一种高效溶磷植物促生菌剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域,具体地说,涉及一种高效溶磷植物促生菌剂及其应用。
背景技术
我国90%以上的耕地缺磷,使用磷肥是解决作物增产的主要措施,磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国,也是磷肥第一消费大国,每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知,我国磷矿资源缺乏,保有储量151.98亿吨,再过20年中高品位磷矿开采殆尽(李志宁,2003a,李志宁,2003b),不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示,我国磷肥当季利用率仅为3.22~18%(周晓芬,马民强,1994;张李康,1997;崔正忠等,2001;周广业等,1991;李云等,2002)。磷肥施入土壤后80~90%很快被土壤固定(范丙全等,1998,2004a),石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石(lschmidt&Nixon,1944;Murrmann&Peech,1968),而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝(Ford,1933)。我国自20世纪70年代使用磷肥以来,土壤磷积累显著(林葆,2009)。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在,释放缓慢,作物有效性低。随着辚肥用量增加,磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷(来路等,2003)与高稳定性有机磷(黄庆海等,2003)。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此,增强土壤磷有效性,提高磷肥增产效益,是我国农业可持续发展的必然之路。
溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施(Kucey,1988;Kamble&Mohite,1996;Morales等,2007;El-Gawad等,2009),倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用,对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、提高磷肥利用率、节约磷肥、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。
溶磷真菌(Salih等,1989;王延秋等,1993;Vassileva,1998;Asea等,1988;Abd-Alla&Omar,2001;程淑琴等,2003;Wakelin等,2007;Morales等,2007)和溶磷细菌(Rasal,等,2004;Raychaudhuri,等,2003;Orhan,等,2006;)都具有显著增加土壤有效磷、提高作物产量能力,以及节约磷肥的效果(El-Lateef,1998;Suri,等,2006)。同时,溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等,1994;Tomar等,1996;Kamble&Mohite,1996;范丙全等,2004a),具有改善作物品质的能力(Hamed,2003;El-Gawad,2009),溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。
以往研究涉及面非常广,为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而,长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究,使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物,难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言,可能造成了巨大浪费,由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂,而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司,如加拿大PhilomBios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌(Penicilliumbilaii)(Kucey,1988,1989)生产微生物菌剂JumpStart。印度RuchiBiochemicals公司使用并生产一种溶磷微生物,推荐在全国使用。比利时生产一株溶磷细菌生产菌剂Phosphorene(Ahmed等,1999)。我国主要以巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatarium)生产溶磷微生物菌剂(葛诚,吴薇,1995;范丙全,2007)。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性,溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。
广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌种资源为世界范围内稀缺,且未见有关广适应性的溶磷微生物菌剂的报道。
发明内容
本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降的问题,提供一种广泛适应性的高效溶磷植物促生菌剂。
本发明所述的一种高效溶磷植物促生菌剂,包括黑曲霉菌C2菌剂、添加剂、粘结剂和保护剂;
