CN103184176B - 一株太空环境下的褪色沙雷菌lct-sm166菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株以及其生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面褪色沙雷菌比较分析鉴定获得的功能序列和分子，有助于研究太空环境对微生物的作用和机制，保障太空环境安全；有助于发现新的毒力和耐药靶点，为临床感染性疾病提供新的治疗靶点；其代谢产物灵菌红素具有抗肿瘤、免疫抑制作用，具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种新的微生物菌株以及其生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，利用生物信息学技术获得其比较基因组学信息、转录组测序分析的差异表达基因以及差异蛋白组学鉴定的蛋白质分子。
背景技术
随着我国神舟飞船和空间站等庞大航天计划的实施，载人航天的医学保障需求日益突出。航天活动中，一些微生物可随人体或飞行器进入太空。在空间站中已检测出包括肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌和肠球菌等多种细菌。空间自然环境具有地面环境中所不存在的一些特殊环境因子，包括失重、高真空、极端温度、弱磁场和粒子辐射等。这些特殊环境因子可影响微生物群区的生物习性，并导致表型改变甚至产生基因突变，使一些机会致病菌在毒力和侵袭力等方面发生改变，有研究发现在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强；肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。因此迫切需要进行微生物尤其是条件致病菌的空间研究。
褪色沙雷菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界，是水和土壤中的常居菌群。褪色沙雷菌也是临床常见的条件致病菌，近几年在临床的检出率增高，而且因为广谱抗生素的广泛使用，多重耐药、泛耐药甚至全耐药的菌株显著增多，临床抗感染治疗手段已十分有限。既往针对该菌生物学特性、致病性等研究均局限于地面。对空间环境下褪色沙雷菌的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株， 通过表型研究揭示其生物学特性及致病性变化，以基因组学法明确空间环境对细菌遗传性状的作用，结合转录组学和蛋白组学，研究细菌对空间环境适应性变化的机制。
本发明提供的菌株LCT-SM166，其保藏号为CGMCC NO.6528。
所述的一株褪色沙雷菌，其特征在于：革兰氏染色阴性，形态呈杆状、单个、无芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性无明显变化；生长速度的差异从生长曲线看不明显；同地面株均无溶血反应；Biolog反应板生化特征结果显示同地面株比较可以利用D-棉子糖。
所述的LCT-SM166菌株，通过全基因组测序方法获得太空环境下的该菌株的突变基因是：SNP差异分析显示杂合SNP位点有58个，其中有意义的有13个。
所述的LCT-SM166菌株，利用转录组测序鉴定获得该菌株的差异表达基因有6个上调，67个下调。
所述的LCT-SM166菌株，采用差异蛋白组学方法鉴定得到该菌株的差异表达蛋白分子，其中上调的有21个，下调的90个。其中变化超过两倍以上的有12个上调的蛋白质分子，70个下调的蛋白质分子。其GO功能富集分析显示主要同翻译因子活性和核酸连接有关，Pathway富集分析显示主要同丙酮酸盐代谢有关。
所述的LCT-SM166菌株，存在灵菌红素合成基因(pigB-pigP)，其编码的代谢产物灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。此外有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性具有抗肿瘤、免疫抑制作用。
附图说明
图1为褪色沙雷菌LCT-SM166菌株革兰氏染色
图2为褪色沙雷菌LCT-SM166菌株Biolog生化特征
图3为褪色沙雷菌LCT-SM166菌株生长曲线
图4为褪色沙雷菌LCT-SM166的GC含量与Depth关联分析图
图5为褪色沙雷菌样品LCT-SM166的15-mer分析图
图6为褪色沙雷菌LCT-SM166的转录组基因覆盖度
图7为褪色沙雷菌LCT-SM166的转录组差异表达基因
图8为褪色沙雷菌LCT-SM166的蛋白质组差异表达蛋白
具体实施方式
下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本项目研究人员采用自制的样本管搭载细菌，依据：HYK-GF15《航天员系统载人运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件》，该样本管通过了冲击、快速减压、震动实验。褪色沙雷菌接种至样本管中，培养基为LB琼脂半固体培养基。然后封装入代号为20111001的样品包(材料为蓝色美塔斯阻燃布料)。经过神舟八号搭载，获得太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株。
具体实施实例一、LCT-SM262的表型特征分析：
(1).形态特征：取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I(结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III(酒精)2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番红)2滴滴在涂面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(100×)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1。
(2).菌株的16s rDNA鉴定：
16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经扩大 培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下：
SgF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG
SgR：TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABI3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega5.0软件clusterW多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果：16s rDNA鉴定结果为该菌株属于褪色沙雷菌。
(3).耐药性检测：经过16s rDNA测序分析后，取出这些单菌的斜面，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1.5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107～108。吸取备好的菌悬液100ul进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步(粘贴药敏片)。粘贴药敏片，选择的抗生素为青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、复达欣(头孢他啶)(头孢噻甲羧肟)、菌必治(头孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、环丙沙星(奔克)(悉复欢)(丙氟哌酸)、洁霉素(林可霉素)、万古霉素、复方新诺明、氯霉素、舒普深(先锋必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、链霉素、美满霉素(二甲胺四环素)(米诺环素)、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。将平板放置在37℃下培养18～24h培养24h后观察抑菌圈大小。该菌株耐药性未发现明显变化
