CN101417894A - 一种含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含γ－聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法。本方法用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA－7CCTCC M 206102做发酵菌株，以氨基酸发酵废液、豆粕、花生饼粉、麸皮、稻草粉等为主要发酵基料进行固体发酵。其工艺过程包括：斜面菌种活化、菌种的液体活化和固体发酵。发酵完毕的固体物料含有少量的γ－聚谷氨酸和其产生菌，既能提高肥料的氮素营养利用率，对所施用的植物又有一定的保水作用，能减少植物生长所需的用水量，特别适合作为肥料功能添加剂。

Description

一种含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法
技术领域
本发明涉及一种有机肥料添加剂的生产方法，具体地说，涉及一种以微生物对工农业废物料等廉价材料进行固体发酵生产含聚谷氨酸的肥料添加剂的方法。
背景技术
味精发酵废液、苏氨酸等氨基酸发酵废液是由味精厂、食品厂排出的生产废液，这些废液由于具有高COD、BOD、氨氮、有机物等，成为严重的环境污染源。利用这些废液作为制备有机肥料是处理这些废液的一个重要途径。目前利用味精发酵废液制备有机肥料的方法一般是将味精发酵废液与一些适当的配料直接混配、固化、造粒而成，如CN1442396公开的“味精副产物生产的氨基酸有机无机肥及其生产方法”，该方法是将味精尾液与菌泥、化肥混合、脱水、造粒而制成有机无机肥料；CN101045657A公开的“利用味精废液生产的无公害有机肥料及其制备方法”，是将味精废液与木质素、风化煤、磷酸铵、氯化钾和微量元素混配、固化、造粒而制成有机肥料。直接添加味精发酵废液、苏氨酸等氨基酸发酵废液到相关配料中以制作有机肥，由于这些废液中含有大量的铵盐，因此可以也提高肥效，但如同直接使用尿素或硫酸铵等氮肥一样，氨基酸废液中的铵盐在施肥过程中约有80％的铵转化为气态氨释放到大气中(Miflin，B.J.，and P.J.Lea.1982.Ammonia assimilation and amino acid metabolism，p.5-64.In D.Boulter，and B.Parthier(ed.)，Nucleic acids andproteins in plants，vol.1.Springer-Verlag，Berlin，Germany.)，植物能够直接吸收的氮素营养只有肥料中总含氮量的56％(w/w)(Syrett，P.J.1988.Uptake andutilization of nitrogen compounds，p.23-39.In L.J.Rogers，and J.R.Gallon(ed.)，Biochemistry of the algae andcyanobacteria.Oxford Science Public ations Clarendon Press，Oxford，United Kingdom.)，另外，氮肥被土壤吸收后，由于土壤中微生物的作用，有部分铵离子被转化成硝酸盐，硝酸盐能溶解于土壤的水中，其中约有40％(w/w)的硝酸盐随土壤的水流失到地下水系或其它水源中(Birrer，G.A.，A.M.Cromwick，and R.A.Gross.1994.γ-Poly(glutamic acid)formation by BacilluslicheniformisATCC9945a：physiological andbiochemical studies.Int.J.Biol.Macromol.16：265-275)，从而造成肥料中氮素营养的下降，使其应用效果受到影响。
发明内容
发明人在进行利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7微生物菌株制备γ-聚谷氨酸的研究中，发现在味精发酵废液、苏氨酸发酵废液等高浓度有机废水及相关配料中加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7微生物菌株后，菌株能将上述发酵物中的铵离子等营养物质转化成γ-聚谷氨酸，同时，γ-聚谷氨酸枯草芽孢杆菌的夹膜的一部分附着在菌体上，成为含有少量的γ-聚谷氨酸和其产生菌的物料，这些物料中的γ-聚谷氨酸可以通过土壤微生物的作用缓慢降解释放碳、氮素营养，就可以克服以上直接添加氨基酸废液会造成氮素营养损失的缺点，同时产生的γ-聚谷氨酸由于是一种有网状碳骨架结构的高分子，还有一定的保水、吸水能力，因而可以作为肥料添加剂应用在农业上，从而作出本发明。
因此，本发明的目的是提出一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌株对包括氨基酸有机废水等工农业废料进行固体发酵以生产含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的方法。
实现本发明的技术方案如下：