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中包括曲霉菌(Aspergillusniger)C2,保藏号CGMCCNO.7511,保藏日期:2013年7月5日;所述黑曲霉菌C2分离自我国河北省衡水市农田土壤,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述黑曲霉菌C2具有如下微生物学特性:
C2菌落在无机磷培养基上生长较快,25℃5d直径达2.0-2.5cm,平坦,中央稍凸起,质地丝绒状;分生孢子结构大量,黄黑色至黑色,呈现放射状分布,背面无色或略带浅灰色;
PDA培养基上蔓延迅速,25℃7d直径8.0-8.5cm,初为白色,后变成黑色厚绒状,背面略带灰黄色,分生孢子头黑色呈放射状,分生孢子梗长短不一;
菌落在察氏琼脂上生长迅速,25℃7d直径9.00cm,平坦,中央稍凸起,质地丝绒状;分生孢子结构大量,黄黑色至黑色;分生孢子梗发生于基质,顶囊球形,全面可育;产孢结构双层;分生孢子球形,直径4~6μm,壁具明显尖疣或光滑。
所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的一种或多种;
所述的粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖;
所述的保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或多种。
本发明所述的高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
本发明所述的高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
本发明所述的高效溶磷植物促生菌剂在提高土壤磷、磷肥利用效率和作物产量中的应用。
本发明所述的应用,将高效溶磷植物促生菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。
本发明所述的应用,其中所述作物为大豆、玉米或小麦。
本发明所述的应用,其中所述高效溶磷植物促生菌剂适宜的土壤包括黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、灰钙土、灰漠土。
本发明的有益效果:
本发明所述微生物菌剂对于植物的促生效果明显,且其作用效果不受化肥使用的抑制,可以在正常使用化肥条件下使用,对我国农业生产节约磷肥资源、粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
本发明针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累,磷肥利用率持续下降的现状,并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状,筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株,为开发高效溶磷微生物菌剂的提供技术支撑。
本发明以我国主要土壤为研究对象,进行了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选,获得了大量溶磷菌株,经过研究比较这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力、增产效果,获得了一株广泛适用于我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷的黑曲霉菌C2,特别适合我国南方、北方、西北、东北、西南等区域的典型土壤,为溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了菌种资源和技术支撑。
具体实施方式
实施例1黑曲霉菌C2的分离及培养
(1)黑曲霉菌C2培养基
发酵液配方(kg/t发酵液):磷酸氢二钾0.1,磷酸二氢钾0.1,氯化钠4.3,硫酸镁0.1,淀粉8.6,牛肉膏4.3,蛋白胨4.3,酵母粉4.3,蔗糖8.6,硫酸铵2.6,碳酸钙10,硫酸亚铁0.001,豆油6.8,以水配制。
(2)黑曲霉菌C2培养过程
将黑曲霉菌C2菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上,28~30℃培养48h,然后接入1000mL三角瓶,在30℃,220r/min下,培养36h;按5%接种量接入到50L种子罐中,在220r/min,pH7.5,通气量0.5vvm条件下,培养2d后,再按10v/v%接种量转到500L的发酵罐中,在200r/min,pH7.5,通气量0.7~1.0vvm条件下,培养3d;发酵完成后,以1::3~6倍的高岭土吸附,即得溶磷黑曲霉菌C2菌剂。
实施例2高效溶磷植物促生菌剂的制备
1.黑曲霉菌C2的培养
(1)培养基的组成(kg/t发酵液)
可溶性淀粉10kg,黄豆饼粉10kg,玉米粉5kg,葡萄糖1kg,蔗糖10kg,酵母粉5kg,(NH4)2SO43kg,K2HPO40.2kg,NaCl2.5kg,MgSO4·7H2O0.1kg,CaCO30.5kg,FeSO40.001kg,硼酸(1%)1L,pH7.0,以水配制。
(2)发酵培养过程
将黑曲霉菌C2接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上,25~28℃培养3d。将黑曲霉菌C2孢子转接入1000mL三角瓶,26-28℃,220r/min下液体发酵培养36h。然后按1%接种量接入50L种子罐,在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下,培养36h后,再按10v/v%接种量转入500L发酵罐,在220r/min,pH7.0,通气量0.7~1.0vvm下,培养3d。加入保护剂海藻酸钠,以1:3~6倍的二氧化硅吸附。
2.高效溶磷微生物菌剂的制备
