CN103555602A

CN103555602A - 一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌lct-bc235菌株

Info

Publication number: CN103555602A
Application number: CN201210380072.4A
Authority: CN
Inventors: 刘长庭; 苏龙翔; 方向群; 王俊峰; 李天志; 郭英华; 常德; 王雅娟; 陈振鸿; 姜学革
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN103555602B

Abstract

本发明涉及空间环境下的蜡状芽孢杆菌及其基因组序列。既往研究发现空间环境能够影响微生物的许多特征，例如生长速率、细胞形态、细胞代谢水平、生物被膜的产生、毒力和耐药性的增加或者降低。本发明利用太空特殊环境，通过搭载神舟八号飞船将蜡状芽孢杆菌送入太空，历经398小时、1100万公里的飞行返回地面后进行了表型相关实验，证明了空间环境下的菌株存在明显的变化。随后对其进行了基因组测序、转录组测序、和蛋白质组学分析，旨在发现发生这些变化的潜在机制及其应用。随着对这些问题的深入研究，有利于我们发现和了解空间环境对细菌的影响致病性和耐药性改变的机制，为保障航天员安全提供了理论基础。

Description

一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌生物特性、全基因组测序、转录组测序和差异蛋白组学分析。

背景技术

随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领域。微生物是自然环境中的一部分，其存在于空气、水、土壤等生物圈的各个部分。因此，人类的空间活动不可避免的将微生物也带上了宇宙空间。尽管外层空间具有极端和复杂的环境，这些微生物都能够适应这些诸如微重力、宇宙射线、温度、压力等的改变并表现出相应的形态和生理学的变化。尤其是有研究发现在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强；肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。目前，在空间站中已检测出包括肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌和肠球菌等多种细菌。对这些细菌进行深入研究有助于了解这些细菌的致病力和耐药性的改变机制，为载人航天提供医学保障基础。

蜡样芽胞杆菌是革兰氏阳性杆菌，好氧或兼性厌氧并能够形成孢子。蜡状芽孢杆菌是一种条件致病菌，其能够产生相关导致呕吐的毒素和三种不同的肠毒素，引起呕吐综合征和腹泻病造成食物中毒，是一种潜在的会导致宇航员急性胃肠道疾病的重要致病菌。尤其是空间飞行时，航天员所携带的食物大多是由从地球出发前制作的罐头食品，极容易受蜡状芽孢杆菌污染。一旦宇航员感染此种疾病我们尚未有很好的认识。因此，通过表型研究空间环境下的突变株，并利用基因组、转录组、蛋白质组三大组学研究方法，全面研究该菌株对空间环境的适应性变化，关注其致病性、耐药性的变化，为预防感染性疾病的发生奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种太空环境中的蜡状芽孢杆菌菌株LCT-BC235。通过表型研究，全基因组测序，并结合转录组学和蛋白组学阐明该细菌对空间的变化机制。

本发明提供的菌株LCT-BC25，其保藏号为CGMCC NO.6516。

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其表型特征为：革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列；与地面对照株相比较，其耐药性没有发生明显变化；其生长速率减慢；生化特征为硫酸四癸钠反应、四氮唑紫反应阴性。

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进行全基因组测序，得到其全基因组序列及注释内容。LCT-BC235的全基因组鸟枪法测得序列总长度为5,514,728bp，平均GC含量为35.32％。其序列包含34个contigs，能够组装成为5个scaffolds。用Glimmer version3.02软件预测出5,263个编码基因。对该菌株的序列进行SNP分析发现，蜡状芽孢杆菌LCT-BC235有三个SNP。分别是UWlGL000001，UWlGL002432，UWlGL005263。然而，其中两个为基因间区SNP，一个为同义SNP。此同义SNP是一个保守的假定蛋白。

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，通过转录组测序鉴定获得差异表达基因。结果有624个上调基因和813个下调基因。对这些基因进行GO功能富集分析显示，具有明显差异表达的基因的生物学功能主要与跨膜转运和离子跨膜转运有关(P＝0.04239)。对这些基因进行通路富集分析发现其差异表达基因主要与与磷酸转移酶系统、氧化磷酸化过程的pathway有关。

所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，利用蛋白组学鉴定获得差异表达蛋白分子。结果得到8个上调表达的蛋白和73个下调表达的蛋白。对这些差异表达的基因进行GO功能富集分析和pathway富集分析发现这些差异蛋白主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关。

