CN105420116B - 高效溶磷促生菌、由其制备的生物有机肥及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明从我国北方石灰性土壤中筛选到一株高效溶磷促生菌‑‑黑曲霉A44，并提供由菌株A44制备的微生物菌剂和生物有机肥。本发明的菌株能够高效溶解磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝、磷酸锌和磷酸三钙，溶磷种类多，溶磷能力强，超过目前报道的国际公认的溶磷拜莱青霉菌。本发明的A44微生物菌剂，可与灭菌的腐熟畜禽粪便肥料、秸秆腐熟物、粘结剂等复合形成生物有机肥。该菌剂及其生物有机肥显著促进作物生长，玉米生物量比对照增加80.9％；花生生物量增加20.51％～24.14％，向日葵生物量增加15.5％～32.3％；在中度盐碱农田使用，向日葵产量提高33.3％。且其促生增产效果不受使用化肥的影响，可以在正常使用化肥条件下施用。对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

高效溶磷促生菌、由其制备的生物有机肥及应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种高效溶磷促生菌、由其制备的生物有机肥及应用。
背景技术
磷素是植物生长必需的仅次于氮的大量元素，因土壤的固定作用其有效性很低，难以满足作物生长需要(Wild,1988)。研究表明，施入土壤的磷肥有90％以上转化为难溶磷，酸性土壤转化为磷酸铁、磷酸铝，石灰性土壤转化为磷酸钙(Hagin and Hadas,1962；Nagelschmidt G,et al.1994)。为提高作物产量，磷肥用量剧增，磷矿资源面临耗竭危机。据估算，全世界磷矿石可以使用60-90年(Runge-Metzger A.1995)。我国90％以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。然而，我国磷矿资源缺乏，而且中低品位居多，使用年限仅为20年(陶俊法,2009)。因此，提高磷肥利用效率，挖掘土壤磷素利用潜力，延长磷矿资源的使用寿命，对我国乃至世界各国农业可持续发展具有重要意义(Mendes et al.,2013；Kanse et al.,2014)。
溶磷微生物通过产生有机酸(Mendes et al.,2014；Li et al.,2015)，分泌H+质子(Illmer and Schinner,1995；Bagyaraj et al.2000)将难溶磷转化为有效磷，同时依靠产生植物促生物质(Hussein and Joo,2015)，从而在磷素的生物有效性和作物增产中起到重要作用。近百年来，溶磷微生物研究一直受到科学家的高度重视，期望通过接种溶磷微生物制剂提高土壤难溶磷的有效性和磷肥利用效率(Zaidi et al.,2009；Merbach et al.,2010)。由于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力和接种效果差异悬殊，因此，高效溶磷菌株的筛选显得尤为重要。
目前，溶磷微生物已经作为活化土壤难溶磷，提高磷矿石的生物有效性和作物产量的有效措施广泛使用(Mittal et al.,2008；Shi et al.,2014)。研究显示，无论在固体培养基平板还是液体培养条件下，溶磷真菌的效果高于溶磷细菌(Kucey et al.,1983；Khan et al.,2010)。溶磷微生物具有增加土壤有效磷(Kucey et al.,1989；Shi et al.,2014；Yin et al.,2015)，促进磷素吸收和减少磷肥用量(Singh and Reddy,2011；Nakayanet al.,2013)，促进磷矿石的生物有效性(Kucey and Leggett,1989；El-Tarabily et al,2008；KAUR and REDDY,2015)，以及促进作物生长和提高作物产量的作用(Chuang et al.,2006；Mittal et al.,2008；Ghosh et al.,2015)。已有报道表明，溶磷微生物及其生物有机肥在溶解难溶磷、减少磷肥投入和提高作物产量方面潜力巨大。因此，在溶磷微生物筛选和应用潜力研究过程中，应注重选择既有较高溶磷能力，又能提高作物产量的高效菌株。
我国政府高度重视化肥减量高效问题，要求逐步做到化肥零增长。磷肥的过量使用导致江河湖泊的富营养化，需要降低磷肥使用量、提高磷肥利用率，减少环境进入水体的有效磷数量。为了达到磷肥零增长的目标，溶磷微生物无疑成为了首选的环境友好型的技术措施。