(4).溶血试验：采用点种法，将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上，培养温度37℃，培养几天后观察结果。该菌株未见溶血反应。
(5).生化代谢(Biolog)实验：菌悬液制备，取出菌株的斜面， 用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约107～108；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和48h进行观察，并记录结果，见表1、图2。
表1褪色沙雷菌LCT-SM166的Biolog反应板结果
| LCT-SM166 | LCT-SM213 | |
| 棉子糖 | + | - |
| N-乙酰神经氨酸 | + | +/- |
| 右旋甘露醇 | + | +/- |
(6).生长曲线测定：菌株活化后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据。将所得到的OD值进行平均值的计算，然后绘制曲线，见图3。LCT-SM166无生长速度的差异。
具体实施实例二、LCT-SM166的基因组及比较基因组学：
培养褪色沙雷菌并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文库，利用Illumina的Genome Analyzer II测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析；采用G|immer3.0软件注释基因并分析SNP、Indel、基因重排和结构变异等。LCT-SM262的基因测序质控见图4、图5。SNP改变基因见表2，Indel分析未发现明显变化。此外太空环境下的LCT-SM166存灵菌红素合成基因(pigB-pigP)，其编码的代谢产物灵菌红素是一类含 甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性。因此该菌在生物工程方面具有潜在的应用前景。
表2褪色沙雷菌LCT-SM166的SNP位点对应基因功能注释
| 基因ID | 基因长度(aa) | 注释库ID |
| UUSGL000001 | 171 | gi|290508598|ref|ZP_06547969.1| |
| UUSGL000004 | 972 | gi|333928609|ref|YP_004502188.1| |
| UUSGL000125 | 840 | gi|157371693|ref|YP_001479682.1| |
| UUSGL000221 | 2022 | gi|157371606|ref|YP_001479595.1| |
| UUSGL000785 | 183 | gi|270262353|ref|ZP_06190625.1| |
| UUSGL003376 | 540 | gi|157368519|ref|YP_001476508.1| |
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| UUSGL003980 | 711 | gi|293394701|ref|ZP_06638993.1| |
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具体实施实例三、LCT-SM262菌株的转录组测序分析：
提取LCT-SM262菌株总RNA后，用试剂盒去除rRNA后。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq2000进行测序。将原始序列数 据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因、筛选差异基因表达模式聚类分析、GO功能分析、KEGG Pathway分析和预测新转录本分析等。分布基因覆盖度见图6。差异表达基因数量见图7，其中|log2Ratio|≥2的差异基因见表3。
表3褪色沙雷菌LCT-SM166的差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥2)
具体实施实例四、LCT-SM262菌株差异蛋白组学分析：
从LCT-SM262菌株样品中提取蛋白；对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白；用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定；等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳；酶解蛋白；用iTRAQ试剂标记肽段；将标记后的肽段进行等量混合；对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation Exchange Choematography，SCX)进行预分离；进行液相串联质谱(liquid chromatography coUpled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定；最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，从而获得一些感兴趣的重要蛋白。对这些蛋白进行功能分析。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，当满足蛋白丰度差异倍数1.2倍以上且统计检验值P-value小于0.05时，从而获得差异表达的蛋白。对这些差异表达的基因进行GO功能富集分析和pathway富集分析。差异表达蛋白分子见图8，其中差异超过2倍以上的见表4。其GO功能富集分析显示 主要同翻译因子活性和核酸连接有关，Pathway富集分析显示主要同丙酮酸盐代谢有关。
表4褪色沙雷菌LCT-SM166的差异蛋白质分子(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)
| 基因ID | 长度(aa) | 上调/下调 | 注释库ID |
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关于保藏的LCT-SM166菌株的说明
A.菌种的保藏单位名称和地址
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
B.交机构保藏的日期
2012年9月5日
C.保藏机构给予的保藏号
CGMCC No.6528
D.分类命名
粘质沙雷氏菌Serratia marcescens
Claims (1)
1.一种太空环境下的褪色沙雷菌（Serratia marcescens）LCT-SM166菌株，其保藏号为：CGMCC NO：6528，其特征在于：革兰氏染色阴性，形态呈杆状、单个、无芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性无明显变化；生长速度的差异从生长曲线看不明显；同地面株均无溶血反应；Biolog反应板生化特征结果显示同地面株比较可以利用D-棉籽糖。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201210379818.XA CN103184176B (zh) | 2012-09-26 | 2012-09-26 | 一株太空环境下的褪色沙雷菌lct-sm166菌株 |
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2012
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 空间环境对13株微生物生物学特性的影响;谢琼等;《中华医院感染学杂志》;20041130;第14卷(第11期);全文 * |
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|---|---|
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