CN102492641A

CN102492641A - 一种死谷芽孢杆菌的发酵培养方法及微生物肥料生产方法

Info

Publication number: CN102492641A
Application number: CN2011104254785A
Authority: CN
Inventors: 闫龙翔; 陈芳; 陈露
Original assignee: LULE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: LULE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-06-13

Abstract

本发明提供了一种死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，包括种子培养和发酵培养工序，在所述发酵培养工序中，培养基的初始pH为6.0～7.0，菌株温度30℃～37℃，氮源用量为5～10g/L，碳源用量为15～25g/L。此外，还提供了用发酵得到的菌液利用水解渣为原料生产微生物肥料的方法。本发明的发酵培养方法得到的48h发酵液中活菌或芽孢为3.4～5.1×10¹⁰CFU/mL以上，比常规方法至少高一个数量级，且微生物肥料的生产方法有效地利用了废弃资源，具有环保、经济的优点。

Description

一种死谷芽孢杆菌的发酵培养方法及微生物肥料生产方法

技术领域

本发明涉及一种微生物的发酵培养方法，具体涉及一种芽孢杆菌的发酵培养方法、及由该发酵液制得微生物肥料的方法。

背景技术

近年来，极端天气状况频发，尤其是干旱气候，全国各地几乎都不能幸免。2009年连续3个多月，华北、黄淮、西北、江淮等地15个省、市未见有效降水，冬小麦告急，大小牲畜告急，农民生产生活告急；2011年，受长江中下游50年来最严重旱情影响，长江水位走低，使上海在5月份出现了原本在冬季才会出现的罕见严重咸潮，部分供水区域因之告急。干旱对农业生产的影响显而易见，虽然国家出台各种有效措施来平抑物价过快上涨，但是旱情犹如“蝴蝶效应”，对主要农产品价格的推高作用逐渐显现。此外，全国大范围推广节水灌溉农业，“十二五”规划中已明确，未来五年将完成70％以上的大型灌区和50％以上的重点中型灌区续建配套和节水改造任务；净增农田有效灌溉面积4000万亩；新增高效节水灌溉面积5000万亩。但是如何提高土壤田间持水量和植物对水分的利用率，仅仅靠改变灌溉方式是不够的。所以开展抗旱、保水农业研究不仅势在必行，而且已经迫在眉睫。

γ-聚谷氨酸(简称γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物，分子量分布在100kDa到10000kDa之间。γ-PGA具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的保水剂。另外，γ-PGA可以作为植物增产营养素，在淹水条件下，γ-PGA会在植株根毛表层形成一层薄膜，不但具有保护根毛的功能，更是土壤中养份、水份与根毛亲密接触的最佳输送平台，能很有效率的提高肥料中养分的溶解、存储、输送与吸收；阻止硫酸根、磷酸根、草酸根与金属元素产生沉淀作用，使作物能更有效的吸收土壤中磷、钙、镁及微量元素；促进作物根系的发育，加强抗病性。γ-PGA还可以平衡土壤酸碱值，避免长期施用化学肥料所造成的酸性土质；有效螯合有毒重金属；增强植物抗病及抗逆能力；可使茶叶、瓜果、蔬菜等农产品快速增产，增产量可达10～20％。

肥料与保水剂复合一体化使用是水肥调控的重要技术，是肥料研究的国际前沿。目前，多数研究集中在将保水剂与无机矿物和尿素结合，制成保水缓控释化肥。毛小云等利用淀粉-丙烯酸盐接枝共聚物和无机矿物复合，制成有机-无机复合保水肥，不仅有助于作物对营养的吸收，更减少了矿质元素的淋溶作用。有机抗旱肥料BGA是一种由城乡有机废弃物经资源化处理后制得的有机肥料，其抗旱机理主要是增加土壤中有机碳，促进了土壤中有机无机复合胶体的形成，以胶体的吸水性来提高土壤中水分含量。对于保水型生物肥料的研究，在国内外都尚少。但是农业生产长期过分依赖于化学肥料，造成大量不可再生能源的浪费，农田土质变坏，肥力下降，农作物产品残留、品质降低以及食品和环境污染的问题日益突出。因此，单一依靠保水剂与无机肥料结合生产保水缓控释肥料，不能满足可持续农业和绿色农业发展的要求。