附图说明

图1蜡状芽孢杆菌LCT-BC235革兰氏染色

图2蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进化分析

图3蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC235的biolog生化特征

图4蜡状芽孢杆菌空间诱变株LCT-BC235与地面对照株LCT-BC244的生长曲线比较

图5蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的转录组基因覆盖度

图6蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的转录组差异表达基因

图7蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的蛋白组差异表达蛋白

具体实施方式

下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本项目研究人员采用自制的样本管搭载细菌，依据：HYK-GF15《航天员系统载人运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件》，该样本管通过了冲击、快速减压、震动实验。褪色沙雷菌接种至样本管中，培养基为LB琼脂半固体培养基。然后封装入代号为20111001的样品包(材料为蓝色美塔斯阻燃布料)。经过神舟八号搭载，获得太空环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235菌株。

具体实施实例一、LCT-BC235的表型研究：

(1).菌种选择：蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，保藏号为CGMCCNO.6528

(2).形态学：原样品进行稀释涂布，进行革兰氏染色。LCT-BC235为革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列，如图1。

(3).LCT-BC235菌株16s rDNA鉴定及进化分析

16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经扩大培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下：

SgF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG

SgR：TAGGGTTACCTTGTTACGACTT

16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABl3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxonserver2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega5.0软件clusterW多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果显示LCT-BC235属于蜡状芽孢菌。对其进行进化分析如图2所示。

(4).耐药性检测：配制菌悬液后稀释涂布，粘贴药敏片，选择的抗生素为青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、复达欣(头孢他啶)(头孢噻甲羧肟)、菌必治(头孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、环丙沙星(奔克)(悉复欢)(丙氟哌酸)、洁霉素(林可霉素)、万古霉素、复方新诺明、氯霉素、舒普深(先锋必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、链霉素、美满霉素(二甲胺四环素)(米诺环素)、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培养24h后观察抑菌圈大小。结果发现与地面对照株相比较，蜡状芽孢杆菌LCT-BC235的耐药性没有发生明显变化。

(5).溶血试验：采用点种法，将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上，培养温度37℃，培养24小时后观察结果显示LCT-BC235无溶血圈出现。

(6).生化代谢(Biolog)实验：制备菌悬液，接种至Biolog96孔板，37℃培养24-48h观察结果(见图3)。该菌株生化代谢较地面株差别较大如表1。

表1蜡状芽孢杆菌LCT-BC235的biolog生化特征

Characteristics	LCT-BC25	LCT-BC244
				空间菌株	地面对照菌株
糊精	+	+(w)
			D-纤维二糖	+	+(w)
龙胆二糖	+	+(w)
			1％的NaCl	+(B)	+(Y)
4％的NaCl	+(B)	+(R)
			1％乳酸钠	+(B)	+(Y)
夫西地酸	+(w)	+
			D-丝氨酸	+(B)	+(R)
D-甘露糖醇	+(B)	+(Y)
			D-葡萄糖-6-磷酸	+(B)	+(R)
D-果糖-6-磷酸	+(B)	+(R)
			醋竹桃霉素	+(w)	+(R)
利福霉素	+(B)	+(w)(B)
			林可霉素	+(w)	+
硫酸四癸钠 -		+
			万古霉素	+(w)	+
四氮唑紫 -		+
			亚碲酸钾	+(B)	+(R)
氨曲南	+(B)	+(R)

+表示阳性；-表示阴性；w表示弱阳性；Y代表黄色；B表示蓝色；R表示棕色

(7).生长曲线测定：菌株活化后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据。将所得到的OD值进行平均值的计算，然后绘制曲线。蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC235与地面对照菌株LCT-BC244比较，其生长曲线出现明显的差异，提示经过空间诱变后蜡状芽孢杆菌的生长速率减慢，如图4。

具体实施实例二、蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235全基因组测序：

采用高通量Solexa测序技术对该样品的DNA进行Paired-End测序。首先提取细菌的基因组DNA，离心方法收集蜡状芽孢杆菌LCT-BC235菌体，经过重悬、裂解、酚氯仿抽提、异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤、RNase去除RNA和溶解基因组DNA等步骤获得LCT-BC235的基因组DNA，并检测其纯度使之符合建库指标。采用超声法Covaris将大片段基因组DNA随机打断并产生一系列DNA片段；然后用T4DNAPolymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段；建立350bp的小片段文库和6000bp的大片段文库。对测序得到的原始数据进行过滤及统计；运用SOAP denovo V1.05软件和SOAPaligner/soap2软件对处理后的reads数据进行组装。并对基因组和基因区覆盖度进行评价；采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列并将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。LCT-BC235的全基因组鸟枪法测得序列总长度为5,514,728bp，平均GC含量为35.32％。其序列包含34个contigs，能够组装成为5个scaffolds。用Glimmer version3.02软件预测出5,263个编码基因。