采用的微生物菌株是经选育的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)产生菌--枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGA-7，该菌株于2006年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为：CCTCC M 206102。该菌株以下简称：枯草芽孢杆菌PGA-7CCTCC M 206102。
中国典型培养物保藏中心的联系资料如下：
电话：027-8768 2319传真：(027)87883833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn 地址：武汉武汉大学 邮编：430072。
该菌株的菌学特性和保藏情况均已记载于CN1932007之中。
本发明所提供的含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法，其特点是用枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102做发酵菌株，以氨基酸发酵废液、豆粕、花生饼粉、麸皮、稻草粉等为主要发酵基料进行固体发酵。
具体工艺过程如下：
(1)斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，琼脂15～22g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4，33-38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃ 1～5天。
(2)菌种的液体活化：将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32-36℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm。
(3)固体发酵：按0.5-1.5％接种量，取(2)中活化好的液体菌种，接入固体发酵培养基中，固体发酵培养基组成按每公斤固体发酵培养基所含克重g/kg计算为：80-120g氨基酸发酵废液、70-110g豆粕、60-100g麸皮、300-400g稻草粉、20-40g葡萄糖或蔗糖，其余成分为水，将水均匀喷晒入上述物体中，搅拌均匀，117-121℃灭菌30分钟，冷却至32-40℃，按三角锥形堆放于已灭菌的恒温环境中，于32-40℃，培养120-168h，停止发酵，发酵完毕的固体物料即为含聚谷氨酸的肥料添加剂。
发酵完毕的固体物料即含有γ-聚谷氨酸成分和枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102菌体，不必再进行任何提取等后工序，可以直接作为有机肥料的添加剂。
通过此方法发酵完毕后所得的固体物料中，固体发酵培养基的γ-PGA含量为0.08～0.26g/kg固体料，枯草芽孢杆菌PGA-7CCTCC M 206102活菌体数为1.0×107cfu/g固体料-1.0×109cfu/g固体料。
所述的固体发酵培养基中的氨基酸发酵废液可以是味精发酵废液或苏氨酸发酵废液，其中，味精发酵废液的主要化学成分如下：
味精发酵废液(％，w/v)：总氮7.02～7.81％，有效磷0.28～0.36％，总钾0.34～0.40％，有机质7.63～8.03％，水分36～40％，pH值5.5～6.0。
苏氨酸发酵废液(％，w/v)：总氮6.90～7.15％，有效磷0.17～0.21％，有机质9.55～9.95％，水分44～50％，pH值5.5～6.5。
固体发酵培养基中的豆粕是大豆经过提取豆油后得到的一种副产品，其主要化学成分如下(％，w/w)：
蛋白质40％～48％，赖氨酸2.5％～3.0％，色氨酸0.6％～0.7％，蛋氨酸0.5％～0.7％。
固体发酵培养基中的麸皮是小麦提取面粉后的副产品，麸皮为小麦的外皮，包含胚芽及胚乳两部分，约占整粒小麦的12.5％。其主要化学成分如下(％，w/w)：
碳水化合物59.4～63.4％，粗蛋白质13.5～17.0％，粗脂肪3.0～4.75％，粗纤维9.5～12.0％，粗灰分5.0～7.0％，钙0.05～0.14％，磷1.10～1.50％，水分11～15.0％。
稻草粉是普通农业上收割水稻后废弃的稻草打碎后的废渣粉，其主要化学成分如下(％，w/w)：
粗蛋白质4.18～4.38％，粗脂肪2.17～2.37％，粗纤维36.55～40.05％，粗灰分13.80～14.20％，钙0.45～0.49％，磷0.18～0.20％，水分35～41％。
发酵完毕的固体物料可通过以下方法分析测试γ-PGA含量：
取发酵完毕的固体物料50g按1：1(w:w)比例加入清水50mL，充分搅拌均匀后，4000r/m离心30min，取离心后的上清液，先计算好总体积，再计算好测谷氨酸单体的含量；将上清液与6mol/L的盐酸按1∶1(体积比)加入玻璃水解管中，真空封口后于110℃水解24h，然后测定水解液中谷氨酸总量；2次测得的谷氨酸之差为离心后上清液的γ-PGA的含量，再折算成发酵完毕的固体物料的的γ-PGA的含量。
上述对谷氨酸的分析方法可以采用氨基酸自动分析仪，或高效液相色谱仪(HPLC)，或纸层析方法进行测定。纸层析方法如下：取10μl离心发酵上清液或它的水解液点样，层析过夜，用0.5％茚三酮丙酮溶液显色，65℃显色10min，剪下斑点用1g/L硫酸铜洗脱液(CuSO4·5H2O:75％乙醇＝2:38)5mL浸泡20min以上至纸条无色，Λmax＝570nm测其OD值，与谷氨酸标准曲线比较算出相应含量，再计算发酵醪液含γ-PGA量。