发明内容
本发明的目的是针对我国缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降的问题，提供一种广泛适应性的高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂、生物有机肥及其应用。
为了实现本发明目的，本发明从我国山东省济宁市大蒜农田土壤(石灰性土壤)中筛选到一株具有较强溶解土壤难溶磷能力的真菌A44，菌株A44经鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.11793，保藏日期2015年12月8日。
本发明还提供含有黑曲霉A44的微生物菌剂及复合微生物菌剂。
所述微生物菌剂或复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂。其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、草炭土等中的至少一种；所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等；所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、纤维素、壳聚糖等中的至少一种。
本发明还提供由黑曲霉A44、其微生物菌剂或复合微生物制备的生物有机肥。
优选地，所述生物有机肥中还含有灭菌的有机物料，所述有机物料为畜禽粪便生物有机肥、秸秆腐熟物质、草炭土、稻壳粉、麦壳粉、豆粕粉等中的至少一种；将所述生物有机肥直接造粒后单独作为底肥，与种子一起作种肥使用；或者，将底肥与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥中的至少一种混合施用。
优选地，所述生物有机肥是将由黑曲霉A44制备的菌剂经造粒后单独作为底肥，与种子一起作种肥使用；或者，将底肥与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥中的至少一种混合制备而成。
本发明还提供由黑曲霉A44、其微生物菌剂或复合微生物制备的土壤磷素活化剂。
本发明还提供黑曲霉A44、其微生物菌剂或复合微生物、由其制备的生物有机肥或土壤磷素活化剂在活化土壤难溶磷中的应用。
本发明还提供黑曲霉A44、其微生物菌剂或复合微生物、由其制备的生物有机肥或土壤磷素活化剂在提高土壤对作物的供磷能力(即提高磷矿粉有效性)中的应用。
本发明进一步提供黑曲霉A44、其微生物菌剂或复合微生物、由其制备的生物有机肥或土壤磷素活化剂在提高作物产量中的应用。
本发明提供的高效溶磷促生菌--黑曲霉A44，从我国北方大蒜连作农田土壤中分离获得，适用于石灰性土壤类型，特别适合我国华北、西北等区域的典型农田土壤。实验表明，在固体、液体培养基条件下，能够溶解磷酸三钙、磷矿石、磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝和磷酸锌。通过对菌株A44促进作物生长和提高作物产量的作用效果进行研究，为多种难溶磷的活化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了宝贵的菌种资源和产品支撑。
本发明的微生物菌株A44能够高效溶解磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝、磷酸锌和磷酸三钙。难溶磷PDA平板培养5天，对Ca3(PO4)2的溶解量达到58.16mg磷/平板；液体培养5天，对磷矿粉、磷酸三钙、磷酸铝、磷酸锌、磷酸铁的溶解率分别达56.4％、82.1％、32.36％、34.4％、13.2％，超过目前报道的国际公认的溶磷真菌拜莱青霉菌(ATCC 20851)。本发明的生物有机肥，显著促进玉米、花生和向日葵生长，生物量比对照分别增加80.9％、20.51％～24.14％和15.5％～32.3％；田间条件下提高向日葵产量33.3％。本发明的微生物菌剂对于植物促生效果明显，且其作用效果不受化肥使用的抑制，可在正常使用化肥条件下施用，对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
本发明针对我国土壤磷有效性低，难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并基于我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源的现状，选育出广泛适用于我国北方主要土壤、多种作物的高效溶磷微生物菌株，为开发高效溶磷生物有机肥和微生物菌剂提供技术支撑。
