CN105198512A - 一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法。该方法包括:首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含L-谷氨酸的有机物料,再用枯草芽孢杆菌对含有L-谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有γ-聚谷氨酸的有机肥。该肥料经过大田试验,取得了良好的作物增产效果。本发明方法避免直接加入纯聚谷氨酸,减少了提纯过程,降低了肥料成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,属于有机肥生产技术领域。
背景技术
目前,我国传统肥料需求进入瓶颈期,开发新型肥料一直是行业内的热点。聚谷氨酸肥料是一种新兴功能性肥料,据研究报道,γ-聚谷氨酸对小白菜、玉米、烟叶的种植与栽培同样产量时肥料使用量减少10%以上,或在同样施肥量前提下提高作物产量10%以上。γ-聚谷氨酸是一种多聚氨基酸,它具有高絮凝活性,对土壤的金属离子有良好的吸附性,可有效改善土壤的重金属污染,同时提高锌、铁等离子对作物的有效性;聚谷氨酸与土壤结合还可以改善土壤结构,增加土壤保水、保肥性能,因此通过添加聚谷氨酸制备各种肥料的发明也有不少公开。例如,CN104003783A(CN201410261189)公开了一种功能性颗粒状大量元素水溶肥,其原料组分重量份是:尿素345~350份、硝酸钾210~220份、磷酸二氢钾240~250份、硫酸钾20~30份、磷酸一铵110~115份、硼酸11~11.6份、EDTA螯合锌6~6.6份、EDTA螯合铁7~7.7份、EDTA螯合锰3~3.9份、七钼酸铵0.1~0.2份、聚谷氨酸5~10份。该肥料具有保水、抗旱,肥料利用率高,改良、修复土壤等功能;CN103936521A提供一种新型高效复混肥料及其制备方法,该肥料组成是:生物增效剂2~5份、硫酸锌20~30份、硫酸镁20~30份、腐植酸15~25份、硫酸硼10~20份、硫酸锰5~15份、钼酸铵1~4份,其中,生物增效剂组分及重量份数为:聚天冬氨酸65~85份和聚谷氨酸15~35份。
以上所述现有技术中的各种肥料都是复配的组合物,所添加的是提纯的聚谷氨酸,而提纯工序会大量增加成本,不利于农业生产大量使用。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,也即,利用两种微生物先后进行固体发酵生产含有γ-聚谷氨酸的有机肥的制备方法。
本发明还提供制备的γ-聚谷氨酸有机肥的应用及施用方法。
术语说明:
PDA斜面培养基,是对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称,配方:马铃薯200份,葡萄糖20份,琼脂15~20份,自来水1000份。
食用菌培养料废渣,是栽培食用菌后废弃的培养料,培养料主要成分有棉籽壳、棉绒、玉米芯、锯末、作物秸秆、麦麸、菌丝体等。
糠醛渣,是以玉米芯、玉米秆、稻壳、棉籽壳等为原料生产糠醛(呋喃甲醛)过程中的废渣,作为一种生物质类废弃物含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等。
γ-聚谷氨酸是水溶性多聚氨基酸,分子量分布在100kDa到10000kDa之间。
本发明的技术方案如下:
一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,包括如下步骤:
(1)制备谷氨酸棒杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将谷氨酸棒杆菌菌种活化;
b、按质量份,取葡萄糖30份,玉米粉60份,蛋白胨2份,酵母粉2份,磷酸二氢钾1.5份,硫酸镁1份,氯化钠2份,水1000份,pH值7.0,0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基A;将步骤a活化后的谷氨酸棒杆菌接入制成的液体培养基A中,于28~32℃、150转/分钟的摇瓶中培养16~20小时;得谷氨酸棒杆菌种子液;种子液菌活1×108个/克~5×108个/克;备用;
(2)制备枯草芽孢杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌种活化;
b、按质量份,取葡萄糖20份,玉米粉30份,蛋白胨5份,酵母粉5份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁1份,氯化钠2份,水1000份,pH值7.0,在0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基B;将步骤a活化后的枯草芽孢杆菌接入制成的液体培养基B中,于28~30℃、150转/分钟的摇瓶中培养20~24小时;得枯草芽孢杆菌种子液;种子液菌活1×108个/克~5×108个/克;备用;
(3)制备发酵有机物料
按质量份,取食用菌培养料废渣30~45份,粉碎的作物秸秆15~30份,糠醛渣18~50份,堆置发酵30~40天,加入土豆粉5~10份,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
按质量份,取步骤(3)制备的发酵有机物料,按5~10wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于28~35℃条件下堆置发酵28~40小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物,按6~15wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于25~35℃条件下堆置发酵25~35小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;得双微生物发酵的γ-聚谷氨酸有机肥。