分别对溶磷黑曲霉菌C2进行发酵,发酵后加入保护剂海藻酸钠,黑曲霉菌C2以二氧化硅吸附,活菌数为5×108-1×109cfu/g。
3.高效溶磷微生物菌剂造粒
向以上吸附、混合好的菌体中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒,根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂,用于与玉米、小麦、大豆、棉花种子的机械播种,或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。
实施例3
一种高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
实施例4
一种高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
实施例5
一种高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
实施例6
一种高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
实施例7
一种高效溶磷植物促生菌剂,由如下重量份的组分组成:
其中,所述黑曲霉菌C2菌剂中活菌数为5×108-1×109cfu/g。
实验例8黑曲霉菌C2溶解难溶磷的效果
1.采用溶磷黑曲霉菌C2,以巨大芽孢杆菌(ATCC14581)、拜莱青霉菌(ATCC20851)为对照。在室内条件下,以磷酸三钙为难溶磷,进行了平板固体培养基培养5天,测定了其溶磷能力。
黑曲霉菌C2的溶磷圈与菌落直径比值达到了3.10,溶磷圈内溶解的水溶性溶(P2O5)为15.98mg;菌株ATCC20851和ATCC14581的溶磷圈与与菌落直径比值分别为1.06和1.30,溶磷圈内的溶磷量(P2O5)分别为6.31和2.11mg,都低于菌株黑曲霉菌C2(表1)。
表1溶磷菌株在含Ca3(PO4)2培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)
注:a、b、c表示处理组之间差异显著,ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
2.在液体培养条件下,进行了菌株草黑曲霉菌C2、拜莱青霉菌(ATCC20851)和巨大芽孢杆菌(ATCC14581)的溶磷试验。结果显示,草黑曲霉菌C2、ATCC20851和ATCC14581溶解磷酸三钙释放有效P2O5分别为818.71、159.7和37.2mg/L,溶磷率分别为36.55%、12.51%和6.82%。
黑曲霉菌C2、ATCC20851和ATCC14581溶解磷矿粉释放有效P2O5分别为907.8、171.4和24.2mg/L,溶磷率分别为20.2%、3.8%和0.54%。
表2液体摇瓶体条件下(5d)溶磷菌对磷酸三钙、磷矿粉溶解效果(10.0g/L)
注:a、b、c表示处理组之间差异显著,ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
实验例9溶磷黑曲霉菌C2作用下磷酸三钙、磷矿粉对玉米生长的影响
在温室盆栽试验,溶磷菌株选用黑曲霉菌C2,以ATCC14581为对照,使用剂量为5ml/盆,菌体数量为3×108/mL。栽培基质为蛭石(500g//盆),磷源为晋宁磷矿石和磷酸三钙,试验作物为玉米,播种时间为2012年11月1日,生长期为50天。
结果表明,黑曲霉菌C2显著提高玉米生物量。供应磷酸三钙条件下,黑曲霉菌C2的玉米生物量为1.05g/盆,比对照增产34.61%;供应磷矿粉条件下,黑曲霉菌C2的玉米生物量为0.48g/盆,比对照增产41.2%(表3)。
表3溶磷菌C2作用下磷酸三钙、磷矿粉对玉米生长的影响(干重g/盆)
注:a、b、c表示处理组之间差异显著,ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
实验例10溶磷黑曲霉菌C2在不同土壤上对玉米的溶磷促生效果
采用五种土壤分别为黑土、黑钙土、白浆土、潮土、褐土,作物为玉米。试验包括两个处理:(1)对照(CK)不使用菌剂;(2)溶磷菌剂处理,每公斤土壤使用5g溶磷黑曲霉菌C2菌剂(活菌数为3×108cfu/g),每个处理重复3次。每盆装土(不灭菌)1kg,所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料,使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀,播种5粒发芽一致的玉米种子。第一次浇水250mL/盆,以后保持60-70%的田间持水量,出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获,测定植株生物量。
试验结果显示,使用氮磷钾化学肥料条件下,溶磷黑曲霉菌C2菌剂仍表现显著的增产效果(表4)。褐土、潮土、白浆土、黑土和黑钙土上玉米鲜重分别增加34.0%、33.6%、24.4%、21.5%和11.1%;褐土、潮土、白浆土、黑土、黑钙土干重生物量分别增加22.2%、30.0%、32.6%、12.8%和29.9%。
溶磷菌剂适合潮土与玉米作物的配合使用,增产效果高于土壤类型与玉米配合。溶磷黑曲霉菌C2菌剂的作用效果不受化肥使用的抑制,溶磷黑曲霉菌C2菌剂可以在正常使用化肥条件下使用。
表4不同土壤条件下溶磷黑曲霉菌C2菌剂对玉米生物量的作用效果
注:<0.05表示处理间差异显著性达5%标准,<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
实验例11溶磷黑曲霉菌C2在不同土壤上对冬小麦的溶磷促生效果