附图说明
图1为本发明黑曲霉A44在无机磷培养基(磷酸三钙为磷源)上形成的菌落。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1高效溶磷促生微生物菌剂的制备
从我国山东省济宁市大蒜农田土壤(石灰性土壤)中筛选到一株具有较强溶解土壤难溶磷作用的真菌A44，综合菌株的形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定菌株A44为黑曲霉(Aspergillus niger)。
1、黑曲霉A44的培养
(1)培养基的组成(kg/t发酵液)
可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，FeSO40.001kg，硼酸(1％)1L，pH 7.0，以水配制。
(2)发酵培养
接种黑曲霉A44于土豆蔗糖(PDA)培养基上，28℃培养3d。将A44孢子转接入1000mL三角瓶，在28℃，220r/min条件下液体培养36h。然后按1v/v％接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7～1.0vvm下，培养3d。
2、高效溶磷促生微生物菌剂的制备
发酵完成后，按发酵液质量百分比0.5～1％的添加量向发酵液中加入保护剂海藻酸钠等，然后用发酵液1～3倍体积的灭菌草炭、轻质碳酸钙、高岭土等载体吸附，即得溶磷促生黑曲霉A44菌剂，活菌数为3×108-5×108cfu/g。
3、生物有机肥的制备
向以上菌剂中加入适量的灭菌畜禽有机肥、秸秆腐熟物质、稻壳粉、豆粕粉生产生物有机肥，或将生物有机肥与膨润土等粘结剂造粒成颗粒肥料，根据生产需要形成不同颗粒粒径的生物有机肥作为底肥或种肥，用于与玉米、小麦、大豆、棉花等等作物种子的机械播种，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。
实施例2固体平板试验溶磷效果
为了明确黑曲霉A44的溶解各种难溶磷的能力，本实施例中使用了5中磷源，分别为磷酸三钙Ca3(PO4)2、磷酸铁、磷酸铝、磷酸锌、磷矿粉等磷源，28℃培养5天，测定PDA平板上的有效磷。试验以拜莱青霉菌ATCC 20851为对照菌株，并设有对照试验。
结果显示，A44真菌溶解磷酸三钙能力最强，溶磷高达58.16mg磷/平板，高于ZL200810118076.9中公开的溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，其溶磷量为48.76mg磷/平板，且高于菌株ATCC 20851的溶磷量(21.05mg磷/平板)。黑曲霉A44在无机磷培养基(磷酸三钙为磷源)上形成的菌落见图1(A和B)。
表1 不同溶磷菌株在PDA固体平板上的溶磷效果
注：a、b、c字母不同表明处理之间差异显著。
实施例3溶磷菌株A44在液体培养基中溶解难溶磷的效果
在液体培养条件下，进行了溶磷真菌A44对于磷矿粉、磷酸铝、磷酸铁、磷酸钙、磷酸锌的溶解能力实验。结果显示，黑曲霉A44从云南磷矿粉溶解出来的有效磷达到411.1μg磷/mL，占加入磷矿粉含磷量的56.4％；黑曲霉A44菌株从磷酸三钙中释放的有效磷最高，达815.2μg磷/mL，占加入量的82.1％；菌株A44溶解磷酸铝的能力最好，有效磷分别为411.1μg磷/mL，分别占加入磷量(1270μg磷/mL)的32.4％；菌株A44溶解硫酸锌的能力较强，有效磷达到276.4μg磷/mL，占加入磷量(803μg磷/mL)的34.4％；尽管菌株A44溶解磷酸铁的能力低于其他磷源，释放的有效磷仍达到135.0μg磷/mL，占加入难溶磷的13.2％。磷酸铝是一种比较难溶解的磷源，目前国内外报道的高效溶解磷酸铝的菌株较少。
表2 黑曲霉A44液体培养5天对4种难溶磷的溶解效果
实施例4溶磷生物有机肥促进玉米作物生长的效果
黑曲霉A44生物有机肥增加生物量作用显著，玉米植株鲜重和干重比对照分别提高43.0％和80.9％，比对照菌株ATCC 20851制备的生物有机肥分别提高20.94％(玉米鲜重)和21.78％(玉米干重)。而对照菌株ATCC 20851制备的生物有机肥的玉米植株鲜重和干重分别比不接种对照处理提高18.2％和48.5％。显示溶磷菌A44生物有机肥促生效果显著。
表3 盆栽条件下溶磷菌A44菌剂促进玉米生长的效果
注：a、b、c字母不同表明处理之间差异显著。
实施例5盆栽条件下A44菌剂对花生、向日葵生物量的影响
有效磷NaH2PO4供应条件下的结果显示，溶磷微生物A44表现增产效果(表4)。溶磷菌A44接种花生上增产显著，生物量达到32.9g/盆，比对照增加20.51％；菌株A44接种向日葵显著提高生物产量，生物量为28.3g/盆，比对照增加15.5％。