所述谷氨酸棒杆菌选用谷氨酸棒杆菌Ⅲ型(Corynebacteriumglutamicum),优选中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection英文缩写CICC)的CICC10111、CICC10112、CICC10113或CICC10114。谷氨酸棒杆菌种子液的制备也可按现有技术,本发明提供步骤(1)的方法是优选的。
所述枯草芽孢杆菌选用枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp.Subtilis),优选中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection英文缩写CICC)的CICC20643。枯草芽孢杆菌种子液的制备也可按现有技术,本发明提供步骤(2)的方法是优选的。
根据本发明,上述步骤(3)中所述作物秸秆选用玉米、小麦、水稻、花生等作物秸秆。
根据本发明,优选的,上述步骤(3)中所述作物秸秆为玉米秸秆,粉碎至长度2厘米以下。
根据本发明,优选的,上述步骤(3)中所述食用菌培养料废渣为栽培杏鲍菇或平菇的培养料废弃菌棒,粉碎至颗粒粒径0.5厘米以下。其中优选食用菌培养料废渣为栽培杏鲍菇的培养料废弃菌棒。
根据本发明,优选的,上述步骤(3)为:取栽培杏鲍菇的培养料废渣35份,粉碎的玉米秸秆20份,糠醛渣37份,堆置发酵35天,加入土豆粉8份;
根据本发明,优选的,上述步骤(4)谷氨酸棒杆菌种子液的接种量为6wt%,33℃条件下堆置发酵30小时;
根据本发明,优选的,上述步骤(5)枯草芽孢杆菌种子液的接种量为12wt%,30℃条件下堆置发酵28小时。
上述制备方法中未详细限定的均按现有技术。
本发明方法制备的发酵有机肥产品中γ-聚谷氨酸的含量在1%wt.左右,该γ-聚谷氨酸有机肥适用于蔬菜、果树、草本水果等作物。
本发明方法制备的γ-聚谷氨酸有机肥,施用方法如下:
将本发明的γ-聚谷氨酸有机肥在作物种植前均匀撒施于土壤表面翻耕入土,或者施于栽植穴内,与土混合后在其上移栽幼苗。所述γ-聚谷氨酸有机肥的用量如下:蔬菜作物和草本水果每亩500~800公斤,果树每亩300~600公斤。
本发明首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含L-谷氨酸的有机物料,再用枯草芽孢杆菌对含有L-谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有γ-聚谷氨酸的有机肥。该肥料经过大田试验,取得了良好的作物增产效果。
本发明的优良效果如下:
1.采用双微生物发酵工艺,避免了直接加入L-谷氨酸
γ-聚谷氨酸主要以微生物发酵法合成制得,而合成聚谷氨酸的微生物主要是L-谷氨酸依赖型微生物,即在培养过程中需要加入培养基中L-谷氨酸才能合成γ-聚谷氨酸。本发明首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含L-谷氨酸的有机物料,再用枯草芽孢杆菌对含有L-谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有γ-聚谷氨酸的有机肥,避免直接加入L-谷氨酸。
2.降低肥料成本
目前,含有聚谷氨酸的肥料主要是添加纯的聚谷氨酸,而聚谷氨酸的纯化是一个复杂的工艺过程,因此聚谷氨酸价格较贵,用其生产有机肥成本较高。本发明首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含L-谷氨酸的有机物料,避免直接加入纯L-谷氨酸;对含有L-谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有γ-聚谷氨酸的有机肥,也避免直接加入纯聚谷氨酸,减少了提纯过程,降低了肥料成本。
3、肥料增产效果好
本发明利用两种作物进行的田间试验显示,与应用相同的有机物原料和现有发酵技术生产的有机肥相比,本发明肥料在大棚西红柿的增产率为6.9%~10.3%,白菜增产8.4%~12.5%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但不限于此。实施例中的原料用量份数均为质量份,所有的百分比均为质量百分比(wt%)。
谷氨酸棒杆菌选用谷氨酸棒杆菌Ⅲ型(Corynebacteriumglutamicum)CICC10111和CICC10112、中国工业微生物菌种保藏管理中心购得,其中实施例1-2用CICC10111,实施例3-4用CICC10112。
枯草芽孢杆菌选用枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp.Subtilis)CICC20643,中国工业微生物菌种保藏管理中心购得。
玉米秸秆和花生秸秆粉碎至过2毫米孔筛,食用菌培养料废渣粉碎至粒径小于0.5厘米,土豆粉碎过20目筛。食用菌培养料废渣为栽培杏鲍菇和平菇的废弃菌棒,其中实施例1-2用栽培杏鲍菇的培养料废渣,实施例3-4用栽培平菇的培养料废渣。葡萄糖、玉米粉、蛋白胨等均为市售产品。
实施例中的含量%均为质量百分比。
实施例1:一种双微生物发酵制备含γ-聚谷氨酸有机肥的方法,步骤如下:
(1)制备谷氨酸棒杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将谷氨酸棒杆菌CICC10111菌种活化;
b、取葡萄糖30克,玉米粉60克,蛋白胨2克,酵母粉2克,磷酸二氢钾1.5克,硫酸镁1克,氯化钠2克,水1000克,调pH值至7.0,在0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基;将步骤a活化后的谷氨酸棒杆菌(CICC10111)接入液体培养基中,于30℃、150转/分钟的摇瓶中培养18小时;得谷氨酸棒杆菌种子液;种子液菌活3×108个/克;备用;
