CN101463333A - 高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法 - Google Patents
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Abstract
一种高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养步骤；其中发酵培养基主要包括5～20g/L碳源、4.0～11.0g/L氮源和无机盐，其pH值为6.0～9.0；在发酵培养过程中还加入0.1～0.9g/L海藻糖。本发明的方法可以显著地提高菌株Bacillus cereusCMCC63305发酵培养效率及存活率。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种高活性蜡样芽孢杆菌的培养和保护方法。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus.cereus简称B.cereus)在自然界分布广泛，常存在于空气、尘埃、土壤、水及植物中，有时正常人的粪便中也能检出。蜡样芽孢杆菌在医药工业上主要制成微生态制剂，用于胃肠道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治，能起到“已病治病，未病防病，无病保健”以及延缓衰老、延年益寿作用。在畜禽养殖业和水产养殖业中，蜡样芽孢杆菌作为饲料添加剂得到了广泛的应用。如在仔猪饲料中加入蜡样芽孢杆菌饲料添加剂能提高仔猪的机体免疫能力，降低仔猪下痢发病率，同时能促进仔猪生长；蜡样芽孢杆菌制剂的使用同样能提高鱼、虾、贝类等的产率、增重率，降低发病率和死亡率。
蜡样芽孢杆菌制剂能发挥这些作用，主要是通过其所含活菌的积极生命活动而达到调节宿主微生态平衡的，因此其中活菌含量的高低始终是评定产品质量的一项关键指标。然而，目前芽孢杆菌制剂普遍存在产品有效期不长、货架期短的问题，当前所见报导就是通过干燥过程中减小压力来解决。由于少数蜡样芽孢杆菌是日常食物中的污染源，国内外众多学者对能产生有毒物质的蜡样芽孢杆菌进行了研究。Ynte P.de Vries等通过关键因子的基因暂时表达研究了Bacillus cereu ATCC14579在特定条件下的生长和芽孢形成情况，并探讨了谷氨酸盐的加入对菌的生长、芽孢形成及孢子特性的影响，发现谷氨酸盐能加速芽孢完全形成，也有研究表明：蜡样芽孢杆菌在芽孢形成过程中将谷氨酸盐作为主要能量来源，而且它对芽孢杆菌属的芽孢形成及芽孢特性有很大影响。此外，一些表面活性剂的加入有助于发酵产物的分泌，如Tween20能增加Bacillus cereus APS的环状多肽的产量，Tween80的加入能增加Bacillus thuringiensis的细胞和芽孢浓度。
保护剂在微生物冻干保存过程中应用较多，为防止在冻干过程中蛋白质或细胞的损伤，常通过添加糖、蛋白质、氨基酸等物质，在冷冻干燥过程中保护活细胞，作为支持物和受体在复水过程中为干物质提供一定的骨架结构，可使微生物细胞的成活率接近99.18％。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性蜡样芽孢杆菌的培养及保护方法，以提高活菌存活率，延长产品保质期。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养步骤；其中发酵培养基主要包括5～20g/L碳源、4.0～11.0g/L氮源和无机盐，其pH值为6.0～9.0；在发酵培养过程中还加入0.1～0.9g/L海藻糖，海藻糖的加入量优选为0.3～0.6g/L。
菌种活化时的培养基可采用一般的活化培养基，但为了更适应BacilluscereusCMCC63305菌的活化，本发明经过大量实验优选为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，琼脂10～30，NaCl 4.5～5.5，pH 6.0～9.0，其余为H2O；进一步优选为：牛肉膏4.5～5.5，蛋白胨9.0～11.0，琼脂10～30，NaCl4.5～5.5，pH6.0～9.0，其余为H2O，121℃灭菌。菌种活化时，将菌种接入有菌种活化培养基的平板中，30～40℃培养24h。
种子培养时的培养基可采用一般的种子培养基，但为了更适应BacilluscereusCMCC63305菌的培养，本发明经过大量实验优选为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，NaCl 4.5～5.5，pH 6.0～9.0，其余为H2O。种子培养采用一般的工艺条件，而实验室的小试方法为：于平板取一环单菌落，接入装有100mL培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以150～200r/min，30～40℃培养24h。
发酵培养基中，碳源选自葡萄糖、淀粉或玉米淀粉中的一种或几种；氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏或尿素中的一种或几种；无机盐选自NaCl、MnSO4·H2O、KH2PO4或MgSO4·7H2O中的一种或几种。发酵培养基优选为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，NaCl 4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O0.8～1.5，KH2PO41.5～2.5，MgSO4·7H2O0.4～0.6，pH6.0～9.0，其余为H2O；进一步优选为：牛肉膏4.5～5.5，蛋白胨9.0～11.0，NaCl4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O0.8～1.5，KH2PO41.5～2.5，MgSO4·7H2O0.4～0.6，pH 6.0～9.0，其余为H2O。发酵培养采用常规的发酵培养方法，实验室的小试方法为：以10％接种量将种子培养液接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以150～200r/min，30～40℃培养24h。
在发酵培养过程中加入海藻糖可以显著地提高菌株BacilluscereusCMCC63305的存活率；并且在Bacillus cereusCMCC63305菌株发酵过程中不同的阶段(包括发酵初期、对数生长期和发酵末期)加入海藻糖都能带来极大的效果，如在发酵初期添加0.3～0.6g/L的海藻糖能在180d后使细胞存活率达到81.6％，在对数生长期添加能在90d后使细胞存活率达到69.3％，而在发酵终止时添加海藻糖，也能使发酵液中的活菌数保持在一个稳定的范围内。海藻糖作还能显著增强Bacillus cereusCMCC63305的发酵效率，发酵终止时活菌数可达到2.4×109cfu/mL以上，其活性远高于现有的培养方法。