γ-PGA生产菌株按照是否需要外源性的L-谷氨酸，可分成L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非依赖型。我国目前的研究对象主要是L-谷氨酸依赖型菌株。L-谷氨酸作为γ-PGA发酵生产的前体，对发酵液中γ-PGA的积累具有重要的影响。目前，产γ-PGA的菌株主要集中在芽孢杆菌不同菌株之间，如枯草芽孢杆菌IFO3335和TAM-4以及部分短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株。γ-PGA产生菌大部分是从豆制品等材料中获得的芽孢杆菌，而从土壤和氨基酸废料堆中筛选的并不多见。中国专利申请2010102585 17.2公开了一种从土壤中分离得到的死谷芽孢杆菌以及其发酵培养方法，用这种方法得到的发酵液中菌体含量≥1×10⁹个/mL。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是提供一种可以得到更大菌体含量的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法。

本发明的技术方案是，一种死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，包括种子培养和发酵培养其特征在于：在所述发酵培养工序中，培养基的初始pH为6.0～7.0，菌株温度30℃～37℃，氮源用量为5～10g/L，碳源用量为15～25g/L。

所述死谷芽孢杆菌的培养基采用常规的基础培养基，一般为谷氨酸钠10g/L，MgSO4·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，K₂HPO₄ 2g/L。上述死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3478(在专利申请201010258517.2中首次提及)。主要生物学特性为菌株为长杆状，有荚膜和鞭毛，芽孢中生，革兰氏染色为阳性，具有葡萄糖产酸，好氧，接触酶阳性，石蕊牛奶还原阳性，明胶液化，分解酪素，不分解酪氨酸。

根据本发明所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，优选的是，所述氮源为酵母膏。

根据本发明所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，优选的是，所述碳源为蔗糖或糖化玉米粉。

优选的是，所述发酵培养工序中的装液量为20％～30％。该装液量可以更好地保持发酵罐的通气性。

优选的是，48h发酵液中活菌或芽孢为3.4～5.1×10¹⁰CFU/mL以上。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用上述死谷芽孢杆菌生产微生物肥料的方法。

一种含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，包括原料的处理和菌剂与原料的混合，该方法包括以下步骤：

(1)原料的处理：将水解渣敲碎成粉末或小颗粒，与碱性物质混合，使处理后的水解渣原料pH达到5.5-8.0；

(2)采用上述的发酵培养方法发酵死谷芽孢杆菌，得到的发酵液用吸附介质吸附后得到菌剂，与步骤(1)所得的水解渣按菌剂∶水解渣＝1-30∶100的质量比混合。

上述步骤(1)用碱性物质的作用是调节水解渣原料的pH值，使其达到微生物肥料的范围。该碱性物质优选为石灰、KOH或NaOH的一种。

根据本发明所述的含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，优选的是，所述水解渣为氨基酸生产过程的发酵产物。

进一步地，所述步骤(2)中还可加入无机肥料和/或微量元素肥料。如果需要制造更高养分含量或者含微量元素的微生物肥料，可以在上述得到的微生物肥料中加入无机肥料或微量元素肥料，也可以同时加入无机肥料和微量元素肥料。

氨基酸生产过程中的发酵产物水解渣(水解滤饼)由于其强酸性，随水流失或弃于土壤会造成水质、土壤酸化而造成污染，国家严禁排放；同时强酸性亦使得其无法有效利用而造成积压。由于其产出量大，堆放场地大，是长期困扰氨基酸生产企业的难题。经过检测，水解渣除酸性强外，还含有大量的有机质、谷氨酸、腐殖酸和中微量元素，其中谷氨酸是生产γ-PGA的重要前体，因此，氨基酸水解渣是生产保水型微生物肥料的优质原料。

本发明的技术原理是利用可产γ-PGA菌株发酵特性获得大量菌体，与其他微生物复合成为保水型复合微生物菌剂，再与含有大量谷氨酸的有机原料混合成为保水型复合微生物肥料。施入土壤后，除保水型微生物肥料中本身所含γ-PGA外，微生物在土壤中利用有机物料以及养分继续代谢过程，尤其是位于根际的微生物。这些微生物活动不断产生γ-PGA，从而增加土壤保水抗旱能力。

本发明的发酵培养方法通过优化发酵培养参数，可使发酵产生最大菌量，较以往芽孢杆菌48h发酵菌株量大约为1.0～5.0×10⁹CFU/mL增加了一个数量级。上述保水型复合微生物肥料是根据根际土壤微生态学和植物营养学原理，以产γ-PGA菌株为核心，与多种有益微生物(固氮菌、解磷菌、钾细菌)复合，以优质氨基酸有机质为载体，再配以少量的无机养分及微量元素加工而成的具有无污染、无公害，适于生产绿色食品的新型抗旱肥料。