(2)制备枯草芽孢杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌种(CICC20643)活化;
b、取葡萄糖20克,玉米粉30克,蛋白胨5克,酵母粉5克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁1克,氯化钠2克,水1000克,调pH值至7.0,在0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基;将步骤a活化后的枯草芽孢杆菌接入液体培养基中,于28℃、150转/分钟的摇瓶中培养22小时;得枯草芽孢杆菌种子液;种子液菌活3.26×108个/克;备用;
(3)制备发酵有机物料
取栽培杏鲍菇的培养料废渣40公斤,粉碎的玉米秸秆25公斤,糠醛渣30公斤,堆置发酵30天,加入土豆粉5公斤,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
取步骤(3)制备的发酵有机物料100公斤,按8wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于30℃条件下堆置发酵35小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物100公斤,按10wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于28℃条件下堆置发酵30小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;得双微生物发酵的含γ-聚谷氨酸的有机肥。本机肥含γ-聚谷氨酸约0.9%。
实施例2:一种双微生物发酵含γ-聚谷氨酸有机肥的制备:
(1)谷氨酸棒杆菌种子液的制备同实施例1,谷氨酸棒杆菌种用CICC10111。
(2)枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1,枯草芽孢杆菌菌种用CICC20643。
(3)制备发酵有机物料
取栽培杏鲍菇的培养料废渣35公斤,粉碎的玉米秸秆20公斤,糠醛渣37公斤,堆置发酵35天,加入土豆粉8公斤,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
取步骤(3)制备的发酵有机物料100公斤,按6wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于33℃条件下堆置发酵30小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物100公斤,按12wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于30℃条件下堆置发酵28小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;得双微生物发酵的含γ-聚谷氨酸有机肥。本有机肥含γ-聚谷氨酸约1.1%。
实施例3:一种含γ-聚谷氨酸有机肥的制备:
(1)谷氨酸棒杆菌种子液的制备同实施例1,谷氨酸棒杆菌种用CICC10112。
(2)枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1,枯草芽孢杆菌菌种用CICC20643。
(3)制备发酵有机物料
取栽培平菇的培养料废渣45公斤,粉碎的花生秸秆30公斤,糠醛渣19公斤,堆置发酵40天,加入土豆粉6公斤,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
取步骤(3)制备的发酵有机物料100公斤,按10wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于28℃条件下堆置发酵40小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物100公斤,按8wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于32℃条件下堆置发酵25小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;得含γ-聚谷氨酸的有机肥。该有机肥含γ-聚谷氨酸约1.0%。
实施例4:一种双微生物发酵含γ-聚谷氨酸有机肥的制备:
(1)谷氨酸棒杆菌种子液的制备同实施例1,谷氨酸棒杆菌种用CICC10112。
(2)枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1,枯草芽孢杆菌菌种用CICC20643。
(3)制备发酵有机物料
取栽培平菇的培养料废渣30公斤,粉碎的花生秸秆15公斤,糠醛渣46公斤,堆置发酵38天,加入土豆粉9公斤,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
取步骤(3)制备的发酵有机物料100公斤,按5wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于35℃条件下堆置发酵28小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物100公斤,按6wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于25℃条件下堆置发酵35小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;得γ-聚谷氨酸有机肥。有机肥中含γ-聚谷氨酸0.9%。
肥效大田试验
供试肥料:本发明实施例1-4制备的γ-聚谷氨酸有机肥
对比例:分别以实施例1-4各自步骤(3)制备的发酵有机物为对比肥料,其原料来源、配比和制备过程分别与实施例1-4步骤(3)的完全相同。