具体实施方式
培养基：
①号培养基(g/L)：牛肉膏5.0～5.5，蛋白胨8.5～9.0，琼脂19～21，NaCl4.5～5.5，其余为H2O，pH 7.5～8.0，121℃灭菌。
②号培养基(g/L)：牛肉膏5.0～5.5，蛋白胨8.5～9.0，NaCl 4.5～5.5，其余为H2O，pH 7.5～8.0，121℃灭菌。
③号培养基(g/L)：牛肉膏5.0～5.5，蛋白胨8.5～9.0，NaCl 4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O1.0～1.2，KH2PO42.0～2.1，MgSO4·7H2O0.4～0.6，其余为H2O，pH 7.5～8.0，121℃灭菌。
取蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株，于①号培养基中在37℃培养24h，备用。
实施例1：发酵初期添加保护剂海藻糖提高Bacillus cereusCMCC63305发酵效率及存活率
于平板取一环单菌落，接入装有100mL②号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min，37℃培养24h。以10％接种量将种子培养液接入装有100mL③号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min、37℃条件下培养24h，并在发酵初期加入海藻糖0.5g/L。24h后进行平板计数，发酵终止时活菌数达到3.9×109cfu/mL，而未加入海藻糖的发酵液发酵终止时的活菌数为8.9×108cfu/mL。将发酵液于4℃下保存，每隔一段时间测活菌数，用以比较添加海藻糖和未添加海藻糖对菌体活性的保护效果，计算冷藏一段时间后细胞的存活率，存活率＝冷藏一段时间后的活菌数/发酵终止时的活菌数。180d后，添加海藻糖的发酵液中细胞存活率达到81.6％，而未添加海藻糖的发酵液中细胞存活率仅为41.3％。
实施例2：对数生长期添加保护剂海藻糖提高Bacillus cereusCMCC63305存活率
于平板取一环单菌落，接入装有100mL②号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min，37℃培养24h。以10％接种量将种子培养液接入装有100mL③号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min、37℃条件下培养24h，并在对数生长期加入海藻糖0.5g/L。24h后进行平板计数，并将发酵液于4℃下保存，每隔一段时间测活菌数，用以比较海藻糖对菌体活性的保护效果，计算冷藏一段时间后细胞的存活率，存活率＝冷藏一段时间后的活菌数/发酵终止时的活菌数。90d后添加海藻糖的发酵液中细胞存活率达到69.3％，而未添加海藻糖的发酵液中细胞存活率仅为48.4％。
实施例3：发酵终止时添加保护剂海藻糖提高Bacillus cereusCMCC63305存活率
于平板取一环单菌落，接入装有100mL②号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min，37℃培养24h。以10％接种量将种子培养液接入装有100mL③号培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以170r/min、37℃条件下培养24h后进行平板计数，加入海藻糖0.5g/L，此时的活菌数为8.7×108cfu/mL；将发酵液于4℃下保存，每隔一段时间测活菌数，用以比较海藻糖对菌体活性的保护效果。180d后，含有海藻糖的发酵液中细胞存活率为52.1％高于未添加海藻糖的发酵液中细胞存活率41.3％。
结论：海藻糖对Bacillus cereusCMCC63305菌株具有明显地促进培养和保护作用，在4℃下保存后，在发酵初期添加海藻糖能在180d后使细胞存活率达到81.6％，在对数生长期添加能在90d后使细胞存活率达到69.3％，而在发酵终止时添加海藻糖，也能使发酵液中的活菌数保持在一个稳定的范围内。而在发酵初期添加的效果最好。
Claims (7)
1、一种高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法，其特征在于包括菌种活化、种子培养和发酵培养步骤；其中发酵培养基主要包括5～20g/L碳源、4.0～11.0g/L氮源和无机盐，其pH值为6.0～9.0；在发酵培养过程中还加入0.1～0.9g/L海藻糖。
2、根据权利要求1所述的培养及保护方法，其特征在于海藻糖的加入量为0.3～0.6g/L。
3、根据权利要求1所述的培养及保护方法，其特征在于发酵培养基中，碳源选自葡萄糖、淀粉或玉米淀粉中的一种或几种；氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏或尿素中的一种或几种；无机盐选自NaCl、MnSO4·H2O、KH2PO4或MgSO4·7H2O中的一种或几种。
4、根据权利要求3所述的培养及保护方法，其特征在于发酵培养基为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，NaCl 4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O0.8～1.5，KH2PO4 1.5～2.5，MgSO4·7H2O 0.4～0.6，pH6.0～9.0，其余为H2O。
5、根据权利要求1所述的培养及保护方法，其特征在于菌种活化时的培养基为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，琼脂10～30，NaCl 4.5～5.5，pH6.0～9.0，其余为H2O。
6、根据权利要求1所述的培养及保护方法，其特征在于种子培养时的培养基为(g/L)：牛肉膏4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，NaCl 4.5～5.5，pH6.0～9.0，其余为H2O。
7、根据权利要求1所述的培养及保护方法，其特征在于发酵培养后的活菌数达到2.4×109cfu/mL以上。
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