发酵完毕的固体物料中枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102活菌体数可按NY/T798-2004中5.3.2规定的方法进行测定，即中华人民共和国农业行业标准——复合微生物肥料(NY/T 798-2004)中5.3.2(有效活菌数的测定)规定的方法进行测定。
本发明在最佳固体发酵工艺条件下，产γ-PGA最高可达0.26g/L，枯草芽孢杆菌PGA-7CCTCC M 206102活菌体数最高含量为1.0×109cfu/g固体料。同时，肥料添加剂还含有其它成分(％)：有机质42-46，全N 1-7，全P 0.2-2，总Ca 1-5，总Mg 0.1-0.7，其余为水。
本发明最大的特点在于用枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102做发酵菌株，以工农业废弃物包括味精发酵废液、苏氨酸发酵废液、豆粕、花生饼粉、麸皮、稻草粉等为主要发酵基料进行固体发酵，将上述物料中的铵离子等营养物质转化成γ-聚谷氨酸，发酵成本极低，工艺非常简单，发酵产物不需再分离提取。发酵完毕的固体物料由于含有少量的γ-聚谷氨酸和其产生菌，既能提高肥料的氮素营养利用率，对所施用的植物又有一定的保水作用，能减少植物生长所需的用水量，特别适合作为肥料功能添加剂。
本发明为味精发酵废液、苏氨酸发酵废液、豆粕、花生饼粉、麸皮、稻草粉等工农业废料的综合利用提供新的途径，还为工农业废物料如味精发酵废液、苏氨酸发酵废液等高浓度有机废水的处理找出另一出路，起到变废为宝、资源化利用的目的。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
下面的实施例中用到的斜面种采用如下方法培养：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7 CCTCC M 206102划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，自来水1L，调pH值至7.2.。337℃培养17小时，再冷藏于4℃冰箱备用。
实施例一：
取4℃冰箱内保藏1天的斜面种[保藏斜面培养基的组成：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，琼脂18g，自来水1L，pH7.0]，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨8g，酵母膏3g，NaCl 9g，自来水1L，调pH值至6.8.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20mL，于32℃往复式摇床振荡培养20小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm，培养结束后，即为液体活化种。取5mL上述液体活化种，均匀喷晒接种于已灭菌的1000g固体发酵培养基上，固体发酵培养基的组成(g/kg)如下：80g味精发酵废液、70g豆粕、60g麸皮、300g稻草粉、20g葡萄糖，其余成分为水。冷却至。固体发酵培养基呈三角锥形，放置于32℃的恒温室中培养120h，发酵结束，立即测定固体发酵成熟料的γ-PGA含量为0.08g/kg固体料，枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102活菌体数最高含量为1.8×107cfu/g固体料。
实施例二：
取4℃冰箱内保藏1天的斜面种[保藏斜面培养基的组成：蛋白胨8g，NaCl 10g，酵母膏6g，琼脂20g，自来水1L，pH7.2]，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨10g，酵母膏8g，NaCl 9g，自来水1L，调pH值至7.2.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20mL，于34℃往复式摇床振荡培养26小时，摇床转速为90r/m，冲程为70mm，培养结束后，即为液体活化种。取8mL上述液体活化种，均匀喷晒接种于已灭菌的1000g固体发酵培养基上，固体发酵培养基的组成(g/kg)如下：100g苏氨酸发酵废液、70g豆粕、90g麸皮、350g稻草粉、30g蔗糖，其余成分为水。冷却至。固体发酵培养基呈三角锥形，放置于36℃的恒温室中培养140h，发酵结束，立即测定固体发酵成熟料的γ-PGA含量为0.16g/kg固体料，枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102活菌体数最高含量为1.5×108cfu/g固体料。
实施例三：