本发明较现有技术的优势在于：

(1)从氨基酸废料堆及其堆放土壤中筛选产γ-PGA菌株，并首次用于生产氨基酸微生物肥料，使微生物在与自然态相似的环境中定殖，解决了菌株难以存活的问题，也为微生物肥料生产提供了新的菌种资源。

(2)通过对菌株PGA23发酵条件优化，保证菌株发酵过程可以高效获得大量菌体。以大量菌株为基础，确保在肥料施入土壤后有充足的微生物进行代谢活动以获得γ-PGA。

(3)以富含谷氨酸的水解渣作为生产保水型复合微生物肥料的原料，确保微生物有充足谷氨酸前体利用。肥料中所含微生物在土壤中，可以利用谷氨酸为前体，代谢产生γ-PGA，从而达到增加土壤水分含量，抗旱保水的作用。

(4)保水型复合微生物肥料养分全面，不仅供给作物适量的无机营养，而且提供有效活菌、有机质、氨基酸、腐殖酸以及矿质元素。在为作物生长提供全面营养物质的同时，还起到抗旱、防病、促生和改良土壤的作用。

(5)以味精生产废料作为复合微生物原料，为氨基酸废料资源化提供了一条崭新的处置途径，而且可获得附加值较高的保水型复合微生物肥料，从而降低了水解渣处置成本。

附图说明

图1是氨基酸水解渣的制造工艺流程图。

图2是保水型微生物菌剂的制备流程图。

图3是粉状保水型微生物肥料的制备流程图。

具体实施方式

实施例1

1、菌株发酵：基础培养基为谷氨酸钠10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，K₂HPO₄ 2g/L时，死谷芽孢杆菌菌株发酵条件为：温度32℃，装液量为20％，培养基初始pH为6.5，以酵母膏为氮源，用量为5g/L，糖化玉米粉为碳源，用量为15g/L时发酵，发酵48h后可获得菌量为3.9×10¹⁰CFU/mL；

2、氨基酸废料取样：水解渣取自河南省莲花氨基酸股份有限公司；

3、pH调理：在水解渣中加入氢氧化钾8％混合，用链条粉碎机碎至80目后堆放8-12h，让其充分反应。处理后水解渣的基本性状见表1；

表1 处理后水解渣(粉状)的基本性状

4.倒翻：用铲车或人工翻堆，让反应后的物料温度冷却到常温，使其pH达到5.5-8.0；

5、保水型复合微生物菌剂制备：将死谷芽孢杆菌利用发酵设备单独发酵生产，发酵后的菌液分别用80目的稻壳粉按菌液∶稻壳粉＝1∶3的质量比例吸附，粉碎至80目；

6、配料：在容量为500kg的搅拌机中按照表2的原料配比进行准确配料；

表2 保水型复合微生物肥料的生产配料

原料	水解渣	菌剂	尿素	磷酸一铵	氯化钾	硫酸锌	硼砂	硫酸镁
									配比(％)	65.0	5.0	15.0	2.5	10.0	1.0	0.5	1.0

7、混合：搅拌机搅拌10-15min，让物料充分混合；

8、粉碎：将混合的物料进行粉碎、细度达到80目；

9、分装入库：用塑料袋分装、每袋5kg，用25kg的编织袋作为外包装，每包5袋；

10、成品基本性状见表3，重金属含量远远低于复合微生物肥料的行业标准，故而未测定。

表3 保水型复合微生物肥料检测结果

实施例2

菌株发酵条件为温度30℃，装液量为25％，培养基初始pH为7.0，以酵母膏为氮源，用量为10g/L，糖化玉米粉为碳源，用量为20g/L时发酵，发酵48h后可获得菌量为4.5×10¹⁰CFU/mL；

水解渣中加入6％的氢氧化钾混合，用链条粉碎机粉碎至100目后堆放15h，让其充分反应；

微生物菌剂制备中，稻壳粉细度为100目，菌剂与稻壳粉的吸附质量比例是1∶5。

菌剂的加入比例为6％，水解渣加入比例为64％，皆为占最终成品肥料的质量百分比。其他同实施例1。

实施例3

水解渣中加入6％的氢氧化钾混合，用链条粉碎机粉碎至120目后堆放8-12h，让其充分反应；

保水型复合微生物菌剂制备中，稻壳粉细度为120目，菌液与稻壳粉的吸附比例是1∶4。

菌剂的加入比例是8％，水解渣加入比例为63％，尿素的加入比例为14％，皆为占最终成品肥料的质量百分比。其它同实施例1。

实施例4

死谷芽孢杆菌发酵条件为：温度36℃，装液量为32％，培养基初始pH为6.8，以酵母膏为氮源，用量为7g/L，蔗糖为碳源，用量为25g/L时发酵，发酵48h后可获得菌量为3.5×10¹⁰CFU/mL；