试验土壤为潮土和褐土,作物为小麦;试验包括两个处理:(1)对照(CK)不使用菌剂;(2)溶磷菌剂处理,每公斤土壤使用5g溶磷黑曲霉菌C2菌剂(活菌数为3×108cfu/g),每个处理重复3次。每盆装土1kg,所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料,使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀,播种8粒发芽一致的小麦种子。第一次浇水250mL/盆,以后保持60-70%的田间持水量,出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获,测定植株生物量。
试验结果显示,在施用化肥条件下,潮土和褐土使用溶磷黑曲霉菌C2菌剂能够显著提高小麦的生物量(表5)。潮土、褐土使用溶磷菌剂黑曲霉菌C2,小麦鲜重分别比对照32.1%和22.9%,干重增分别增加33.4%和14.0%,潮土接种溶磷黑曲霉菌C2菌剂增产效果高于褐土。溶磷黑曲霉菌C2菌剂在潮土和褐土上都能够增加小麦生物量,使用化学肥料不影响其增产作用效果。因此,溶磷黑曲霉菌C2菌剂适合在正常使用化肥条件下使用。
表5不同土壤条件下溶磷黑曲霉菌C2菌剂对小麦生物量的作用效果
注:<0.05表示处理间差异显著性达5%标准,<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
实验例12溶磷黑曲霉菌C2在不同土壤上对大豆的溶磷促生效果
试验土壤为黑土和褐土,作物为大豆。试验包括两个处理:(1)对照(CK)不使用菌剂;(2)溶磷菌剂处理,每公斤土壤使用5g溶磷菌剂黑曲霉菌C2(活菌数为3×108cfu/g),每个处理重复3次。每盆装土1kg,所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料,使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀,播种6粒发芽一致的大豆种子。第一次浇水250mL/盆,以后保持60-70%的田间持水量,出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获。测定植株生物量。
试验结果显示,在施用化肥条件下,使用溶磷菌剂黑曲霉菌C2在褐土、黑土2种土壤上都能够提高大豆作物的生物量。黑土上使用溶磷菌剂黑曲霉菌C2的大豆生物量干重最高,大豆干重比对照增加52.2%;褐土接种溶磷菌剂黑曲霉菌C2增产较少,大豆干重增加为31.5%。溶磷菌剂黑曲霉菌C2在黑土-大豆作物上使用可以获得更高的产量,使用化学肥料不影响溶磷菌剂的作用效果。
表6不同土壤条件下溶磷微生物菌剂对大豆生物量的作用效果
注:<0.05表示处理间差异显著性达5%标准,<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
实验例13使用化学肥料条件下黑曲霉菌C2的增产效果
采用我国9种典型土壤、4种主要栽培作物,土壤盆栽条件下进行了溶磷微生物黑曲霉菌C2的溶磷促生效果研究。试验包括两个处理:(1)对照(CK)不使用菌剂;(2)溶磷菌剂处理,每公斤土壤使用5g溶磷黑曲霉菌C2菌剂(3×108cfu/g),每个处理重复3次。每盆装土1kg,所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料,N、P2O5、K2O用量分别为60mg/kg土壤、55mg/kg土壤、50mg/kg土壤,生长40天收获。
作物生物量鲜重数据显示,使用溶磷黑曲霉菌C2菌剂,在我国9种主要土壤、4种主要作物上都表现增产作用,生物量增产幅度为11.5-76.6%,平均提高39.7%。灰钙土上玉米增产76.6%、黑钙土上玉米增产63.0%、水稻土上油菜增产53.6%、盐潮土上油菜增产48.8%、潮土上玉米增产47.8%、沙姜黑土上小麦增产45.5%、黑土上大豆增产27.7%、白浆土上玉米增产23.8%、潮土上小麦增产19.7%、褐土上玉米增产18.3%以及黑土上玉米增产11.5%。
作物生物量干重数据显示,使用溶磷黑曲霉菌C2菌剂,所有9中土壤和4种作物都能够增产,生物量增产幅度为4.3-91.8%,平均提高32.7%。水稻土上油菜增产91.8%、黑土上大豆增产53.5%、黑钙土上玉米增产46.1%、潮土上玉米增产39.1%、灰钙土上玉米增产32.2%、沙姜黑土上小麦增产29.9%、黑土上玉米增产17.6%、白浆土上玉米增产15.6%、潮土上小麦增产16.4%、盐潮土上油菜增产12.7%、褐土上玉米增产4.3%。
接种溶磷黑曲霉菌C2菌剂,土壤类型与作物存在最佳适配特性,对菌剂反应表现显著差异。油菜与水稻土配合增产最高,黑土与玉米配合增产最好,潮土、灰钙土与玉米配合增产较高,沙姜黑土与小麦增产较高。其他土壤与作物增产幅度较小。
表7溶磷黑曲霉菌C2在不同土壤条件下对作物的生物量的影响(g/盆)
注:<0.05表示处理间差异显著性达5%标准,<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
实验例14溶磷黑曲霉菌C2菌剂田间施用对玉米的增产作用
田间试验条件下使用溶磷菌剂黑曲霉菌C2,显著提高春玉米产量。石家庄褐土试验结果显示,与不使用菌剂的对照相比,使用菌剂黑曲霉菌C2每亩增加玉米81.67kg/亩,增产15.17%(表8)。
表8溶磷菌株黑曲霉菌C2田间使用对春玉米的增产效果(石家庄、石灰型褐土)
注:<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
保定市田间条件下褐土试验结果显示,使用溶磷菌剂黑曲霉菌C2,显著提高夏玉米产量。与不使用菌剂的对照相比,菌剂黑曲霉菌C2每亩增加玉米51.9kg/亩,增产10.2%(表9)。
表9溶磷菌株黑曲霉菌C2田间使用对夏玉米的增产效果
注:<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。
本发明将广泛适应性的高效溶磷增产黑曲霉菌C2极其菌剂进行了多方面研究,施用本发明的溶磷菌剂,能够高效利用土壤磷素和提高磷肥利用率,同时达到了溶磷增产的效果,具有良好的农业生产应用价值。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。