取4℃冰箱内保藏1天的斜面种[保藏斜面培养基的组成：蛋白胨8g，NaCl 11g，酵母膏8g，琼脂22g，自来水1L，pH7.0。]，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨10g，酵母膏8g，NaCl 10g，自来水1L，调pH值至7.4.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20mL，于32℃往复式摇床振荡培养30小时，摇床转速为100r/m，冲程为72mm，培养结束后，即为液体活化种。取12mL上述液体活化种，均匀喷晒接种于已灭菌的1000g固体发酵培养基上，固体发酵培养基的组成(g/kg)如下：110g味精发酵废液、100g豆粕、80g麸皮、350g稻草粉、30g葡萄糖，其余成分为水。冷却至。固体发酵培养基呈三角锥形，放置于36℃的恒温室中培养150h，发酵结束，立即测定固体发酵成熟料的γ-PGA含量为0.20g/kg固体料，枯草芽孢杆菌CCTCC M 206102活菌体数最高含量为7.0×108cfu/g固体料。
实施例四：
取4℃冰箱内保藏1天的斜面种[保藏斜面培养基的组成：蛋白胨12g，NaCl 11g，酵母膏8g，琼脂21g，自来水1L，pH7.0]，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨12g，酵母膏8g，NaCl 11g，自来水1L，调pH值至7.0.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20mL，于36℃往复式摇床振荡培养36小时，摇床转速为110r/m，冲程为75mm，培养结束后，即为液体活化种。取15mL上述液体活化种，均匀喷晒接种于已灭菌的1000g固体发酵培养基上，固体发酵培养基的组成(g/kg)如下：120g味精发酵废液、110g豆粕、100g麸皮、400g稻草粉、40g葡萄糖，其余成分为水。冷却至。固体发酵培养基呈三角锥形，放置于40℃的恒温室中培养168h，发酵结束，立即测定固体发酵成熟料的γ-PGA含量为0.26g/kg固体料，枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102活菌体数最高含量为1.0×109cfu/g固体料。
将上述制备完毕的肥料添加剂按5-10％(w/W)的添加量添加肥料厂的有机肥中，进行农业施肥的实施效果试验：
实施效果试验设2个处理，每个处理3次重复。
处理一：将上述制备完毕的肥料添加剂按10％添加量添加到广州某肥料厂的有机肥中，该有机肥的主要成分为(％w/w)：全N，1.42，P2O5，2.02，K2O，0.83，有机质，26.94，总Ca，4.43，总Mg 0.63，其余为水。亩施100公斤上述加有肥料添加剂的有机肥作基肥，另100公斤作追肥；
处理二：亩施100公斤没有加有肥料添加剂的有机肥作基肥，另100公斤作追肥，以此与处理一作比较。
试验品种为夏阳白菜，2007年8月30日播种，9月15日移植。10月28日收获。
施肥时间及施肥量
处理一，9月15日亩施100公斤加有肥料添加剂的有机肥作机肥，9月23日亩100公斤加有肥料添加剂的有机肥作追肥；处理二、，9月15日亩施100公斤的没有加有肥料添加剂的有机肥作机肥，9月23日亩100公斤没有加有肥料添加剂的有机肥作追肥。另外处理一、二在9月20日，亩施回青肥尿素5公斤，钾肥5公斤。
施用加有本肥料添加剂的有机肥对白菜主要农艺性状和产量的影响的结果如下表(表1)所示：
表1
结论
A、白菜施用加有肥料添加剂的有机肥，能增加植株的高度，增大叶片的长度和宽度，结球坚实，提高品质，口感好，含糖量较高。
B、白菜施用加有肥料添加剂的有机肥有较好的增产效果，比灭活的生物有机肥增产14.4％，增产达极显著水平。

Claims (2)

1.一种含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法，其特征在于利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGA-7 CCTCC M 206102作为发酵菌株，在发酵培养基进行固体发酵，其工艺过程如下：
(1)斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，琼脂15～22g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4.。33-38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃1～5天；
(2)菌种的液体活化：将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32-36℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm；
(3)固体发酵：按0.5-1.5％接种量，取步骤(2)中活化好的液体菌种，接入固体发酵培养基中，固体发酵培养基组成按每公斤固体发酵培养基所含克重g/kg计算为：80-120g氨基酸发酵废液、70-110g豆粕、60-100g麸皮、300-400g稻草粉、20-40g葡萄糖或蔗糖，其余成分为水，将水均匀喷晒入上述物体中，搅拌均匀，117-121℃灭菌30分钟，冷却至32-40℃，按三角锥形堆放于已灭菌的恒温环境中，于32-40℃，培养120-168h，停止发酵，发酵完毕的固体物料即为含聚谷氨酸的肥料添加剂。
2.根据要得要求1所述的含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法，其特征在于所述的固体发酵培养基中的氨基酸发酵废液为味精发酵废液或苏氨酸发酵废液。
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