难溶磷Ca3(PO4)2供应条件下，溶磷微生物A44表现显著增加生物量的作用效果(表4)。溶磷菌A44接种花生上生物量达到31.7g/盆，比对照增产20.53％；菌株A44接种向日葵的上生物量为31.5g/盆，比对照增产29.1％。
磷矿粉难溶磷供应条件下，溶磷微生物A44显著增加花生和向日葵的生物量(表4)。溶磷菌A44接种花生的生物量为32.4g/盆，比对照分别增产24.14％；菌株A44接种向日葵的生物量达到30.7g/盆，比对照增产32.3％。
以上结果表明，在难溶磷磷源Ca3(PO4)2和磷矿石粉(RP)为磷源条件下，接种A44的花生、向日葵生物量提升效果大于有效磷源磷酸二氢钠(NaH2PO4)，体现了溶磷菌A44菌剂对难溶磷的活化和利用效果。
表4 不同磷源条件下黑曲霉A44菌剂对花生、向日葵生物量的影响
注：a、b字母不同表明处理之间差异显著。
实施例6溶磷生物有机肥对田间向日葵的增产作用
田间试验在内蒙古乌拉特前旗盐碱地上进行，作物为向日葵，品种为FN1699。黑曲霉A44生物有机肥使用量为59kg/亩，生物有机肥撒施播种垄行的地表，耕翻20cm，然后采用机械使用化肥和播种，同时覆盖地膜，氮磷钾复合肥(15-15-15)颗粒用量为60kg/亩。结果显示，A44生物有机肥显著提高向日葵产量，使用A44生物有机肥的处理向日葵产量达到227.9kg/亩，而不使用生物有机肥的对照处理产量为171.0kg/亩，亩增产56.94kg，增产率33.3％。上述结果表明，黑曲霉A44生物有机肥能够适应盐碱较重的农田土壤，不受化肥使用的影响，具有较强的应用潜力。
表5 溶磷菌A44生物有机肥对向日葵产量的影响
注：a、b字母不同表明处理之间差异显著。
本发明对广泛适应性的高效溶磷促生菌黑曲霉A44及其生物有机肥进行了多方面研究，施用本发明的溶磷生物有机肥菌剂，能够高效活化土壤磷素，增加土壤有效磷水平，增强磷矿粉的生物有效性，提高作物吸磷量，作物增产显著，达到了溶磷增产的效果，具有良好的农业生产应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)

1.黑曲霉(Aspergillus niger)A44，其保藏号为CGMCC No.11793。
2.含有权利要求1所述黑曲霉A44的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；
其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、草炭土中的至少一种；
所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖；
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、纤维素、壳聚糖中的至少一种。
4.由权利要求1所述黑曲霉A44或权利要求2、3所述菌剂制备的生物有机肥。
5.根据权利要求4所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥中还含有灭菌的有机物料，所述有机物料为畜禽粪便生物有机肥、秸秆腐熟物质、草炭土、稻壳粉、麦壳粉、豆粕粉中的至少一种；将所述生物有机肥直接造粒后作为底肥；或者，与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥中的至少一种混合施用。
6.根据权利要求4所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥是将由黑曲霉A44制备的菌剂经造粒后作为底肥；或者，与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥中的至少一种混合制备而成。
7.由权利要求1所述黑曲霉A44或权利要求2、3所述菌剂制备的土壤磷素活化剂。
8.权利要求1所述黑曲霉A44、权利要求2、3所述菌剂、权利要求4-6任一项所述生物有机肥或权利要求7所述土壤磷素活化剂在活化土壤难溶磷中的应用。
9.权利要求1所述黑曲霉A44、权利要求2、3所述菌剂、权利要求4-6任一项所述生物有机肥或权利要求7所述土壤磷素活化剂在提高土壤对作物的供磷能力中的应用。
10.权利要求1所述黑曲霉A44、权利要求2、3所述菌剂、权利要求4-6任一项所述生物有机肥或权利要求7所述土壤磷素活化剂在提高作物产量中的应用。
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