对该菌株的序列进行SNP分析发现，蜡状芽孢杆菌LCT-BC235有三个SNP。分别是UWlGL000001，UWlGL002432，UWlGL005263。然而，其中两个为基因间区SNP，一个为同义SNP。此同义SNP是一个保守的假定蛋白，如表2。

表2蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的SNP分析

具体实施实例三、蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的转录组：

提取样品总RNA后，用试剂盒去除rRNA后用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRN A打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase l合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illu mina HiSeq2000进行测序。结果显示基因覆盖度在60％的基因有2,802个占全部基因的64％(如图5)。使用RPKM法(Reads Per Kb per Million reads)对基因进行表达量的计算，其公式为：

RPKM = \frac{10^{6} C}{NL / 10^{3}}

依据各个基因的表达量，根据大于2倍为具有差异表达的基因。结果有624个上调基因和813个下调基因(如图6)。对这些基因进行GO功能富集分析显示，具有明显差异表达的基因的生物学功能主要与跨膜转运和离子跨膜转运有关(P＝0.04239)。对这些基因进行通路富集分析发现其差异表达基因主要与与磷酸转移酶系统、氧化磷酸化过程的pathway有关。

具体实施实例四、蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的蛋白质组学：

我们利用iTRAQ相对定量技术对蜡状芽孢杆菌空间诱变株和地面对照株进行蛋白质组学研究。首先，从样品中提取蛋白，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定。等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳。使用胰蛋白酶酶解蛋白成为肽段。使用iTRAQ试剂标记肽段。将标记后的肽段进行等量混合对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(StrongCation Exchange Choematography，SCX)进行预分离进行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析。对于质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表。其次建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。共鉴定到1269个蛋白，对这些蛋白进行功能分析发现代谢过程(40.75％)、细胞的生长和修复(33.04％)、对刺激的反应(5.02％)、定位(4.8％)的功能有关(图7)。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，当满足蛋白丰度差异倍数1.2倍以上且统计检验值P-value小于0.05时，从而获得差异表达的蛋白。结果得到8个上调表达的蛋白和73个下调表达的蛋白(图7)。对这些差异表达的基因进行GO功能富集分析和pathway富集分析发现这些差异蛋白主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关(表3)。

表3蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235差异表达蛋白的富集功能分析

生物学功能	P-value
		蛋白质的代谢过程	0.00099862
金属硫簇组装	0.002539985
		翻译	0.004739562
细胞氨基酸代谢过程	0.007531387
		细胞胺的代谢过程	0.007531387
细胞的氨基酸和衍生的代谢过程	0.01048512
		碳水化合物的代谢过程	0.01104745
细胞碳水化合物的代谢过程	0.01362092
		分解过程	0.01515452
细胞内蛋白质的代谢过程	0.01519705
		羧酸代谢过程	0.01741586

[0049]

有机酸代谢过程	0.0184969
		含氧酸的代谢过程	0.0184969
tRNA的氨酰化蛋白翻译	0.02079925
		氨基酸活化	0.02079925
tRNA的氨酰化	0.02079925
		蜂窝酮的代谢过程	0.02081777
胺的代谢过程	0.02660607

本发明的特点和应用价值：本研究是我国第一次利用自己的技术将微生物送入太空，并发现了在空间环境下蜡状芽孢杆菌发生了明显的表型变化，这一新菌株的成功建立有助于深入探讨空间效应对微生物的影响。同时，这一菌株的序列已经测通，为揭示这些潜在的生物学变化提供了可能。我们将基因组、转录组和蛋白组贯穿起来研究能够更好地揭示相关的机制，为我国载人航天事业奠定基础。

关于保藏的LCT-BC235菌株的说明

A.菌种的保藏单位名称和地址

名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

B.交机构保藏的日期

2012年9月5日

C.保藏机构给予的保藏号

CGMCC No.6516

D.分类命名

蜡状芽孢杆菌Bacillus Cereus 。

Claims

1.一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其保藏号为：CGMCCNO.6516。

2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其表型特征为：革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列；与地面对照株相比较，其耐药性没有发生明显变化；该菌的生长速率减慢；生化特征为硫酸四癸钠反应、四氮唑紫反应阴性。

3.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进行全基因组测序，得到其全基因组序列及注释内容。

4.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，通过转录组测序鉴定获得差异表达基因。

5.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，利用蛋白组学鉴定获得差异表达蛋白分子。