水解渣中加入占水解渣质量比10％的石灰混合，用链条粉碎机粉碎至120目后堆放20h，让其充分反应；

保水型复合微生物菌剂制备中，吸附介质为100目的草炭，菌液与草炭的吸附质量比例是1∶3.5。

菌剂的加入比例是12％，水解渣加入比例为88％，皆为占最终成品肥料的质量百分比，不添加无机肥料和微量元素肥料。其它同实施例1。

实施例5

死谷芽孢杆菌发酵条件为：温度37℃，装液量为30％，培养基初始pH为7.0，以酵母膏为氮源，用量为10g/L，蔗糖为碳源，用量为20g/L时发酵，发酵48h后可获得菌量为6.2×10¹⁰CFU/mL；

水解渣中加入占水解渣质量比12％的石灰混合，用链条粉碎机粉碎至120目后堆放18h，让其充分反应；

菌剂的加入比例是20％，水解渣加入比例为80％，皆为占最终成品肥料的质量百分比，不添加无机肥料和微量元素肥料。其它同实施例1。

实施例6

死谷芽孢杆菌发酵条件为：温度31℃，装液量为28％，培养基初始pH为7.0，以酵母膏为氮源，用量为9g/L，蔗糖为碳源，用量为22g/L时发酵，发酵48h后可获得菌量为7.0×10¹⁰CFU/mL；

水解渣中加入占水解渣质量比12％的石灰混合，用链条粉碎机粉碎至100目后堆放18h，让其充分反应；

菌剂的加入比例是15％，水解渣加入比例为80％，硫酸钾的加入比例为5％，皆为占最终成品肥料的质量百分比。其它同实施例1。

试验例

玉米幼苗盆栽试验

试验在温室条件下进行，每盆装土10kg，每盆播6粒露白的玉米种子，待玉米4叶时定植到4棵，30天后收获。肥料在基肥中一次施入，与土拌匀后装入盆中。试验处理为：

处理1：施用微生物肥料基质+常规水分管理；

处理2：施用保水型生物肥料+常规水分管理；

处理3：施用微生物肥料基质+水分胁迫；

处理4：施用保水型生物肥料+水分胁迫；

保水型复合微生物肥料为实例一中所述；微生物肥料基质为高温灭活微生物肥料。各处理N、P、K养分含量一致。其中，水分胁迫条件为减少50％的水分补充量。收获后对作物的幼苗期玉米的生物量、农艺性状进行测定。

表5 不同处理对玉米苗期生物量和农艺性状的影响

由试验结果可知，在相同水分条件下，施用保水型复合微生物肥料与施用微生物肥料基质相比较，可以促进玉米幼苗生长，改善幼苗农艺性状。特别是在水分胁迫条件下，施用保水型复合微生物肥料的玉米幼苗的各项指标高于微生物肥料基质指标，且与常规水分条件下微生物肥料基质处理几乎没有差异或差异不显著。而施用微生物肥料基质并且水分胁迫条件的玉米幼苗生长状况则极为不良。

Claims

1.一种死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，包括种子培养和发酵培养工序，其特征在于：在所述发酵培养工序中，培养基的初始pH为6.0～7.0，菌株温度30℃～37℃，氮源用量为5～10g/L，碳源用量为15～25g/L。

2.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于：所述氮源为酵母膏。

3.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于：所述碳源为蔗糖或糖化玉米粉。

4.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养工序中的装液量为20％～30％。

5.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于：48h发酵液中活菌或芽孢为3.4～5.1×10¹⁰CFU/mL以上。

6.一种含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，包括原料的处理和菌剂与原料的混合，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(2)采用权利要求1-5任一项所述的发酵培养方法发酵死谷芽孢杆菌，得到的发酵液用吸附介质吸附后得到菌剂，与步骤(1)所得的水解渣按菌剂∶水解渣＝1-30∶100的质量比混合。

7.根据权利要求6所述的含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，其特征在于：所述碱性物质为石灰、KOH或NaOH的一种。

8.根据权利要求6所述的含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，其特征在于：所述水解渣为氨基酸生产过程的发酵产物。

9.根据权利要求6所述的含死谷芽孢杆菌的微生物肥料的生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中还可加入无机肥料和/或微量元素肥料。