试验地点及作物:山东省寿光市大棚西红柿,山东省临沂市露地白菜。
试验时间:2014年8月至2015年5月。
两处均设实施例1~4和各自的对比例共8个处理,寿光市大棚西红柿试验每个小区面积20平方米,实施例1~4的产品用量每亩800公斤;临沂市白菜试验小区面积30平方米,实施例1~4的产品用量每亩500公斤。实施例和对比例用量相同,施用方法是在西红柿和白菜移栽前施入栽培穴内,与土混合后栽植幼苗,其它肥料施用按农民习惯统一进行,所有的管理措施一致。应用效果见表1。
表1.与各自对比例发酵有机肥相比实施例1~4的应用效果
供试肥料 | 寿光西红柿增产效率% | 临沂白菜增产效率% |
实施例1 | 8.6 | 9.5 |
实施例2 | 10.3 | 12.5 |
实施例3 | 6.9 | 10.2 |
实施例4 | 9.1 | 8.4 |
Claims (8)
1.一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,包括如下步骤:
(1)制备谷氨酸棒杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将谷氨酸棒杆菌菌种活化;
b、按质量份,取葡萄糖30份,玉米粉60份,蛋白胨2份,酵母粉2份,磷酸二氢钾1.5份,硫酸镁1份,氯化钠2份,水1000份,pH值7.0,0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基A;将步骤a活化后的谷氨酸棒杆菌接入制成的液体培养基A中,于28~32℃、150转/分钟的摇瓶中培养16~20小时;得谷氨酸棒杆菌种子液;种子液菌活1×108个/克~5×108个/克;备用;
(2)制备枯草芽孢杆菌种子液
a、用PDA斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌种活化;
b、按质量份,取葡萄糖20份,玉米粉30份,蛋白胨5份,酵母粉5份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁1份,氯化钠2份,水1000份,pH值7.0,在0.11兆帕压力下灭菌30分钟,制成液体培养基B;将步骤a活化后的枯草芽孢杆菌接入制成的液体培养基B中,于28~30℃、150转/分钟的摇瓶中培养20~24小时;得枯草芽孢杆菌种子液;种子液菌活1×108个/克~5×108个/克;备用;
(3)制备发酵有机物料
按质量份,取食用菌培养料废渣30~45份,粉碎的作物秸秆15~30份,糠醛渣18~50份,堆置发酵30~40天,加入土豆粉5~10份,常规灭菌,得发酵有机物料;备用;
(4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
按质量份,取步骤(3)制备的发酵有机物料,按5~10wt%的接种量接入步骤(1)制备的谷氨酸棒杆菌种子液,混匀,调整混合物的含水量至58%~60%,于28~35℃条件下堆置发酵28~40小时,中间翻堆一次,得谷氨酸棒杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物,按6~15wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌种子液,混匀,于25~35℃条件下堆置发酵25~35小时,中间翻堆一次,发酵结束后烘干或凉干;即得。
2.如权利要求1所述的双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,其特征在于所述谷氨酸棒杆菌选用谷氨酸棒杆菌Ⅲ型(Corynebacteriumglutamicum),优选中国工业微生物菌种保藏管理中心的CICC10111、CICC10112、CICC10113或CICC10114。
3.如权利要求1所述的双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,其特征在于所述枯草芽孢杆菌选用枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp.Subtilis),优选中国工业微生物菌种保藏管理中心的CICC20643。
4.如权利要求1所述的双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,其特征在于步骤(3)中所述作物秸秆选用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆或花生秸秆。
5.如权利要求1所述的双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,其特征在于步骤(3)中所述食用菌培养料废渣为栽培杏鲍菇或平菇的培养料废弃菌棒,粉碎至颗粒粒径0.5厘米以下;优选食用菌培养料废渣为栽培杏鲍菇的培养料废弃菌棒。
6.如权利要求1所述的双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法,其特征在于步骤(3)中:
取栽培杏鲍菇的培养料废渣35份,粉碎的玉米秸秆20份,糠醛渣37份,堆置发酵35天,加入土豆粉8份;
步骤(4)谷氨酸棒杆菌种子液的接种量为6wt%,33℃条件下堆置发酵30小时;
步骤(5)枯草芽孢杆菌种子液的接种量为12wt%,30℃条件下堆置发酵28小时。
7.权利要求1-6任一项制备方法制备的γ-聚谷氨酸有机肥的应用,用于蔬菜、果树或草本水果的种植。
8.如权利要求7所述的γ-聚谷氨酸有机肥的应用,其特征在于,施用方法如下:
将所述的γ-聚谷氨酸有机肥在作物种植前均匀撒施于土壤表面翻耕入土,或者施于栽植穴内,与土混合后在其上移栽幼苗;
所述γ-聚谷氨酸有机肥的用量如下:蔬菜作物和草本水果每亩500~800公斤,果树每亩300~600公斤。
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