatg atgacccgct 540

gaacttaagc atatcaaaaa cccagaggaa 570

Claims (10)

1.棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)P93，保藏号CGMCC NO.141 50。

2.含有权利要求1所述棘孢曲霉P93的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有添加剂和保护剂；

其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的至少一种；

所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的至少一种。

4.由权利要求1所述棘孢曲霉P93，或权利要求2或3所述菌剂制备的复合微生物菌剂。

5.由权利要求1所述棘孢曲霉P93，或权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4所述复合微生物菌剂制备的土壤磷素活化剂。

6.由权利要求1所述棘孢曲霉P93，或权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4所述复合微生物菌剂，或权利要求5所述土壤磷素活化剂制备的生物肥料制剂。

7.一种有机无机复混肥，其特征在于，由权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4所述复合微生物菌剂与有机肥料、氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。

8.权利要求1所述棘孢曲霉P93，或权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4所述复合微生物菌剂，或权利要求5所述土壤磷素活化剂，或权利要求6所述生物肥料制剂，或权利要求7所述复混肥在提高土壤中磷素利用率以及提高作物产量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4所述复合微生物菌剂进行拌种，或作为基肥，或用作追肥施用于作物生长区域。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述作物为大棚蔬菜，包括玉米、花生、向日葵。